저자는 도움이 의견들과 원고의 중요한 독서 박사 드레 넬슨 감사드립니다. 이 작품은 올 버니에있는 대학 SUNY에 대한 NIH 보조금 DE019244, DE019197, 그리고 DE021841 ML까지, F32DE02098001 SJS까지, C06 RR015464로 운영되었습니다.

프로토콜은 그림 1에 설명 된 네 개의 주요 단계가 포함되어 있습니다. 모든 단계는 전체 자세히 설명되어 있습니다. 아데노 바이러스 건설 바이러스 정화는 해부하는 상피 초보의 유전 형질 도입에 사용하기 위해 장기 수확을 사전에 수행해야합니다. adenoviruses과 함께 작업 할 때 모든 표준 BSL-2 안전 조치를 준수해야합니다. 1. 마우스 배아 턱밑 분비선 (SMG) 수확 및 Microdissection <ol><li> 배아 일 13시 마우스 배아의 자궁 전위와 수확 문자열 (E13, 3-5 상피 꽃 봉오리) 기관 IACUC의 승인을 다음 절차에 이어 CO 2 마취법을 사용하여 시간 제한이 초과 임신 여성 마우스 (outbred 변형 CD-1 또는 ICR)을 안락사시켜야 위원회. 질 플러그 발견의 날은 E0로 지정되어 있습니다. 갈라진 틈은 단지 시작과 하나의 주요 꽃 봉오리와 줄기가있을 때 침샘도 E12 단계에서 수확하고 배양 할 수 있습니다시작합니다. 이전 단계에 SMGs 여기에 표시된 것보다 다른 문화 조건을 필요로합니다. </li><li> 페놀 레드 (생명 기술), 100 U / ML 페니실린과 보충, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신 (펜 패 혈성이 부족한 DMEM / 햄의 F12 매체 (F12)의 25 ML로 가득 무균 10cm 조직 문화 요리에 배아 문자열을 전송, 생활 기술을). </li><li> 멸균 메스 (# 11 블레이드)와 집게를 (# 5, 정밀 과학 도구, 11252-20)를 사용하여, DMEM/F12 + 펜 패 혈성의 25 ML을 포함하는 별도의 10cm 접시에 주머니에서 배아를 제거합니다. </li><li> 단지 아래턱 아래의 각진 컷으로 배아 머리를 자르다. </li><li> 상단 턱 아래 컷을 사용하여 전송 라이트베이스 (니콘 SMZ645 또는 동급)와 스테레오 해부 현미경 헤드의 낮은 개미를 분리합니다. 유리의 추가 작품의 상단에보다는 직접 현미경베이스의 유리 구성 요소에 조직을 배치합니다. </li><li> DM 3 ML로 낮은 개미를 수집EM/F12 + 살균 35mm 조직 배양 접시에 펜 패 혈성. </li><li> 혀는 슬라이스의 맨 아래에 있지만 12시시 위치쪽으로 향하고되도록 해부 현미경 무대에 턱이 슬라이스를 놓습니다. </li><li> scissoring 모션에서 두 짓밟 포셉의 한면을 사용하여 제거하고 아래턱 슬라이스의 3분의 1 낮은 회를 폐기하십시오. </li><li> 포셉과 scissoring 컷을 사용하여 슬라이스 90 오른쪽에 ° (오른 손잡이 경우) 등을 돌려, 중간 슬라이스로 아래턱 슬라이스의 상단 부분을 (혀를 절단하지 않고) 절단. </li><li> 필 초과 거리에 조직과 아래 SMGs를 노출 할을 제거합니다. 혀의 기지 근처 각면에 하나가 될 것입니다. </li><li> 혀에 의해 조직을 누르고 포셉 한 쌍의를 사용하여 혀에서 SMG을 멀리 감히 다른 집게를 사용합니다. 다른 선에 대해 반복합니다. </li><li> 새로운 살균 35mm 조직에 DMEM/F12 + 펜 패 혈성 3 ML에 microdissected 침샘을 수집배양 접시. 참고 : 연결된 작은 sublingual 글 랜드 (1 꽃 봉오리)와 함께 큰 턱밑 분비 (3-5 상피 꽃 봉오리)이 4 단계로 건너와 단계 4.1 4.3 수행하고, 4.4에서 그대로 배양 할 수와 같은 이전에 2,8 설명했다. </li></ol> 2. 상피 흔적 기관 분리를 SMG <ol><li> 장소 5 (이상) 행크의 균형 소금 솔루션 200 μl (HBSS는 칼슘이 부족한를 포함하는 유리 바닥, 50mm 직경 microwell 요리 (MatTek 공사, P50G-1.5-14-F)로 침샘 + + 또는 MG + +, 생명 기술) 0.4 %를 포함 (V / V) dispase (생명 기술, 고양이. 안돼. 17105-041)와 37 15 분에 품다 ° C. </li><li> 부화 후, 멸균 200 μl 피펫 팁 사용하여 조심스럽게 분비를 방해하지 않으면 서 dispase 솔루션을 기음. 즉시 BSA (DMEM/F12-BSA, 필터 0.22 μm와 사전 소독)는 dispase을 중화하는데 5 % (w / v를) 포함 DMEM/F12 미디어 200 μl를 추가합니다. </li> &lt;리&gt; 해부 현미경에서 좋은 팁 (# 5 Dumostar 좋아, 과학 도구, 11295-20)와 포셉 한 쌍의를 사용하여 부드럽게 상피를 그대로 유지하도록 관리하고, SMG 상피 꽃받침과 구멍 주변에서 느슨해 mesenchyme을 분리 . </li><li> 사전 젖은 멸균 200 μl 피펫의 DMEM/F12-BSA 매체와 팁 부드럽게 DME​​M/F12 200 μl + 펜 패 혈성을 포함하는 새로운 50mm 직경 microwell 요리로 상피 초보를 피펫. 부드러운 가장자리와 높은 품질을 200 μl 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> mesenchyme 조각을 포함하는 음식에서 sublingual 분비와 분리 턱밑 글 랜드 꽃 봉오리를 포함하여 비 중간 엽 조직을 폐기합니다. </li></ol> 3. 상피 초보의 Adenoviral 감염 <ol><li> 결과 솔루션의 titer는 1x10 8 -10 9 PFUs이되도록 microcentrifuge 관 DMEM/F12 + 펜 패 혈성에 대한 관심의 아데노 바이러스를 diluting하여 바이러스 감염 미디어 200 μl를 확인합니다.다른 바이러스에 필요한 최적의 titer는 다를 수 있습니다. 이 세슘 염화물 (CsCl) - 정화 최적의 통풍 관 효율을위한 바이러스 준비를 사용하는 것이 중요합니다. </li><li> 다섯 상피 초보가 포함 된 음식에서 미디어를 제거합니다. 신속 항상 초보가 젖 유지, 감염 미디어 200 μl를 추가합니다. 바이러스를 처리하고 오염 pipet 팁 폐기에 필요한주의 사항을보십시오. 10 % 표백제 솔루션 바이러스 오염 된 표면을 소독. </li><li> 같이 가겠다는에서 그들을 방지하고 그들에게 접시의 바닥에 정착 할 수 있도록 집게와 멀리 떨어져 서로 상피 초보를 이동합니다. 상온에서 1 시간에 바이러스 성 미디어 초보를 품다. 사람들이 가까운 곳에 이동하면 부화하는 동안, 초보를 구분합니다. 과도한 흔들거나 운동이 선들이 함께 덩어리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 부화 후, 부드럽게 바이러스 함유 미디어를 제거하고 적절하게 폐기, 연구를 중단하지 돌봐udiments. DMEM/F12 + 펜 패 혈성 200 μl를 추가합니다. 이 세차 적어도 두 번 이상 반복하고 DMEM/F12 + 펜 패 혈성 미디어 200 μl로 교체하십시오. 이 세차 강력 상피에 부착되지 않은 바이러스를 제거하고 mesenchyme의 감염을 방지하기 위해 중요합니다. </li><li> DMEM/F12 200 ML 2 %를 포함과 상피 초보를 배양 (V / V) 20 분에 Matrigel (BD Biosciences, 356231). 우리는 Matrigel이 짧은 부화가 초기 문화 기간 동안 기존의 갈라진 틈의 회귀를 최소화 발견,이 단계는 Matrigel에 노출이 원하는하지 않은 경우에 투여 할 수 있습니다. </li></ol> 재결합 SMGs 4. 예를 생체 문화 <ol><li> 노치 (작은 컷)의 상단에, 사전 젖은 200 μl 피펫 팁을 사용하여 각 퇴화 기관, 한 번에 하나를 놓고 13mm, 0.1 μm 문화 미디어 200 μl (를 떠 Nuclepore 트랙 - 에칭 막 필터 (워트 먼지) 바닥이 유리로 microwell 판 5 초보 / 필터). 문화 미디어입니다 : DMEM/F12 + 펜 패 혈성은 50 μg / ML 트랜스페린과 150 μg / ML 아스코르브 산 등 이전에 2,8 설명을 포함. 트랜스페린은 생존을 촉진하는 것으로 알려져 있으며 침샘과 다른 장기의 explants 9 morphogenesis을 가지입니다. 아스코르브 산의 추가는 SMG 브랜칭을 촉진하기 위해 표시되었습니다. (10)는 이것은 신진 대사 경로 (예 : 콜라겐 섬유 형성 11시 프롤린 hydroxylation 등)의 많은 hydroxylation 반응에 cofactor 역할을하는 것으로 알려져 있으며, 다른 장기의 explants에서 fibronectin과 laminin 생산을 자극합니다 12. </li><li> 각 상피 흔적 기관을 추가 한 후 가능한 한 필터의 상단에 많이 미디어로 제거합니다. 필터의 상단에 너무 많은 미디어가 적은 미디어 초보의 배치를 할 동안, 필터가 침몰의 원인과 훨씬 쉽게 mesenchyme 수 있습니다. 초과 미디어는 피펫 팁이나 조언의 미디어를 놓치 집게를 사용하여 하나 제거 할 수 있습니다. </li><li> 장소 mesenchyme 조각이 서있는 파생상단 및 / 또는 각 상피 흔적 기관 주위 m 3-4 분비. 멀리 초보에서 mesenchyme의 움직임을 피하기 위해이 선들을 둘러싼되는 추가 미디어를 제거합니다. 더 많은 선들에서 파생 Mesenchyme가 도움이되지 않습니다 미만 상피 흔적 기관의 성장에 해로운 수 있습니다. </li><li> 원하는대로, 48 -72 시간에 37 ° C에서 humidified 인큐베이터 (95% 공기 / 5퍼센트 CO 2)에 재결합 SMGs을 품다. </li><li> brightfield 및 / 또는 형광성 0 시간 라이브 분비의 이미지 (원하는 경우), 재결합 후 2 시간하고 4X 또는 5 배 확대 목표를 사용하여 디지털 카메라를 갖추고, 역 수직, 또는 스테레오 가벼운 현미경에 이후 모든 24 시간을 습득 보기의 단일 프레임에 전체 재결합 선을 캡처합니다. 침샘의 이미지는 빛 경로 (이 완전 자동화 된 현미경에 수 없습니다)에 부품 방법을 배치 brightfield 설정하거나 적절한 단계 링을 사용하여 최적의 대비를 보여줍니다. 표준 위상 대비는 없습니다필요 t는 선 육중하고 있기 때문에 대비를 만듭니다. </li><li> 원하는 시간 점에서 재결합 SMGs은 5 % (w / V) 자당을 (더 나은에 세포를 유지하여 내부 세포 구조를 유지하기 위해 포함 1X PBS에 2 % paraformaldehyde (PFA)로 만든 정착액 솔루션을 20 분 고정 할 수 있습니다 isosmotic 주). 정착액이 완전히 고정 후 제거하면 4% 달리 PFA, 2퍼센트 PFA는 GFP 신호의 상당한 양을 유지합니다. 선들은 4에서 어둠 속에서 1X PBS에서 일주까지에 저장할 수 있습니다 ° C 전체 마운트 immunocytochemistry 및 공 촛점 이미징이 수행 될 때까지 이전과 같이 3,6,13-15 보도했다. 이상적으로, immunocytochemistry 및 이미징은 최고 품질의 이미지를 얻기 위해 고정 후 곧 수행해야합니다. 분비는 서양 blotting 분석에 이어 SDS-PAGE에 RIPA 버퍼에 lysed 될 수 있습니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

예 생체 상피 - 중간 엽 재조합 기술이 처음 1981 16 턱밑 침샘에 출판되었다. 이 프로토콜에서는, 우리는 재결합 선의 컨텍스트 내에서 상피 세포의 유전자 발현을 조작하는 adenoviral 감염를 사용하여 원래의 방법에 따라 확장합니다. 우리는 감염된 세포의 비율은 바이러스 발기인의 속성, 바이러스 titer 및 바이러스 순도에 따라 달라집니다 반면, 상피 세포의 비율은, 아데노 바이러?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 페놀 레드가없는 DMEM / 햄의 F12 중 </td><td> 생명 기술 </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린과 스트렙토 마이신 </td><td> 생명 기술 </td><td> 15070-163 </td><td> 10X 주식 </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 생명 기술 </td><td> 17105-041 </td><td> 단일 사용 aliquots을 고정에서-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 </td><td> A2934-100G </td><td> 분수 V, 낮은 내 독소 </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> 높은 titer (1x10 10 PFU / ML) 여야합니다. CsCl 정화 바이러스는이 분석에서 바이러스를 열 정화보다 더 효과적입니다. </td></tr><tr><td> 16 % Paraformaldehyde </td><td&gt; 전자 현미경 과학 </td><td> 15,710 </td><td> 5 %의 자당 (w / V)와 PBS에서 2 %로 희석 </td></tr><tr><td> 1X 인산 버퍼 생리 (PBS) </td><td> 생명 기술 </td><td> 70011-044 </td><td> 10X 혈통 준비 </td></tr><tr><td> 행크의 균형 소금 솔루션 </td><td> 생명 기술 </td><td> 14175095 </td><td> 더 칼슘도없고, 마그네슘, 아니 페놀 레드 </td></tr><tr><td> 트랜스페린 </td><td> 시그마 </td><td> T8158 </td><td> 25 MG / DMEM/F12 미디어 ML 주식 솔루션입니다. 단일 사용 aliquots에서-20C를 고정 </td></tr><tr><td> L-아스코르브 산 (비타민 C) </td><td> 시그마 </td><td> A4403 </td><td> DMEM/F12 media.Freeze 단일 사용 aliquots 75 MG / ML 주식 솔루션에서-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 재결합 프로토콜을 SMG에 필요한 시약의 목록입니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 10cm 멸균 플라스틱 요리 </td><td> 코닝 </td><td> 430167 </td><td> 비 조직 문화 치료 접시도 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 전송 라이트 기반으로 스테레오 해부 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> SMZ645 </td><td> 현미경을 해부 모든 스테레오가 전송 가벼운 기지를 가지고 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 35mm 조직 문화 요리 </td><td> 매 </td><td> 353001 </td><td> 비 조직 문화 치료 접시도 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 50mm 직경 microwell 요리 </td><td> MatTek 공사 </td><td> P50-G-1.5 14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore 트랙 - 에칭 막 필터 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 110405 </td><td> 13mm 직경, 0.1 mm 구멍 크기 </td></tr><tr><td> Widefield 형광 현미경 </td><td> 칼 Zeiss, USA </td><td> Axio 옵저버 Z1 </td><td> 모든 형광 현미경 (똑바로, 전) nverted 또는 현미경을 해부 스테레오는 첨부 된 디지털 카메라로 낮은 배율에서 GFP 발현을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 공 촛점 현미경 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> TCS SP5 </td><td> 공 촛점 현미경 자세한 세포 구조를 볼 필요가 있습니다. 모든 공 촛점 현미경을 사용하실 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 시간 제한이 초과 임신 여성 마우스, 스트레인 CD-1 또는 ICR </td><td> 찰스 강 (Charles River) 연구소 </td><td></td><td> 태아는 하루에 13 일 (일 0로 지정 플러그 발견 하루)에 수확하고 있습니다. </td></tr><tr><td> 메스 블레이드 # 11 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> 메스 핸들 # 3 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5 포셉 inox 합금, 0.05mm X 0.02mm </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11252-20 </td><td> 배아에서 분비 수확에 이상적 </td></tr><tr><td&gt; 뒤몽 # 5 포셉 dumostar 합금, 0.05mm X 0.01mm </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11295-20 </td><td> 좋은 팁 상피에서 mesenchyme을 제거 필요합니다. 텅스텐 바늘도 사용하실 수 있습니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 2. 장비 재결합 프로토콜을 SMG에 사용됩니다. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

morphogenesis을 분기하는 많은 기관의 개발 기간 동안 발생하며, 배아 마우스 턱밑의 선 (SMG)는 morphogenesis을 가지 연구를위한 클래식 모델입니다. - 궁극적으로 구강 하나에 각각 침을 생산 및 수정 / 전송하기 위해 사용될 acini과 관의 복잡한 분지 네트워크에 상승을 제공하기 위해 상피 봉오리 덕트 형성 단계를 반복 개발 SMG,이 과정은 포함 3. 어떻게 세포와 분자 이벤트가 제대로 이해 남아 조정 아르하지만 상피 - 관련 지하 막하고 이러한 세포에 의해 생산 mesenchyme 세포, 성장 인자와 세포 외 기질을 포함하는 중간 엽 구획의 측면은, 분기 메커니즘에 중요한 사 . 분자 메커니즘의 연구는 상피 morphogenesis 진행에게 발달 메커니즘에 대한 우리의 이해를 운전 가능한 regener에 대한 통찰력을 제공합니다ative 의학 접근. 이러한 연구는 침 상피의 유전자 조작에 대한 효과적인 방법의 부족으로 인해 방해되었습니다. 현재 adenoviral 도입은 생체 5 성인 분비에 상피 세포를 타겟팅하는 가장 효과적인 방법을 나타냅니다. 그러나 배아 explants에서 조밀 mesenchyme과 상피 세포를 둘러싸고있는 지하 막는 상피 세포에 바이러스 접근을 막는. mesenchyme가 제거되면, 상피는 adenoviruses를 사용하여 transfected 수 있고, 상피 초보는 Matrigel 또는 laminin-111 6,7의 존재에 morphogenesis을 분기 재개 할 수 있습니다. Mesenchyme 무료 상피 흔적 기관의 성장은 수용성 성장 요인으로 추가 보완이 필요하고 그대로 땀샘 8 발생할 때 완전히 분기 morphogenesis을 요점을 되풀이하지 않습니다. 여기 transfected 전자의 상피 세포와 문화의 adenoviral 전달을 용이하게하는 기술을 설명관련 정보 mesenchyme있는 pithelium. 배아 SMGs, mesenchyme의 제거, 그리고 GFP 함유 아데노 바이러스와 상피의 바이러스 감염의 microdissection 따라, 우리는 상피가 저절로 그대로 SMG 선의 구조를 recapitulating하고 morphogenesis을 분기, 감염되지 않은 mesenchyme과 recombines을 보여줍니다. 유전자 변형 상피 세포 인구는 쉽게 휘황 태그 경우 adenoviral 구조가 사용되는 표준 형광 현미경 방법을 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 조직 재조합 방법은 현재 유전자 변형 동물의 생성을 필요로하지 않습니다 복잡한 3D 조직 구조 내에서 야생 형 또는 돌연변이 벡터와 상피 세포의 transfection을위한 가장 효과적이고 접근 방법입니다.

주요 실험 단계의 흐름은 그림 1에 설명되어 있습니다. 그대로 SMG 고립 된 상피 흔적 기관 및 해당 mesenchyme의 예는 그림 2에 표시됩니다. 지정된 시간에 대한 양식 예를 생체가 그림 3에 표시됩니다 때 morphogenesis을 분기 받아야 계속 재결합 SMGs의 Brightfield 이미지. 상피 GFP를 표현하는 48 시간에 성장 재결합 분비가 그림 4에 표시됩니다....

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Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

유전자 전체에서 상피 세포를 조작하는 기술<em&gt; 예 생체</em바이러스 성 유전자 전달을 사용하여&gt; 교양 배아 마우스 턱밑의 분비 (SMGs)이 설명되어 있습니다. 이 방법은 상피와 자발적으로 adenoviral 벡터와 상피 초보의 분리 및 감염 후 재결합 할 수 mesenchyme을 SMG의 본래 기능을 활용합니다.

침샘 조직 문화의 유전자 변형과 재결합

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

genetic-modification-recombination-salivary-gland-organ

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K 조회수.  University at Albany, SUNY. 유전자 전체에서 상피 세포를 조작하는 기술 예 생체 교양 배아 마우스 턱밑의 분비 (SMGs)이 설명되어 있습니다. 이 방법은 상피와 자발적으로 adenoviral 벡터와 상피 초보의 분리 및 감염 후 재결합 할 수 mesenchyme을 SMG의 본래 기능을 활용합니다.

비디오: Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

애에서 Midgut과 침샘의 해부. aegypti 모기

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

연구

생물학

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS 장치 제작 및 표면 변경

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

2 dGuo - 치료 Thymus 오르간 문화의 준비

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

마우스 침샘에 줄기 세포의 분리

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

의 DNA Methylation : Bisulphite의 변경 및 분석

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.