이 단어는 마우스 골격근에서 미토콘드리아를 처리 할 때 호흡 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 정제 시간을 상당히 줄이고 여러 샘플을 동시에 처리 할 수 있습니다. 유나이티드 배경의 여덟 성별의 동물로부터의 미토콘드리아는 이 프로토콜을 사용하여 절단될 수 있어 매우 다양한 실험 조건에서 호흡에 대한 연구가 가능하다.
이 방법은 노화, 약물 검사, 암 또는 발달을 포함하여 미토콘드리아 기능이 관련된 모든 연구 분야에 적합합니다. 그것은 심지어 다른 조직과 유기체에도 적응할 수 있습니다. 미토콘드리아를 손상으로부터 보호하기 위해 절차 중에 얼음 위에 모든 것을 올려 모든 물질이 차가워 지도록하십시오.
얼음 위에 시료 당 3 개의 50 밀리리터 비커를 놓고 비커 하나에 PBS 10 밀리리터, 비커 두 개에 10 밀리리터의 10 밀리리터 EDTA PBS, 비커 3에 네 밀리리터 IB1을 첨가하십시오. 안락사 된 마우스의 오른쪽 뒷다리에 모피가 흘리는 것을 방지하기 위해 70 % 에탄올을 뿌리고 사지를 코르크 해부 보드에 테이프로 붙인 다음 왼쪽 앞다리를 테이프로 붙입니다. 무릎에서 발끝까지 피부를 통해 멸균 된 일회용 메스로 절개하십시오.
발목 높이에서 이빨이 달린 포셉으로 피부를 잡고 발목 주위에 미세한 가위로 자릅니다. 한 손에는 미세한 팁 핀셋으로 피부를 기저 근육에서 떼어 내고 다른 손에는 이빨이 달린 포셉으로 잡아 당깁니다. 발목에서 무릎까지 모든 골격근을 해부하고 미세한 핀셋과 가위를 사용하여 경골 전방 근육의 모든 결합 조직을 제거하십시오.
신근 디지토럼 롱 근육의 네 개의 원위 힘줄을 찾아 발가락에 삽입하는 것에 가깝게 단면화하십시오. 경골 전방 원위 힘줄을 찾아 발목 아래에 삽입 할 수 있도록 자릅니다. 경골 전방 및 신근 디지토럼 롱 힘줄을 발목 위로 당겨 느슨한 끝을 해방시킵니다.
힘줄의 느슨한 끝을 잡고 뼈의 나머지 근육 구조에서 근육을 위로 당겨서 근육을 완화시킵니다. 이 근육의 근위 힘줄을 무릎 뚜껑에 최대한 가깝게 자르십시오. 마우스를 거꾸로 뒤집어 위장관 및 발바닥 근육 추출을 진행하십시오.
이두근, 대퇴골 및 위장관 사이에 형성된 주머니를 잡고 미세한 가위를 사용하여 근위 위장관 힘줄을 시각화하기 위해이 근육을 분리하십시오. 미세한 가위로 원위 아킬레스 건을 잡고 조심스럽게 자릅니다. 근위 위장관 힘줄을 자르고 밑창으로 풀어줍니다.
조심스럽게 남아있는 근육을 해부하고 초기 위치에 마우스를 다시 고정하여 대퇴사두근을 해부하십시오. 지방 조직을 버리고 대퇴사두근과 대퇴골 사이에 미세한 핀셋을 삽입하여 뼈에서 근육을 분리하십시오. 원위 대퇴사두근 근육 힘줄을 잡고 힘줄을 무릎 뚜껑에 최대한 가깝게 자릅니다.
대퇴사두근을 위로 당기고 근위 삽입시 미세한 가위로 그들을 해방시킵니다. 왼쪽 뒷다리에 대해서도 똑같이 반복하십시오. 모든 근육을 비커에 헹구고 두 개, 비커 세 개를 헹구십시오.
마지막으로, 얼음 위에 날카로운 가위로 비커 세 개의 모든 근육을 다듬으십시오. 현탁액을 C 튜브로 옮기고 단단히 닫은 다음 균질 화기의 슬리브에 거꾸로 부착하십시오. 균질액을 2 밀리리터의 미리 냉각된 마이크로 원심분리 튜브 2개로 나누고 10분 동안 원심분리한다.
그런 다음 상청액을 새로운 미리 냉각 된 튜브로 옮기고 또 다른 10 분 동안 원심 분리하십시오. 펠렛을 500 마이크로리터의 IB2에 결합하고 상층액을 새로운 2 밀리리터 미리 냉각된 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 상청액 번호 2 또는 SN2로 라벨링한다. 최종 미토콘드리아 펠렛을 200 마이크로리터의 재현탁 완충액에 재현탁시킨다.
단백질 정량화를 위해 신속하게 10 마이크로리터를 따로 떼어놓고 손상을 방지하기 위해 나머지 미토콘드리아 현탁액에 10%FFA BSA 10 마이크로리터를 즉시 첨가하십시오. 농축된 미토콘드리아 현탁액을 섭씨 4도에서 10분 동안 10, 500배 G에서 원심분리한다. 미토콘드리아 펠릿을 100 마이크로리터의 1X 커플링 분석 배지에 BSA, 1X 전자유동 분석 배지와 BSA, 또는 1X 베타 산화 배지를 BSA로 재현탁하여 수행될 수 있다.
이 농축된 미토콘드리아 샘플을 상응하는 분석 배지를 사용하여 마이크로리터 당 0.2 마이크로그램으로 희석한다. 웰당 현탁액 50 마이크로리터를 얼음 위에 미리 냉각된 24 웰 마이크로플레이트에 시드한다. 배경 보정 웰에서, 상응하는 분석 배지만을 첨가한다.
나머지 미토콘드리아 현탁액을 영하 80도에 보관하여 단편화 순도를 결정하십시오. 마이크로플레이트를 20분 동안 미리 냉각된 분취용 원심분리기에 스핀핑한다. 그 동안 나머지 분석 배지를 섭씨 37도로 가온합니다.
원심분리 후, 마이크로플레이트를 다섯 분 동안 벤치에 두어 평형화시킨다. 미토콘드리아의 분리를 피하기 위해 웰 당 450 마이크로리터의 따뜻한 분석 배지를 천천히 조심스럽게 첨가하십시오. 마이크로 플레이트를 뚜껑 없이 산소 소비량 측정기에 즉시 놓고 측정 프로그램을 시작하십시오.
첫 번째 단계는 마이크로 플레이트가 예열될 수 있도록 10분 인큐베이션인지 확인하십시오. 실험이 완료되면 카트리지와 마이크로 플레이트를 제거하고 기기를 끄고 분석을 시작합니다. 연속 원심분리를 통해 수득된 상이한 분획으로부터의 일반적인 단백질 프로파일은 단리된 분획에서 뚜렷한 단백질 집단을 나타내었다.
모든 미토콘드리아 함량의 존재는 외부 및 내부 미토콘드리아 막 및 핵형 관련 단백질의 마커에 대한 강한 신호에 의해 명백하다. 분획 N은 핵 및 파괴되지 않은 물질을 나타낸다. SN1 또는 SN2 분획 내의 대부분의 소포체, 원형질막 또는 세포질 마커는 단리시 수득된 고순도를 강조한다.
결합 및 베타 산화 분석에서 ADP 첨가 후 산소 소비의 증가가 관찰되었다. 카르보닐 시아나이드-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존 첨가 후, 산소 소비는 최고 수준에 도달하였다. 낮은 호흡 조절 비율은 고립 된 미토콘드리아의 무결성을 보장합니다.
전자 유동 분석은 특정 기질 및 억제제의 주입을 통해 개별적으로 또는 조합하여 전자 수송 사슬 복합체의 활성을 조사하였다. 미토콘드리아를 격리하는 것은 매우 민감합니다. 따라서 조직 완화 후 모든 단계는 생존력을 보존하기 위해 부지런하고 신중하게 수행되어야합니다.
실험 분석은 주요 미토콘드리아 분자의 결정론적 혈청 분석 또는 청색 천연 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용한 호흡 복합체의 조립 연구로 보완될 수 있다.
