저자는 NIH 원장의 새로운 혁신 상 (1DP2 OD006499-01 AA와 1DP2 AJE에 OD006460-01까지)에서 지원하고, 과학 기술 (Nanomedicine의 우수의 UC 샌디에고 센터)의 킹 Abdulaziz시 감사합니다. 우리는 원고에 대한 그녀의 중요한 의견 씨 제시카 무어 감사드립니다.

1. 휘황 레이블 Acryloyl-PEG-RGDS의 합성 <ol><li> 상온에서 아르곤에 따라 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 1.2:1:2 몰 비율에서와 NN diisopropylethylamine (DIPEA) : acryloyl-PEG-succinimidyl 카르복시 메틸 에스테르 (3천4백그램 / 몰 aPEG-SCM, PEG MW)로 RGDS 펩타이드를 반응 하룻밤. </li><li> 비행 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 / 이온화 시간 (든 - TOF) 질량 분광법에 의해 활용을 확인합니다. 든 대상과 드라이에 샘플 명소로 aPEG - RGDS 반응 용액 1 μl를 추가합니다. 유니버설 든 tetrahydrofuran의 매트릭스 (THF) 및 1 분에 소용돌이 포화 용액을 준비합니다. 동일한 샘플 지점이 솔루션의 ~ 1 μl를 추가합니다. 비교를 위해 aPEG-SCM 절차를 반복합니다. 로드 분석 할 수 있습니다. aPEG - RGDS의 분자 무게 aPEG-SCM (그림 2)보다 커야합니다. </li><li> 형광을 결합한하려면 용해 알렉사 형석 350 카르 복실 산 (succinimydyl 에스테르)의 몰 금액을 추가DMSO의 최소 볼륨에서, 1.1에서 aPEG-RGDS 반응 솔루션과 하룻밤 실온에서 아르곤에 따라 반응한다. </li><li> 하루에 적어도 두 번 dialysate 교환, 1,000:1 용적 비율 48 시간에 대해 4 ° C에서 DI-H 2 O에 대해 (MW 3500 다) dialyzing에 의해 aPEG-RGDS-350 정화. </li><li> 정화 Labconco Freezone 플러스 또는 이에 상응하는 동결 건조 시스템에서 aPEG-RGDS을 350 및 -20 ° C.에 상점을 건조 고정 </li></ol> 2. RGDS-350 레이어를 교대로 2D PEG 젤의 2D 몰드와 제작의 작성 <ol><li> 소수성 유리 슬라이드를 준비합니다. 진공 오븐에 유리 그릇에 깨끗한 유리 슬라이드를 놓습니다. 80 열 ° C 30 분에 완전히 표면을 건조합니다. 장소 퓸 후드에 슬라이드를 즐길 수있는 요리와 부드럽게 코트 전체 표면에 30 초에 흔들 각 슬라이드에 250 μl Sigmacote를 추가합니다. 철저히 leas에서의 5 분에 두 번 몸을 담근 채, 증류수에 세척 한 다음, 100 % 메탄올로 코팅 된 슬라이드를 헹굼t 10 ML. </li><li> 10mm 생검으로 주먹을 실리콘 스페이서 (두께 0.8 mm)을 자른다. </li><li> 실리콘 스페이서와 Sigmacote - 처리 유리 슬라이드를 압력솥. </li><li> 혼합 PEG diacrylate (PEGda)에 의해 개별 microfuge 튜브의 각 각 레이어에 대한 솔루션을 공식화 전구체 (최종 농도 15% w / V) 다양한 최종 농도 (예를 들면 40 %를, 얻을 수있는 iodixanol의 다른 양 (물에 60 %의 재고 솔루션)와 30 %, 20 %, 10 %), 인산과 나머지 볼륨을 보충하는 것은 등급 밀도의 솔루션을 얻기 위해 (PBS) 염분 버퍼. 비슷한 방법으로 레이어를 번갈아 가며 들어, iodixanol 및 PBS와 혼합 aPEG-RGDS-350 (최종 농도 8 MM)는 다양한 농도 (예를 들면 35%, 25 %, 15 %) 얻을 수 있습니다. </li><li> 다양한 층 (각 층 솔루션의 ML 당 재고 솔루션의 10 μl)에 대한 각 솔루션에 (2 - 히드 록시 4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone, N-비닐 pyrrolidone의 333mg/ml 주식) photoinitiator을 추가합니다. Photoinitiator 전S는 빛에 민감하므로, 금형의 젤의 레이어링하기 전에 중합을 방지하기 위해 마지막으로 추가되었습니다. </li><li> 이 프로토콜의 후속 단계는 불임을 보장하기 위해 바이오 안전성 캐비닛에서 수행됩니다. </li><li> 멸균 한 ML의 주사기와 0.2 μm 필터를 사용하여 각 솔루션을 필터 소독. 이 Sigmacore - 처리 유리 슬라이드와 그림 1에 묘사 된대로 배치 클램프와 보안 사이의 공백을 sandwiching하여 금형 설정을 조립. </li><li> 적은 고밀도 솔루션 (35 % iodixanol있는 예 aPEG-RGDS-350)에 이어 가장 고밀도 솔루션 (40 % iodixanol있는 예 PEGda) 첫을 추가하여 계층 젤을 던져. 그림 1과 같이 원하는 구성과 밀도의 여러 레이어를 달성하기 위해 다른 레이어링를 반복합니다. </li><li> 휴대용 UVR-9000 램프를 사용하여 3 분에 365 nm의 빛으로 금형을 비추다. polymerized 젤은 5 분 동안 치료 할 수 있습니다. 클램프를 제거하고 부드럽게 상단 유리를 들어슬라이드와 곰팡이, 층상 DGMP의 젤은 슬라이드에 남아있게됩니다. 멸균 주걱을 사용하여 조심스럽게 무균 PBS 또는 세척을위한 문화 매체를 포함하는 50 ML 튜브에 젤을 배치합니다. </li><li> 밀도 수정, photoinitiator 및 unreacted 폴리머를 제거하는 하루에 적어도 두 번 버퍼를 교환, 1,000:1 용적 비율로 PBS에 polymerized 젤을 씻는다. 또한 PBS는 세포의 성장 매체로 교환 할 수 있습니다. PBS 또는 3 단계에서 설명한 세포 배양 실험의 성장 매체에 DGMP 젤을 저장합니다. </li><li> 교대 레이어를 시각화하려면 VersaDoc 젤 문서 단위의 샘플 트레이에 자 함께 DGMP 젤을 (이 젤은 세포 배양에 사용할 수 없습니다) 주선합니다. 350 nm 정도의 젤을 노출, 노출 시간은 형광의 농도에 따라 달라질 수 있습니다. DGMP 히드로 겔에 어두운 파란색 밴드를 교체하는 것은 별개의 화학 성분 (그림 3)의 분리 층의 형성을 보여줍니다. </li></ol><ol><li> RGDS의 펩타이드를 통합 젤 들어, C2C12 myoblasts 등의 접착에 의존 세포를 사용합니다. </li><li> 부드럽게 바이오 안전성 캐비닛에 무균 세포 스크레이퍼를 사용하여 48도 세포 배양 플레이트의 우물에 DGMP 젤을 (PBS에 저장) 삽입합니다. </li><li> 사전 따뜻한 성장 매체 (Dulbecco의 수정 이글 배지 또는 DMEM 10 % V / V 태아 소 혈청과 1% 브이 / v 100x 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션과 보충)과 37 번 설정 물 목욕에 PBS ° C. </li><li> PBS로 C2C12 세포 세 번이나 60 % 합류 플레이트 (10mm)를 씻으십시오. 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML를 추가하고 2 분에 37 ° C에서 잠복기에 의해 PBS와 수확 세포를 대기음. 성장 매체와 카운트 세포에서 세포를 Resuspend. 종자 DGMP 젤이 포함 된 C2C12 myoblasts (20,000 세포 / cm 2)과 잘 세포 배양합니다. 5 % CO 95분의 2 % 상대 습도에서 37 ° C에서 세포를 배양. 주의 4 시간 후 부드럽게 교환 매체를 다시하지 않기가볍게 준수 세포를 이동합니다. </li><li> 24 시간 후, DGMP 젤의 RGDS 함유 층에 C2C12 myoblasts의 첨부 파일은 epifluorescence과 위상 대비 현미경 (Zeiss Axiovert 200)을 통해 확인 할 수 있습니다. </li></ol>

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저자는 공개 할 충돌 관심이 없습니다.

DGMP 비싼 장비에 의존하지 않는 multilayered 젤을 준비하기위한 간단한 전략이다. 이 프로토콜은 이러한 콜라겐과 hyaluronic 산성 등의 biocompatible 재료를 사용하여 공사장 공중 발판을 만들기위한 적응 할 수 있습니다. 층 사이 신호의 혼합 방지하기 위해 Bioactive 작은 분자, 예를 들어 셀이 부착이 - 홍보 RGDS의 펩타이드를 고분자 매트릭스에 닿는 할 수 있습니다. 그들은, 매트릭스 메쉬 크기에 따라, hydrogels ~ 10 무마 적은 경향이 같은 단백질은 화학 결합에 대한 필요없이 개 층에 캡슐화 할 수 있습니다. 여기 iodixanol (Nycoprep), 이전에 생균 응용 프로그램에 사용 된 불활성 밀도 변형을 사용 하였다. 이러한 자당 및 덱스 트로 오스와 같은 다른 밀도 조절도 사용할 수 있습니다. 정착 시간 (t들)을 변화시킴으로써, 하나는 필요에 따라 두 레이어 사이의 인터페이스 (이상 정착 시간이 부드럽게 전환 할 수 있습니다) 과격하거나 날카로운 전환을 생산 조정 할 수 있습니다 &lt;&gt; 10 논의하게 될 것입니다. 예를 들어, DGMP 젤 레이어 사이의 부드러운 전환 효과는 같은 chemotaxis와 같은 세포 과정을 연구 할 수있는 생물학적 신호의 연속 그라디언트를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 겔 강성의 밀도 수정의 효과가 15 % aPEGda 젤에 대한 그림 5에 표시됩니다, PEGda과 iodixanol 농도의 함수로 강성 및 다공성의 더 완전한 특성화 현재 평가되고 있습니다. 이 예에서 PEGda의 농도가 상대적으로 높은 반면, 우리는없는 젤에 비해 30 % iodixanol와 젤에 60 % 더 큰 탄성 계수를 관찰했다. 겔 강성의 변화는 변조 macromer 농도 또는 crosslinking 밀도가 비용을 조정할 수 있습니다. 우리는 또한 polyacrylamide와 PEG의 전구체 (10)을 사용하여 3D multilayered 젤을 만들 수있는 DGMP 기술을 적용했습니다. 농도 또는 성 예비 중합체의 crosslinking의 정도를 변화하는 것은 허용의 구조 변화3D로 양극화 성장 및 마이그레이션과 같은 세포 행동을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다 공사장 공중 발판. 요약, DGMP는 생물 의학 및 기초 연구 응용 프로그램의 광범위한 biocompatible 재료의 다양한 2D 및 3D 공사장 공중 발판을 제조에 적용 할 수있는 적응 기술이다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 및 악기 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 글리콜 succinimydyl 카르복시 메틸 (A-PEG-SCM) </td><td> Laysan </td><td> 120-64 </td></tr><tr><td> Polyethelyene 글리콜 diacrylate (PEGda) </td><td> Dajac 연구소 </td><td> 9359 </td></tr><tr><td> 아르기닌 - 글리신 - 아스파르트 산 - 세린 (RGDS) </td><td> 미국의 펩타이드 </td><td> 49-01-4 </td></tr><tr><td> N, N - Diisopropylethylamine (DIPEA) </td><td> 시그마 </td><td> D125806 </td></tr><tr><td> 디메틸 sulfoxide (DMSO) </td><td> 시그마 </td><td> D2438 </td></tr><tr><td> N, N-dimethylformamide (DMF) </td><td> 어부 </td><td> D119-4 </td></tr><tr><td> Tetrahydrofuran (THF) </td><td> 어부 </td><td> T397 </td></tr><tr><td> 투석 카세트 (3500다) </td><td> 열 과학 </td><td> 66,330 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 350 카르 복실 산 succinimydyl 에스테르 </td><td> 생명 기술 </td><td> A-10168 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> 시그마 </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> 실리콘 스페이서 </td><td> Grainger </td><td> 1MWA4 </td></tr><tr><td> 생검 펀치 </td><td> Acuderm </td><td> P1025 (10 ㎜) P850 (8 ㎜) </td></tr><tr><td> Dulbecco의 인산은 (DPBS) 염분 버퍼 </td><td> Hyclone </td><td> SH30028 </td></tr><tr><td> Iodixanol (NycoPrep) </td><td> 어부 </td><td> NC9388846 </td></tr><tr><td> 2 - 히드 록시 4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone </td><td> 시그마 </td><td> 410896 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM) </td><td> 생명 기술 </td><td> 11,054 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 생명 기술 </td><td> 10,082 </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> 생명 기술 </td><td> 15,140 </td></tr><tr><td> C2C12 myoblasts </td><td> ATCC </td><td> CRL-1772 </td></tr><tr><td> 든 </td><td> Bruker </td><td> N / A </td></tr><tr><td> UVR-9000 </td><td> Bayco </td><td> UVR-9000 </td></tr><tr><td> VersaDoc </td><td> 바이오 RAD </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

density gradient multilayered polymerization (dgmp): a novel technique for creating multi-compartment, customizable scaffolds for tissue engineering

유형 및 생물학적 자극 (예 : 성장 요인 억제제, 작은 분자) 또는 매트릭스 구조의 농도는 (매트릭스의 예 조성, 농도, 또는 강성) 공간을 통해 다양하고있는 복합 조직 문화 매트릭스는 조사의 다양한 사용 것 이 변수는 셀 차별화, 마이그레이션 및 기타 현상에 미치는 영향에 관한. 계층 매트릭스를 생성의 주요 과제는 각 레이어 1에서 개별 구성 요소의 확산없이 레이어 인터페이스의 구조 무결성을 유지하고 있습니다. 이를 위해 현재 방법론은 photopatterning 2-3, 리소그래피 4 연속 functionalization5, 6 건조 동결, microfluidics 7 또는 어떤 많은 복잡한 장비 및 기술 능력을 필요로 원심 분리 8이 포함되어 있습니다. 기타 층 9 박리가 발생할 수 있습니다 개별 레이어의 연속 첨부 파일에 의존 </&gt;를 논의하게 될 것입니다. DGMP는 밀도 10 달러를 변화의 레이어를 만들 수 같은 iodixanol 같은 불활성 밀도 변형을 사용하여 이러한 문제를 극복. 밀도 수정은 어떤 성 예비 중합체 또는 bioactive 분자와 혼합 될 수 있기 때문에, DGMP는 각 비계 층이 사용자 정의 할 수 있습니다. 그들은 수성 유지하면서 단순히 밀도 변형의 농도를 변화하는 것은 인접한 레이어의 혼합 방지 할 수 있습니다. 후속 단일 단계 중합은 각 층은 독특한 화학적, 기계적 성질을 가지고있는 구조적 연속 multilayered 발판에 상승을 제공합니다. 밀도 수정은 쉽게 개별 레이어 또는 구성 요소의 섭동없이 린스 충분한와 함께 제거 할 수 있습니다. 이 기술은 따라서 잘 다양한 크기, 형태, 및 자료의 hydrogels를 만들 적합합니다. 번갈아 가며 층 RGDS-350 통합하는 2D-폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 젤, 제조를위한 프로토콜은 아래 설명되어 있습니다. 우리는 PEG B를 사용이 biocompatible 및 불활성입니다 ecause. RGDS, 세포 접착 펩타이드 11, 생물학적 단서의 공간 제한을 설명하는 데 사용, 그리고 형광 (알렉사 형석 350)의 활용은 우리가 시각적으로 다양한 레이어를 구별 할 수 있습니다. 이 절차는 다른 재료에 적용 할 수 있습니다 (예 : 콜라겐, hyaluronan 등) 10 일부 수정 3D 젤을 제조하도록 확장 할 수 있습니다.

든 - TOF 분석 acryloyl-PEG에 RGDS의 펩타이드 (그림 2)의 결합을 확인합니다. 젤 영상은 photopolymerization (그림 3A) 이후 RGDS-350 (파란색) 레이어를 번갈아 가며 보여준다. 그림 3a에 도시 된 바와 같이, 2D DGMP 젤 크기는 실리콘 금형 (왼쪽 10mm,, 8mm, 오른쪽)의 직경에 따라 다양 할 수 있으며, 따라서 여러 assays에 사용하기 쉽게 사용자 정의 할 수 있습니다 -이 경우에 맞게 48 잘 세포 배양 플레이트 (그림 3B). Epifluorescence과 DGMP 젤을 배양 C2C12 myoblasts의 위상 대비 현미경가 선택적 첨부 파일을 보여줍니다 RGDS-350이 포함 된 셀 접착 펩타이드 (RGDS)의 compartmentalization을 보여주는 PEG 레이어를 (그림 4). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1highres.jpg"/> 1 그림. 분자 무게는든 - TOF는 RGDS의 펩타이드의 결합 후 얻은 aPEG - RGDS에 aPEG-SCM을 비교하여 HT 분석. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2.jpg" alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2highres.jpg"/> 그림 2. DGMP 겔 제조의 개략도. 그라데이션이 층을 한 후에 그들이 photopolymerization 다음 단계적 인터페이스를 만들 시간 기간 (t들) 변화에 정착 할 수 할 수 있습니다. 층상 DGMP의 젤 쉽게 더 사용을위한 금형에서 추출 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50018/50018fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. photopolymerization 후 얻은 A) 2D multilayered 젤은 350 nm의와 마찬가지의 하얀 빛 채널을 사용하여 이미징닥터 겔 문서 단위입니다. 이 이미지는. B) DGMP 젤의 삽입 48도 세포 배양 요리에 흰색으로 RGDS를 포함하는 레이어를 번갈아 가며 나타 그레이 스케일. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 통합 위상 대비, DGMP 젤 (스케일 바 50 μm)에서 성장 C2C12 myoblasts의 epifluorescence 이미지입니다. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 2 NN 힘 트리거 12 이전에 설정 한 방법을 사용하여 가교 PEG 기판의 정적 샘플 겔 표면 탄성에 iodixanol의 효과. 원자 힘 현미경 측정. * P &lt;0.05와 ** P &lt;0.01.

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Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

여기 조직 공학을위한 개 층 사이의 끊임없는 인터페이스와 biocompatible, 다층 매트릭스를 만들기위한 독특한 전략을 설명합니다. 이러한 비계는 다양한 생물학적, 화학적 또는 기계적 신호에 의해 세포 행동을 조절하기 위해 이상적인 사용자 정의 환경을 제공 할 수

밀도 그라데이션 Multilayered 중합 (DGMP) : 멀티 칸 만들기위한 소설 기법, 조직 공학을위한 사용자 정의 공사장 공중 발판

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

12.4K 조회수.  University of California, San Diego. 여기 조직 공학을위한 개 층 사이의 끊임없는 인터페이스와 biocompatible, 다층 매트릭스를 만들기위한 독특한 전략을 설명합니다. 이러한 비계는 다양한 생물학적, 화학적 또는 기계적 신호에 의해 세포 행동을 조절하기 위해 이상적인 사용자 정의 환경을 제공 할 수

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Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

탄성 PGS는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

연구

생체공학

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

다양한 미생물 커뮤니티의 고밀도 배양위한 새로운 생물 반응기

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations at the point of contact. It can be achieved by complementing traditional rigid grippers with soft robotic pneumatic gripper devices. This manuscript describes a rod-based approach that combined both 3D-printing and a modified soft lithography technique to fabricate the soft pneumatic gripper. In brief, the pneumatic featureless mold with chamber component is 3D-printed and the rods were used to create the pneumatic channels that connect to the chamber. This protocol eliminates the risk of channels occluding during the sealing process and the need for external air source or related control circuit. The soft gripper consists of a chamber filled with air, and one or more gripper arms with a pneumatic channel in each arm connected to the chamber. The pneumatic channel is positioned close to the outer wall to create different stiffness in the gripper arm. Upon compression of the chamber which generates pressure on the pneumatic channel, the gripper arm will bend inward to form a close grip posture because the outer wall area is more compliant. The soft gripper can be inserted into a 3D-printed handling tool with two different control modes for chamber compression: manual gripper mode with a movable piston, and robotic gripper mode with a linear actuator. The double-arm gripper with two actuatable arms was able to pick up objects of sizes up to 2 mm and yet generate lower compressive forces as compared to elastomer-coated and non-coated rigid grippers. The feasibility of having other designs, such as single-arm or hook gripper, was also demonstrated, which further highlighted the customizability of the soft gripper device, and it's potential to be used in delicate surgical manipulation to reduce the risk of tissue grip damage.

This protocol describes a rod-based approach, combining 3D-printing and soft lithography techniques for fabricating the soft gripper devices. This approach eliminates the need for an external air source by incorporating a chamber component and reduces the chance of occlusion during the sealing process, particularly for miniaturized pneumatic channels.

섬세한 조직 조작을위한 사용자 정의 소프트 로봇 공압 그리퍼 장치의로드 기반의 제조

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

In these studies, we provide methodology for novel, neonatal, murine cardiac scaffolds for use in regenerative studies.

신생아 심장 공사장 공중 발판 : 회생 연구 소설 행렬

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

조직 공학 응용 프로그램에 대 한 제어 형태학과 3 차원 Poly(ε-caprolactone) 장비의 전기 글 녹아

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

연골과 피부 조직 아날로그 소설 수동 Bioink Precellularization에 대 한 단위 기술 혼합을 이용 하 여 Bioprinting

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

내가 조직 공학에 대 한 마우스 Cochleae Decellularizing에 대 한 프로토콜

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...