우리는 NIBIB, NIH의 교내 연구 프로그램에 의해 연구 지원을 인정합니다.

샘플 셀 조립 및 토크 <ol><li> 우리는 함께이 창 어셈블리를 넣어 샘플 셀 건설을 시작합니다. 창 홀더에 창문 가스켓를 놓습니다. 위치는 라이너의 개통은 소유자의 키웨이 반대 창 홀더 내부 창 라이너 (또는 그것이 때때로 윈도우 쿠션라고)되도록. 약간 각도에서 창의 소유자의 주요 방법으로 윈도우에있는 학자 표시를 정렬 홀더에 창을 놓습니다. 창의 양쪽에 매우 가장자리에 가볍게 아래로 누르십시오. </li><li> 적절한 씰링 및 샘플 세포의 정확한 토크를 보장하기 위해 가볍게 코트 Spinkote 윤활제와 주택 가스켓과 나사 링. 당신의 엄지와 집게손가락 사이 Spinkote의 매우 작은 금액을 확산. Spinkote의 얇은 필름으로 보이지 않는 문장 나사​​ 링 스레드를. 마찬가지로, 코트 주택 개스. 모든 보이는 윤활유를 닦아주십시오. </li><li> 주택 키를 키웨이를 정렬하여 세포 주택에, 당신쪽으로 향하게 창문으로 하나의 창에서 어셈블리를 슬라이딩하여 샘플 셀 조립을 시작합니다. 주택 키를 사용하여 중앙의 키웨이 정렬하고 부드럽게 세포 내부의 윈도우 어셈블리의 상단에 가을 보자. </li><li> 셀 주택에 중심을 밀어 도구의 어떤 종류를 사용하지 마십시오. 이것은 실험 중에 누출에 발생하는 CP에 영구적인 손상을 일으킬 수 있습니다. 창이 멀리에서 중심을 향해 마주되도록 두 번째 윈도우 어셈블리를 턴, 주택 열쇠 키웨이 정렬과 중심 위에 내려 슬라이드. 위에 주택 개스 플레이스, 다음, 나사 링 단어 &quot;아웃&quot;이 표시되도록. 손가락과 정렬 도구를 사용하여 손으로 나사 반지를 조입니다. CP는 주택 배럴에 쉽게 슬라이드하지 않는 경우, 먼저 정렬하고, 그 위에 두 번째 창에서 어셈블리를 놓으십시오. 윈도우 어셈블리에 완만한 하향 압력을 적용하여, 동시에 세포 주택에 모두 밀어. 이 방법, 우리는 CP에 직접 눌러 마십시오. 지금은 먼지, 보풀 및 지문에 대한 세포 속을 살펴볼 수있는 좋은 시간입니다. 당신은 또한 CP와 Windows 사이에 공기가 여전히 나타냅니다 뉴턴의 반지를 통지합니다. 이것은 토크를 적용한 후에 사라집니다. </li><li> 나사 링 위 표시 &quot;아웃&quot;이라는 단어와 함께, 토크 스탠드의 세포 토크 콜레 내부의 샘플 세포에게 모든 방법을 내려 놓으십시오. 토크 스탠드 손잡이에 지속적인 압력을 적용하여 장소에 세포를 잡아. 하나의 연속 동작에서 - 파운드에 120-140 사이에 나사 고리를 조이십시오. 조정 마이크로 미터의 토크 렌치를 사용하는 경우 / 파운드에 120-140 사이로 설정하고 설정 토크 렌치를 나타내는 &quot;클릭&quot;에 도달했습니다 때까지 나사 반지를 조입니다. 토크 스탠드 핸들을 해제하고 조심스럽게 창문을 건드리지 않고도 샘플 세포를 제거합니다. </li></ol> 샘플 셀을 로딩 및 씰링 <ol start="6"><li> 침강 속도 실험을 위해, 우리는 정기적으로 200ul의 피펫을 사용하여 12mm 중심의 각 분야에 400ul의 볼륨을로드합니다. 상단과 눈에 보이는 나사 링에있는 단어 &quot;아웃&quot;에 로딩 구멍 샘플 세포를 놓습니다. 로딩 구멍 왼쪽 중심 부문에 피펫 팁 절반 방법을 아래로 슬라이드 천천히 참조 솔루션의 200ul를 분배. 400ul를 총 한 번 반복합니다. 같은 피펫 팁과 같은 기술을 사용하여 조심스럽게 천천히 샘플 솔루션의 400ul과 올바른 중심 섹터를 입력하십시오. 150-180 UL의 볼륨이 침강 평형 실험에 사용되지만 동일한 관리 및 기술을 따라야한다. 그것은 가능한 한 가깝게으로 레퍼런스와 샘플 솔루션의 볼륨을 일치하는 필수적입니다. 로딩 거품을 피하고 두 솔루션 가능한 동급생으로 볼륨을 유지의 모든 지원에 대해 동일한 피펫 팁을 사용하여 천천히 솔루션을 로딩하고 분배, 단단히 피펫에 피펫 팁을 피팅. </li><li> 그들은 중앙 조각과 알루미늄 하우징 사이에 위치하고 있는지하고 각각의 로딩이 구멍에 snugly 2 개의 신규 주택 빨간색 플러그 가스켓을 배치하여 세포를 밀봉합니다. 주택 플러그 각각 커버. 손이 작은 납작 머리 드라이버로 조입니다. </li></ol> 로터의 샘플 셀 정렬 <ol start="8"><li> 회전자를로드하기 전에 균형을 맞출 그 샘플 세포 누출 사건의 반대 위치에 샘플 세포보다 더 이상 0.5 이상의 g 가벼운 있는지 확인하십시오. 제로의 밸런스와 함께 시작합니다. 먼저 CB 반대 위치에있을 것이다 샘플 세포를 달다. 샘플 셀 무게를 뺄 테어 잔액은 다음 CB를 달다. 추가하거나 균형을 맞출의 부착 구멍에서 무게를 빼야. 중량은 위로부터 내다하지 않도록합니다. 균형을 맞출 최종 무게는 0.5 g 내에서 반대 샘플 세포보다 가볍고 수 있도록 Reweigh. </li><li> 4 자리 로터를 사용하여 흰색 화살표가 표시되도록 게재 순위가 4로 균형을 맞출을 배치하고 t에 포인팅원심력의 그 방향. 그것은 회전자 내부에 내려가 있는지 확인하십시오. 반대 급부가 단단히 자리 때까지 부드럽게 그냥 흰색 화살표 건너편 균형을 맞출 상단에있는 설정 나사를, 고정하지만, 정렬 아직도 수 있습니다. 주택과 균형 샘플 셀 위치를 회전자의 중심 보이는 나사 링에있는 단어 &quot;아웃&quot;을 직면 플러그. </li><li> 회전자 수렁에서 찾고, 정렬 도구를 사용하여 균형을 맞출에있는 학자 표시가있는 내부 학자 표시를 (회전자의 중심에 가장 가까운 마르크) 맞춥니다. 장소에 정렬 보상을 잠글 수있는 설정 나사를 조이십시오. 동일한 방식으로, 회전자의 위치 2 내부 학자 마크와 함께 샘플 세포 학자 표시를 맞춥니다. </li></ol> 자세한 내용은 참조를위한 <a href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx</a>

<ol>
	<li>Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+protein-protein+interactions+by+sedimentation+velocity+analytical+ultracentrifugation.">Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).</li><li>Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions+by+equilibrium+sedimentation.">Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).</li><li>. Home - Workshops [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx</a></li></ol>

회전자에 적절한 셀 조립, 샘플 삽입하고, 셀 정렬 높은 품질의 AUC 실험을위한 중요합니다. 이것은 macromolecular의 침강 프로필에서 취득한 데이터의 매우 상세한 분석을 필요로 실험을 위해, 특히 사실입니다, 예를 들어, 단백질 상호 작용을 공부하고 추적 집계 금액을 결정할 때. 종종 실험 설정의 품질은 AUC 연구에서 결과의 정확성을 위해 제한됩니다. 3 - 실용적인 디자인과 AUC 실험의 자세한 실행에 대한 자세한 내용은 참조 1 참조하십시오. AUC 실험의 실용적인 설정, 이론, 및 데이터 분석을 다루는 워크숍은 국립 보건원에서 우리 실험실에서 회 개최되고있다 [4].

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4-place Ti analytical rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361964</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torque stand assembly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361318</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell alignment tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinkote Lubricant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Counterbalance</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>360219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Housing kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>334602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window liner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362329</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, sapphire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>307177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, quartz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>301730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>305037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12mm double sector Epon centerpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell plug gaskets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell housing plug	</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362327</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell

분석 초원 심 분리기 (AUC)은 우리 고속 원심 분리하는 동안 macromolecular의 침강 프로필을 기록 수있는 강력한 biophysical 도구입니다. 적절하게 계획하고 실행하면, AUC의 침강 속도 또는 침강 평형 실험은 크기와 모양에 관해서는 단백질, 샘플 순도, 침강 계수, oligomerization 상태 및 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 상당한 정보를 공개하실 수 있습니다. 이 기술은, 그러나, 기술주의의 엄격한 수준이 필요합니다. 샘플 세포는 두 윈도우 사이에 끼워 넣으면 어셈블리 sectored 센터 기사를 개최. 그들은 / 파운드에서 약 12​​0-140의 토크 압력과 봉쇄하고 있습니다. 속도로 회전하는 동안 광학 탐지 시스템은 각 핵심 분야를 통해 동일한 요골 경로 정중선의 샘플 및 참조 버퍼를 모두 스캔 수 있도록 참조 버퍼와 샘플은 중심 부문으로 로드된 후 실링 후, 세포가 정확하게 티타늄 회전자로 정렬됩니다 최대 60, 000 RPM 매우 높은 진공 하에서으로 뿐만 아니라 적절한 샘플 셀 조립 중요한 건, 샘플 전지 구성 요소는 매우 고가이며 또한 그들이 실험 도중에 누수 및 파손을 방지하기 위해 최적의 작업 상태로되도록하는 제대로 든다고해야합니다. 심지어 사소한 균열이나 흠집이 원심 분리기의 파손을 초래할 수있는 경우, 신중하게 창문을 처리합니다. 중심과 Windows 사이의 접촉은 가능한 한 꼭해야합니다, 토크 압력이 적용 후 즉 노 뉴턴의 고리가 표시됩니다. 먼지, 보풀, 긁힘 및 Windows 또는 중심 모든 손상이 연락도에 오일이 매우 쉽게 한 부문에서 다른 솔루션의 누수 또는 모두 함께 중심 밖으로 유출로 이어질 수 있습니다. 귀중한 샘플 실험 기간 동안 솔루션의 누출, 손실 종종 깨진 유리창과 중앙에 이르게 세포에서 압력의 불균형을 초래하게됩니다뿐만 아니라. 또한, 플러그 가스켓 및 주택 플러그는 원심 챔버에서 높은 진공으로 로딩 구멍 중심 부문에서 철수하고 솔루션을 피하기 위해 장소에 안전해야합니다. 윈도우 라이너와 가스켓은 운동이 깨진 유리창의 결과로 발생할 수 휴식과 균열 무료로해야합니다. 이 동영상이 샘플 셀 조립 우리의 절차를 선보일 예정, 도움 토크, 하중 및 로터 정렬 완벽한 AUC 실험 도중 구성 요소 손상, 누설 솔루션 및 파손을 최소화.

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Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

분석 초원 심 분리기 (AUC)은 샘플 셀이 샘플과 참조 버퍼와 실험을하는 동안을 보유하고 있으며 고진공 및 60,000 RPM으로 로터 속도 최대 노출됩니다. 이 동영상은 AUC 실험이 매우 중요한 구성 요소의 조립, 로딩 및 정렬에 필요한 세부 사항에 대한 엄격한 관심을 입증합니다.

조립, 로딩 및 분석 초원 심 분리기 샘플 셀 정렬

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

assembly-loading-alignment-an-analytical-ultracentrifuge-sample

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K 조회수.  Dynamics of Macromolecular Assembly, Laboratory of Bioengineering and Physical Science. 분석 초원 심 분리기 (AUC)은 샘플 셀이 샘플과 참조 버퍼와 실험을하는 동안을 보유하고 있으며 고진공 및 60,000 RPM으로 로터 속도 최대 노출됩니다. 이 동영상은 AUC 실험이 매우 중요한 구성 요소의 조립, 로딩 및 정렬에 필요한 세부 사항에 대한 엄격한 관심을 입증합니다.

비디오: Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

주최자 및 동물 폴 Explants Xenopus laevis의 태아로부터 세포 접착 분석의 총회의 해부

연구

생물학

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Fractionated Xenopus 에그 추출물을 사용하여 체외 핵 어셈블리

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

조립, 조정 및 단백질 이미징을위한 Apertureless 니어 필드 적외선 분광 현미경의 사용

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

최적화 STORM 슈퍼 해상도 현미경에 대한 테스트 샘플

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

플라스미드 벡터를 생성 깁슨 어셈블리를 사용하여 인간의 신장 요인-1α의 발기인의 규정에 따라 FLAG-태그 단백질을 표현

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Stomata 테이프-껍질: 가드 셀 샘플 준비에 대 한 개선된 방법

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

셀룰러 생존력을 보존하는 마법의 각도 회전 핵 자기 공명 분광기에 극저온 샘플 로딩

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...