Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

인스 트루먼 트와 일 솔루션 1. 준비 <ol><li> 물고기 물 솔루션을 준비합니다. 증류수 50ml에 바다 염 인스턴트 오션 &#39;2g을 용해시켜 스톡 용액을 만든다. 물고기 물 (60 ㎍ / ㎖의 바다 소금 최종 농도)를 사용할 준비가 준비하는 1 L의 증류수에 주식 물고기 물 1.5 ML을 추가합니다. 사용하기 전에 물고기의 물을 사용할 준비를 압력솥. 이 용액을 제브라 피쉬 배아 매체로서 사용된다. </li><li> 배아 설치에 대한 메틸 셀룰로오스를 준비합니다. 멸균 물고기 물 50 ㎖에 메틸 1.5 g을 녹여. 저어 접시에 자석을 사용하여 용해를 촉진한다. 분말의 완전 용해 몇 시간이 필요할 수 있습니다. 작은 튜브에 선명도와 나누어지는에 대한 솔루션을 확인합니다. 개월 -20 ° C에서 보관 및 사용에 분주을 해동. 사용하기 전에 5 분 950 XG에 메틸 셀룰로오스를 원심 분리기. 분취 량의 동결 - 해동 사이클을 피하십시오. </li><li> tricaine / 에틸 3 - 아미노 벤조 에이트 (M)의 50 ㎖를 준비100 ml의 물에 tricaine 200mg을 용해 및 트리스 - 염산 1 M (pH가 15)를 사용하여 7.0의 pH를 조정 순서 ethanesulphonate 염 (원액). 더 이상 30 일 이상 4 ° C에서 콘텐츠를 저장합니다. 주의 : tricaine는 독성이다. 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. </li><li> 제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스를 유도 <ol><li> 일반적인 산화 스트레스 유도를위한 산화제 용액을 제조 : H 2 O 2 원액 (과산화수소, 100 ㎜)에 추가하여 산화성 용액 50 ㎖를 확인 물고기의 물을. 2 ㎜, 100 μM 사이의 최종 농도의 H 2 O 2를 사용합니다. 곧 사용하기 전에이 솔루션을 준비합니다. 산화제 용액 전체 마운트 ROS 검출 및 단일 셀 ROS 검출 방법을 모두 적용 할 수있다. 이 솔루션을 저장하지 마십시오. 주의 : H 2 O 2는 위험 및 흡입 유해 삼키면. 가연성 물질과 접촉하면 화재를 일으킬 수 있습니다. 흄 후드를 처리하고 적절한 그럴를 착용ONAL 보호 장비. </li><li> 미토콘드리아 유래 산화 스트레스 유도위한 산화제 용액을 준비한다 : 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 중에서 2 ㎖에 로테 논 3.9 밀리그램을 용해한 산화제 스톡 용액 (5 mm)를 확인. 어두운 용액을 실온에서 보관. <ol><li> 솔루션을 사용하기 준비하기 위해 물고기의 물 10 ㎖에 로테 논 원액을 녹인다. 5-50 μM 사이의 농도에서 로테 논을 사용합니다. 100 μM보다 더 높은 농도에서 로테 논을 사용하지 마십시오. 적절한 농도에서,이 산화제 용액 전체 마운트 ROS 검출 및 단일 셀 ROS 검출 방법을 모두 적용 할 수있다. 주의 : 로테 논은 독성 및 위험합니다. 적절한 예방 조치 문구에 따라 처리합니다. </li></ol></li><li> 유전자에 의해 산화 스트레스를 유도 노크 다운 : 노크 다운 nrf2a 유전자 발현을 제브라 피쉬 배아의 모르 폴리 노의 미세 주입에 의해 이전에 TIMME-Laragy A. 등 2012 년 (38)에 의해보고.. </li><li> OXID를 유도조직 손상 후 스트레스는 ative :. 이전 Niethammer 등 2009 년 (39)에 의해 설명 된대로 72 HPF에서 제브라 피쉬 배아의 꼬리 지느러미에 상처 마진을 생성합니다. </li></ol></li><li> 단일 셀 ROS-검출 방법에 대한 ROS 감지 솔루션의 5 ML을 준비 <ol><li> 작업 솔루션 (: 2.5-10 μM 농도 범위)를 준비하기 위해 HBSS (행크의 균형 소금 솔루션)에서 일반 ROS에 민감한 분자 프로브를 용해 : 일반 ROS의 탐지를위한 솔루션을 제공합니다. 이 솔루션은 바로 사용하기 전에 준비를해야합니다. </li><li> 미토콘드리아에 의해 유도 된 특정 감지 ROS의 해결 방법 : 사용 직전에, DMSO는 5 mM의 원액을 만들고있는 미토콘드리아 ROS 민감한 프로브를 녹입니다. 작동 용액 (: 2.5-10 μM 농도 범위)을 제조하기 위해 HBSS에 원액을 용해. 참고 : ROS 탐지 작업 솔루션의 빛과 산소에 노출과 각각의 원액을 피하십시오. 사용하여 빛으로부터 튜브를 보호알루미늄 호일. 저장 또는 HBSS에 용해 재사용 프로브하지 마십시오. 한 달 동안 -20 ° C에서 주식 솔루션을 저장합니다. 주의 : 적절한 지침에 따라 흄 후드 분자 프로브 및 DMSO를 처리합니다. </li></ol></li><li> 전체 마운트 ROS-검출 방법에 대한 ROS 검출 용액 5 ㎖를 준비 작업 솔루션 (: 2.5-5 μM 농도 범위)를 준비하기 위해 HBSS에 (DMSO에서 안정화) 일반 ROS 민감한 프로브 원액을 녹인다. 빛과 산소에 노출을 피하십시오. 빛으로부터 튜브를 보호합니다. 사용하기 전에이 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션을 저장하거나 다시 사용하지 마십시오. 주의 : 적절한 지침에 따라 흄 후드 분자 프로브를 처리합니다. </li><li> PBS 1X 15 ㎖에 소 태아 혈청 10 ㎖를 추가하여 정지 용액 25 ㎖를 확인합니다. 멸균 솔루션을 유지합니다. 4 ° C에서이 솔루션을 저장 ROS 검출 방법 -이 솔루션은 하나의 세포가 필요합니다. </li><li> 28 &amp;에 제브라 피쉬 공기 배양기를 설정# 176; C. </li><li> 단일 세포 ROS-검출 방법에 대해 4 ° C에서 원심 분리기를 설정합니다. </li></ol> 2. 성인 물고기의 결합 및 제브라 피쉬 배아의 선택 <ol><li> 셋업 성인 zebrafish의 쌍은 표준 프로토콜 (40)에 따라 교차합니다. 특정 실험의 요구에 따라 해당 유전자 변형 라인을 선택합니다. </li><li> 계란을 수집하고 물 물고기 / 배아 매체와 90 mm 접시에 배치합니다. 태아가 개발하고 원하는 발달 단계에 성장할 때까지 28 ° C에서 알을 유지 (예를 들어, 48 HPF, 72 HPF, HPF : 시간 게시물 수정). </li><li> 배아를 개발하기위한 화면입니다. 모든 미 수정 알이나 낙후 된 배아를 제외합니다. </li><li> 50 ㎖ 물고기 물에 tricaine (원액) 1 ㎖를 추가하여 태아를 마취. </li><li> 실체 현미경의 Tg 형광 배아를 선택합니다. </li></ol> 산화제 에이전트와 태아의 3. 치료 <ol><li> 48 시간 사이에 최소 30 배아를 사용PF (72)가 다른 조건 당 HPF. tricaine을 제거하기 위해 신선한 생선의 물로 2 회 배아를 씻으십시오. </li><li> 세 가지 요리에 형광 배아를 분할합니다. 더 이상 30 이상의 태아 / 접시를 넣어. </li><li> 세척 용액을 제거하고, 산화제 용액 10 ㎖ 또는 제어 솔루션으로 물고기의 물 10 ㎖를 추가합니다. </li><li> 28 ℃에서 1 시간 10 분 동안 태아를 품어 잠복기는 특정 조직에 유도되는 산화 스트레스의 수준에 따라 달라집니다. 산화 스트레스에 의해 영향을받는 세포가 점진적으로 세포의 죽음을 받다 짧은 기간은 최고입니다. </li><li> 소용돌이 치는 HBSS 및 세척 배아를 포함하는 새 접시에 배아를 전송. 28 ° C에서 사전 따뜻한 HBSS </li></ol> 4. 전체 마운트 ROS 감지 방법 <ol><li> 산화 처리 후 배아를 수집하고 작은 관에 10 개 이상 배아를 넣어. HBSS에 가능한 한 많이 씻어. 알루미늄 호일을 사용하여 빛을에서 튜브를 보호합니다. </li><li> 에 대한 ROS 감지 솔루션 1 ML을 추가합니다각 관. </li><li> 빛의 노출을 피하기 위해 28 ° C에서 15 분 동안 어둠 속에서 배아를 품어. </li><li> 배양 시간 동안 완전히 배아 분석을 위해 유리 슬라이드를 준비한다. &quot;우울증&quot;유리 슬라이드에 메틸 셀룰로오스의 300 μl를 넣고 피펫 팁으로 유리 표면에 확산. 메틸 셀룰로오스를 해제하는 동안 거품을 피하십시오. </li><li> 배양 시간의 끝에서, 즉 ROS 검출 용액을 제거하고 HBSS 2 ㎖로 두 번 세척 하였다. 튜브를 여러 번 반전 배아를 씻으십시오. 피펫 또는 소용돌이하지 마십시오. </li><li> 최대 유리 파스퇴르 피펫으로 기음 배아. 피펫의 개통 근처 부드럽게 위치 배아는 메틸로를 꺼냅니다. 좋은 나일론 줄을 적절하게 배아를 동쪽을 향하게. </li><li> 처리 된 배아와 제어 배아의 형광을 비교. 모든 배아이를 이용한 영상화되도록 대안 적으로, 형광 실체 현미경 또는 공 초점 현미경의 파라미터를 정돈영상 설정. </li></ol> 5. 하나의 세포 ROS 감지 방법 <ol><li> 3.5 단계에서 시작합니다. 각 조건에 대해 적어도 35 배아를 가지고 있는지 확인합니다. </li><li> 새 접시에 배아를 전송합니다. 물고기 물에게 가능한 한 많이 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 1X 10 ㎖ 및 프로테아제 억제제 칵테일의 400 μl를 추가합니다. 수동 집게와 배아를 d​​echorionate 및 미세 바늘 노른자 자루를 제거합니다. 참고 : 노른자의 자루를 제거하면 다음 FACS 분석을위한 깨끗한 샘플을 보장합니다. 이 단계는 FACS 악기에있어서 피할 수있다. </li><li> 전송 드 노른자위 24 웰 멀티 웰 플레이트에 배아 (15 배아 / 웰)과 모든 물고기의 물을 제거합니다. </li><li> HBSS 300 μL, 30 μL의 콜라게나 제 P, 각 웰에 50 ㎕의 트립신-EDTA를 추가합니다. </li><li> 꽉 피펫 팁 (1,000 μL)으로 부드럽게 피펫 팅에 의해 아래로 배아를 균질화. </li><li> 20 분 동안 28 ° C에서 품어 5 분마다 피펫으로 시료를 균질화. </li><li> 조직 DISR 확인복합 현미경에서 균질의 분취 량을 관찰하여 uption. 피펫 팅하여 단일 세포 현탁액을 용이하게한다. 30 분 동안 배아를 배양하지 마십시오. </li><li> 정지 솔루션 200 μl를 추가하여 반응을 중지합니다. 부드럽게 피펫으로 섞는다. </li><li> 단단한 바닥에 미리 냉각 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지하고 빛의 노출을 피하십시오. </li><li> 4 ° C에서 250 XG에 5 분 동안 원심 분리 </li><li> 부드럽게 피펫 팅에 의해 얼음 차가운 HBSS와 상부 상하고 다시 중단 세포를 제거합니다. </li><li> 세포를 계산하고 당신의 모든 샘플에 동일한 수의 셀이 있는지 확인하십시오. 이하 2 × 10 6 세포를 사용하지 마십시오. </li><li> 4 ° C에서 250 XG에서 5 분 원심 분리기 세포 </li><li> 상층 액을 제거하고 활성 산소에 민감한 프로브를 포함하는 얼음 냉각 HBSS 1 ㎖로 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> 어둠 속에서 3 분간 실온에서 튜브를 배양한다. 산화 스트레스의 레벨에 따라 배양 시간이 다를 t하도록프로브의 고 감도. </li><li> FACS 튜브에 세포를 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지하고 FACS 분석하기 전에 빛의 노출을 피하십시오. </li><li> 형광 활성 세포 분류기 (FACS)으로 세포를 정렬합니다. Tg는 조직의 형광 (예를 들면, GFP) 및 ROS 감지 (예를 들어, 특정 미토콘드리아 ROS 민감한 프로브, 일반 ROS 민감한 프로브)에 사용되는 분자 프로브의 여기 / 발광 스펙트럼에 따라 설정 파장. </li><li> 각 조건을 위해, 동일한 FACS 설정을 적용하여 동일한 실험 세션 내에서 모든 샘플을 측정한다. 다른 생물은 복제의 수단으로 형광 세포의 비율을 계산합니다. 각 조건에 대해 적어도 두 개의 반복을 분석합니다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

중요한 단계 본원에 기재된 제브라 피쉬 배아 산화 스트레스 탐지하는 절차는 두 가지 다른 방법을 포함한다. 단일 셀 ROS 검출 방법 (도 1)보다 구체적인 정량적 측정을 허용하는 동안 전체 마운트 ROS 검출 방법은 주로 ROS 검출을위한 정성 분석이다. 두 가지 방법은 제브라 피쉬 배아에 생체 활성 산소 검출을 평가하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다. 그러?...

산화 스트레스는 특별히 불평형 세포 산화 환원 상태로부터 발생 조건으로 정의된다. 일상적으로 세포 내부에서 발생하는 복잡한 산화 환원 반응은 세포의 산화 환원 상태를 결정합니다. 산화 환원 반응 감소와 분자 (즉, 산화 환원 반응)의 산화를 생산하는 생체 분자의 원자 사이의 전자의 이동에 구성되어있는 모든 화학 반응으로 구성되어 있습니다. 이러한 반응은 극단적 인 구조 불안정과 이웃 생체 분자와 교환 불균형 전자의 자발적인 활성화를 특징으로 전자 활성 종 (즉, 프로 산화 종)에 의해 촉매된다. 이러한 불규칙한 반응은 DNA 손상, 단백질의 카르 복 실화, 지질의 산화로 발생, 결국 세포의 죽음 1로 이어집니다. 산화 스트레스의 증가 수준은 노화와 다른 병적 인 상태 2의 진행과 관련이있다. 산화 스트레스가당뇨병과 심혈관 질환 3,4 혈관 변경에 대한 책임을 져야하는 것으로보고되었습니다. 또한 알츠하이머 병에서 신경 변성에 중요한 역할을하고 파킨슨 병 5. 또한, 산화 스트레스는 암 진행 및 전이성 이벤트 6,7 지배하는 중요한 인자로 입증되었다. 또한, 염증과 면역 반응이 유도 및 추가 지원의 산화 스트레스 8있다. 또는 질소 (RNS, 반응성 질소 종), 살아있는 세포에서 프로 산화 종은 산소 (활성 산소 종 ROS)에서 파생됩니다. (H 2 O 2), 및 과산화수소 - (O 2) ROS는 수퍼 옥사이드 음이온, (. OH) 히드 록실 라디칼을 포함한다. 기본 RNS는 아산화 질소 (NO.)입니다. 이차 반응 종의 일련 betwee 자발적인 상호 작용에 의해 발생 될 수있다N ROS와 RNS 또는 무료 금속은 9 이온. H 2 O 2가 철 2 + 하이드 록실 라디칼을 발생과 반응하면서, - 예를 들면, 수퍼 옥사이드 음이온 peroxynitrate (ONOO)을 형성하는 질소 산화물과 반응한다. ROS와 RNS 인해 여러 가지 생체 분자와 반응 할 수있는 능력으로, 생리적 인 산화 환원 상태 (10)의 유지 보수를 위해 위험한 위협으로 간주됩니다. 유지하기 위해 산화 환원 상태의 세포는 산화를 억제하는 분자와 효소를 해독하는 일련의를 갖추고 있습니다. . 11 - 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 (SOD)는, 카탈라제, 글루타티온 과산화 효소 및 Peroxiredoxins는 기본적으로 H 2 O 2, OH와 오노 등의 프로 산화 종의 세포 보호 기능을 제공하는 항산화 효소 - 아스날을 구성한다. 또한 비타민 C와 E, 폴리 페놀 및 보효소 Q10 (코큐텐)과 같은 항산화 분자는 ROS와 그 위험한 데를 해소하기 위해 매우 중요합니다12, 13 rivatives. 그러나, ROS 및 RNS 또는 항산화 제 시스템 장애의 과잉 생산은 산화 적 스트레스 (14)를 향해 세포 산화 환원 상태를 시프트. 부정적인 의미 외에, ROS는 서로 다른 기원의 세포에서 다양한 생리 학적 역할을 할 수있다. 세포는 일반적으로 같은 숙주 방어와 상처 수리 15-17 정상적인 생물학적 이벤트를 중재하는 분자 신호로 ROS를 생산하고 있습니다. 반응 종은 일반적으로 신호 인자, 성장 인자, 칼슘 레벨 (18, 19)의 세포 내 변동에 대한 응답 등의 NOX (NADPH 산화 효소)와 XO (Xantine 산화 효소)와 같은 세포 내 효소에 의해 세포에서 생성된다. 이것은 ROS가 p53의 그러한 차별적 또는 ATM-키나아제, DNA 손상 반응 (20)의 마스터 레귤레이터 같은 세포 성분으로서 중요한 핵 인자의 활성을 조절 할 수 있다고보고되었다. 유사하게 ROS는 강력하게 일을 매개로 세포 신호 전달에 영향을 미치는전자의 산화 및 신호 전달 (21)의 중요 규제로 설립되는 단백질 티로신 포스파타제 (PTPS)의 불 활성화. 또한, 단백질 체학 기반 방법론은 RNS는 특정 단백질의 수정 및 분자 신호의 변경에 대한 책임이 있음을 보여줍니다. RNS는 S-nitrothiols (SNO)에이를 수정하고 염증 및자가 면역 질환 (22, 23) 등의 병적 상태와 수반하는 분자 경로를 트리거 시스테인 티올 그룹과 반응한다. 세포 배양 실험은 단지 부분적으로 생체 내에서 작용하는 요인 중 다수를 재현하기 때문에, 동물 모델 (24, 25)에 산화 환원 연구를 수행하기 위해 큰 관심이다. 이를 위해 제브라 피쉬는 산화 스트레스 역학 26 공부 적합한 척추 동물 모델로 간주되었다. 제브라 피쉬는 여러 가지 장점이 척추 데브 동안 세포 및 유전 이벤트를 연구하기 위해 부여하는 새 모델 시스템입니다elopment과 질병. 배아의 큰 클러스터는 실험의 요구에 매주 생성 및 사용할 수 있습니다. 또한 제브라 피쉬 배아의 특별한 광학 선명도뿐만 아니라 작은 크기는 전체 생물 27 단일 세포 이미징 및 동적 추적을 할 수 있습니다. 지난 10 년, 제브라 피쉬 돌연변이의 상당수는 암과 유전 질환 28 ~ 31으로 인간의 병적 인 조건을 모델로 생성 된. 가장 중요한 것은, 유전자 변형 라인의 다수는 유전과 생물학적 조작 (32)의 폭 넓은 기회를 제공 할 수 있도록 제작되었습니다. 예를 들어, 유전자 조직 특정 제브라 피쉬 라인은 정기적으로 생체 내 연구에 이용된다. 이 라인은 생체 내에서 단일 세포를 식별 할 수있는 능력뿐만 아니라, 그들이 포함 해부 구조를 제공 선택된 프로모터의 제어하에 형광 단백질을 발현. 여러 독성 연구는 이미 T를 사용했습니다그는 약물 발견 및 산화 스트레스 33-35의 분야에 대한 동물 모델 등이 척추의 적합성을 제안, 산화 환원 항상성에 화학 물질의 생체 내 효과를 평가하기 위해 제브라 피쉬. 약간의 형광 프로브는 제브라 피쉬의 유충 (36, 37)에 산화 스트레스를 모니터링하기 위해 테스트되었습니다 경우에도, 제브라 피쉬의 조직에서 산화 스트레스의 수준과 살아있는 세포를 감지하고 측정 할 수있는 확립 된 시험 법이 없습니다. 여기에서 우리는 제브라 피쉬 배아의 살아있는 세포에 산화 스트레스의 생체 정량화하기위한 절차를 설명합니다. 이미징 도구, FACS 정렬, 형광 프로브 및 프로 산화 조건은 모든 제브라 피쉬 배아 조직에서 검출 및 산화 종의 정량화에 대한 간단한 분석을 생성하기 위해 결합됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1261">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:285px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:528px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">516813</td>
			<td>DO NOT STORE DILUITIONS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture</td>
			<td style="width:147px;">INSTANT OCEAN</td>
			<td style="width:285px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Cgeneric ROS-sensitive probe:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CellROX Deep Red Reagent</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX&#160;</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">M36008</td>
			<td>dissolve one vial with 13&#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydroethidine</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">D23107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">R8875</td>
			<td>Prepare 5mM stock solution in DMSO.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine</td>
			<td style="width:147px;">EnzoLifeScience</td>
			<td>BML-EI395</td>
			<td>dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Propidium Iodide&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">7-aminoactinomycin D (7-AAD)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Nrf2a Morpholino</td>
			<td style="width:147px;">GeneTools</td>
			<td style="width:285px;">5&#39;-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3&#39;</td>
			<td>Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td>11213857001</td>
			<td>Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td>Dissolve one tablet in 1ml of water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">15400-054</td>
			<td>Prepare 1X working solution before usage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Compound microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereo microscope with fluorescent illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:285px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">camera&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">AxioCamMRm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">software for fluorescence image acquisition</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">ZEN 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td style="width:147px;">BD FACSCalibur</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:285px;">5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:147px;">BD</td>
			<td>342065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell Plate&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Sterilized, non treated Petri dishes 90mm</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:285px;">391-1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:285px;">Leica SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of oxidative stress in zebrafish embryos

반응성 산소 종 (ROS)의 높은 수준은 산화 적 스트레스 조건을 향한 세포의 산화 환원 상태의 변화를 유발할 수있다. 이 상황은 분자 (지질, DNA, 단백질)의 산화를 일으키는 원인이되고 세포 죽음에 이르게한다. 산화 스트레스도 영향 당뇨병, 망막 병증, 신경 변성, 암 등 여러 가지 병적 인 상태의 진행. 따라서, 단일 세포 수준에서뿐만 아니라 전체 유기체의 맥락에서뿐만 아니라, 산화 적 스트레스 조건을 조사 할 수있는 도구를 정의하는 것이 중요하다. 여기에서, 우리는 연구를 수행하고 생체 내 산화 스트레스를 측정 할 수있는 프로토콜을 제공하는 생체 시스템의 유용한 제브라 피쉬 배아를 고려합니다. &quot;나는) 산화 스트레스의 질적 측정을 위해&quot;전체 배아 ROS-검출 방법 &quot;및 II) : 형광 ROS 프로브 및 제브라 피쉬의 형질 전환 형광 라인을 활용, 우리는 생체 내에서 산화 스트레스를 측정하는 두 가지 방법을 개발산화 스트레스의 정량적 측정을위한 단일 셀 ROS 검출 방법 &quot;. 여기서, 우리는 산화제 에이전트 및 생리 학적 또는 유전 적 방법으로 조직의 산화 스트레스를 증가시켜 이러한 절차의 효과를 보여줍니다. 이 프로토콜은 앞으로 유전자 스크린에 대한 의무이며 이러한 신경 장애 및 암과 같은 산화 스트레스 관련 병리의 동물 모델에서 ROS의 주소 원인 - 결과 관계를하는 데 도움이됩니다.

여기에 기재된 방법을 적용하여, 우리는 쉽게 측정 할 수 있고, 제브라 피쉬 배아 조직에서 산화 스트레스 (ROS 및 레벨)을 검출한다. 성인 제브라 피쉬를 횡단 한 후, 달걀을 수집하고 72 시간 게시물 수정 (HPF)로 28 ° C에서 개발하기 위해 사용할 수 있습니다. 강한 친 산화제 시약 배아 1) 치료 또는 조직 상해 후에 2) 촉진 ROS 형성 : 산화 스트레스를 유도하기 위해, 우리는 두 가지 방법을 제안한다. <...

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Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

analysis-of-oxidative-stress-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

36.9K 조회수.  University of Torino. Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses. 

비디오: Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

연구

생물학

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebrafish 태아의 대사 프로필 분석

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

반수체 제브라 피쉬 배아의 생산에 의해<em&gt; 체외</em&gt; 시비

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

의 산화 스트레스 저항을 측정<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

전신 산화 스트레스의 간접 측정으로 혜성 분석

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...