이 프로토콜은 패치 클램프 기술이 미토콘드리아 내부 막을 가로 지르는 미토콘드리아 양성자 누출을 직접 측정하여 미토콘드리아의 열원성 능력을 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 설명합니다. 내부 미토콘드리아 막을 통한 양성자 전류의 직접 측정은 미토콘드리아 열발생을 담당하는 분자 메커니즘을 식별하고 정확하게 특성화하는 데 도움이됩니다. 이 기술은 미토콘드리아 내부 막을 가로 지르는 양성자 전류를 측정 할뿐만 아니라 칼슘 또는 아데닌 뉴클레오티드와 같은 대사 산물과 같은 미토콘드리아 기능에 중요한 다른 전도도를 연구 할 수있게합니다.
안락사 된 마우스를 등에 놓고 알코올을 뿌려 머리카락을 닦고 적시십시오. 그런 다음 흉부를 두 센티미터 절개하십시오. 핀셋으로 피부를 움켜 잡은 후 동물의 가슴에서 심장을 해부하고 헹구어 모든 혈액을 5 밀리리터의 차가운 격리 용액이있는 10 밀리리터 비커에 넣으십시오.
심장이 혈액의 흔적을 제거하면 다섯 밀리리터의 차가운 격리 버퍼가 들어있는 다른 10 밀리리터 비커로 옮겨 얇은 조각으로 자릅니다. 그런 다음 얼음으로 식힌 10 밀리리터 유리 균질 기로 옮깁니다. 오버헤드 교반기를 사용하여 분당 275회 회전의 제어된 속도로 여섯 번의 부드러운 스트로크로 얼음 위에 미리 절단된 조직을 균질화합니다.
균질액을 15밀리리터 얼음처럼 차가운 원뿔형 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 700배 G에서 원심분리하여 핵과 깨지지 않은 세포를 펠릿화한다. 상층액을 신선한 15 밀리리터 튜브에 모아 얼음 위에 놓습니다. 상층액을 섭씨 4도에서 10분 동안 8, 500배 G에서 원심분리하여 미토콘드리아를 함유하는 펠렛을 얻었다.
미토콘드리아 펠렛을 3.8 밀리리터의 얼음처럼 차가운 고장성 만니톨 완충액에 재현탁시키고 미토콘드리아 현탁액을 얼음 상에서 10 내지 15분 동안 인큐베이션한다. 미토콘드리아 고장성 만니톨 현탁액을 프랑스 프레스의 냉장 미니압력 셀에 채운다. 그런 다음 셀을 프랑스 프레스에 놓습니다.
그런 다음, 프렌치 프레스의 로우 모드를 선택하고 갈색 지방 미토콘드리아에 대한 다이얼의 110에서 미니 압력 셀을 통해 서스펜션을 압축하고, 심장 미토콘드리아에 대해 140에서 서스펜션이 초당 약 1 방울의 속도로 미니 압력 셀에서 나오도록 보장하십시오. 방울을 15 밀리리터의 얼음으로 식힌 원뿔형 튜브에 모으십시오. 현탁액을 섭씨 4도에서 10분 동안 10, 500배 G에서 원심분리한다.
미토플라스트 펠렛을 0.5 ~ 2 밀리리터의 얼음처럼 차가운 고장성 염화칼륨 완충액에 재현탁시키고 현탁액을 얼음 위에 저장한다. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 녹화 당일 붕규산 유리 필라멘트를 당겨 재현성이 높은 피펫을 생성하는 데 사용되는 풀러에 프로그램을 설정하십시오. 풀러 내에 하나의 유리 필라멘트를 넣고 당겨서 하나의 붕규산염 필라멘트에서 거의 두 개의 동일한 패치 피펫을 얻습니다.
피펫이 풀러의 가열 상자 필라멘트의 노화로 인해 당기는 사이클 사이에 일치하지 않을 때 프로그램을 조정하십시오. 피펫 폴리셔 내부에 피펫을 놓고 팁을 필라멘트 근처에 100X 배율로 배치하여 불을 닦으십시오. 발 페달을 여러 번 눌러 팁 곡선을 막히거나 손상시키지 않고 필라멘트를 가열하십시오.
피펫이 25 내지 35 메가옴 사이의 저항을 가질 때까지 광택은 TMA 기반 피펫 용액으로 충전될 때 얻어진다. 미토플라스트 부착을 줄이기 위해 0.1% 젤라틴으로 커버 슬립을 사전 인큐베이션하고 미토플라스트 현탁액을 증착하기 전에 염화칼륨 욕조 용액으로 헹구십시오. 약 35 마이크로리터의 농축된 미토플라스트 현탁액을 500 마이크로리터의 염화칼륨 욕조 용액과 혼합하여 원료 희석물을 준비하고, 이를 네 웰 플레이트의 웰에 이전에 놓인 커버 슬립 상에 놓는다.
미토플라스트가 커버 슬립 아래로 침전될 수 있도록 얼음 위에서 15-20분 동안 배양한다. 약 50 마이크로 리터의 염화칼륨 욕조 용액으로 욕조 챔버를 완전히 채우고 구부러진 팁이있는 얇은 미세 해부 핀셋을 사용하여 챔버 내의 미토플라스트로 커버 슬립을 옮깁니다. 커버 슬립을 챔버에 관류시키지 않고 챔버 바닥에 배치하여 커버 슬립에서 미토플라스트를 안정적으로 유지하십시오.
현미경 아래에서 커버 슬립을 60X 목표로 스캔하여 개별 비접착성 미토플라스트를 선택하십시오. 피펫 용액으로 피펫을로드하고 피펫 홀더에 넣으십시오. 미세 조작기를 사용하여 피펫을 욕조 용액으로 가져 와서 선택한 미토플라스트 바로 위로 이동하여 IMM에 가까이 가십시오.
멤브레인 전위를 0밀리볼트로 유지하고 증폭기 프로그램의 멤브레인 테스트 명령을 사용하여 10밀리볼트 펄스를 인가합니다. 약간의 음압을 가하여 IMM으로 기가살을 빠르게 만듭니다. 미토플라스트가 부착된 피펫을 들어 올려 커버 슬립으로부터 멀리 떨어뜨려 실험 중 피펫 드리프트로 인한 씰 파손을 방지합니다.
전체 미토플라스트 구성을 테스트하기 전에 증폭기 프로그램에서 멤브레인 테스트 명령으로 이탈 정전 용량 과도 상태를 보상하여 침입 후 미토플라스트 멤브레인에 대한 정확한 정전용량 측정을 얻습니다. 증폭기 프로그램에 짧은 지속 시간 전압 펄스를 적용하여 유리 피펫 아래에서 멤브레인 패치를 파열시키고 전체 미토플라스트 구성을 달성하십시오. 침입 후 정전 용량 과도 상태를 증폭기 프로그램의 멤브레인 테스트 옵션에 맞게 조정하여 멤브레인 정전 용량과 액세스 저항을 평가합니다.
침입 직후, 관류를 통해 염화칼륨 목욕 용액을 HEPES 목욕 용액으로 교체하십시오. 증폭기 프로그램에 850밀리초 램프 프로토콜을 적용합니다. 전압 램프 프로토콜의 적용은 UCPs의 필수 활성화제인 외인성 지방산의 첨가 없이 갈색 지방의 IMM을 가로질러 큰 진폭 양성자 전류를 유도한다.
내인성 막 지방산 추출을 위해 UCP1 억제제 구아노신 디포스페이트 또는 10-밀리몰 메틸베타 시클로덱스트린에 의한 관류 후, 잔류 전류는 UCP1 결핍 마우스의 IMM에서 완전히 사라지는 UCP1 전류의 진폭을 결정하기 위해 사용된다. 갈색 지방과는 달리, 골격근 및 심장과 같은 비 지방 조직의 IMM은 침입 직후에 측정 가능한 양성자 전류를 발생시키지 않습니다. AAC를 통해 측정 가능한 양성자 전류를 유도하기 위해서는 외인성 지방산의 일에서 두 마이크로 몰을 포함하는 HEPES 배쓰 용액을 적용하는 것이 필수적입니다.
측정된 양성자 전류가 AAC에 의해 운반된다는 것을 확인하기 위해, AAC1 결핍 마우스의 IMM에 나타난 양성자 전류를 거의 완전히 억제하는 특정 억제제인 카르복시아트랙틸로시드를 적용하는 것이 중요하다. 양성자 누출의 일정하지만 결코 완전한 억제는 ADP가 AAC를 통한 활성 뉴클레오티드 교환을 생성하기 위해 막의 양쪽에 존재할 때만 달성된다. 미토플라스트 준비의 품질은 전체 미토플라스트 구성을 달성하는 데 성공률에 영향을 미칩니다.
최적화하는 것이 필수적입니다. 일단 미토콘드리아 열발생의 분자 메커니즘이 패치 클램프 기술로 해부되면, 미토콘드리아 산소 소비의 측정은 무손상 미토콘드리아에서 양성자 전류 및 열발생의 중요성을 입증할 것이다. 이 기술은 연구자가 미토콘드리아의 기능에 중요한 모든 종류의 전도성, 이온 및 대사 산물을 탐구 할 수있는 길을 열어줍니다.
