이 연구는 베를린에서 분자 의학 및 샤리 테 (Charite) 의료 교수진 센터 Delbrück 실험 및 임상 연구 센터, 최대의 협력에서 SW에 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG WA 2804)와 SW를 대학에 교부금에 의해 투자되었다. 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시하는 결정 또는 원고의 준비에있는 아무 역할도 없었다. 우리는 우리의 실험실에서 인턴 기간 동안 기술 지원 로버트 Westphal 감사합니다.

모든 동물의 절차를 수행하기 전에 지역 기관 동물 복지위원회의 승인을 받아야한다. MR 측정시 마취 및 생리 학적 모니터링의 적절한 수준 (체온, 호흡 속도) 필수 요구 사항입니다. 1. 마우스 골수 유래 수지상 세포의 생성 <ol><li> C57BL에서 골수 세포를 추출 / 6 마우스는 이전 12 설명했다.이 프로토콜은 다시 1992 13 날짜 원래 랄프 M. Steinman (1,943에서 2,011 사이), 수지상 세포 (14)의 발견의 그룹에 의해 설명되었다. </li><li> 간단히, 쥐를 희생 직후 경골과 비골의 압축을 풉니 다. 층류 후드 (미생물 오염을 방지하기 위해)에서 작동, 세척 매체 (5 % FBS, RPMI 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % HEPES) 12와 작은 페트리 접시에 골수를 플러시. </li><li> 셀 스트라 통해 세포 현탁액을 전송iner (100 μm의 메쉬 크기, 나일론) 멸균 50 ML의 원심 분리기 튜브에 뼈와 남은 조직을 제거하기 위해합니다. 몇 가지 세척 단계와 용해 단계 12 이후 판 블루와 혈구를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다. </li><li> 40 세포의 농도 문화 매체 ML -1을 Resuspend 골수 세포 (RPMI 10 % FBS와 보충, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % HEPES, 1 % L-글루타민) 마우스 과립구의 75 NG ML -1을 포함 플라스미드 마우스 GMCSF 형질 전환 293FT HEK 세포의 상층 액에서 얻은 대 식세포 콜로니 자극 인자 (MGM-CSF). 배양 접시에 세포 현탁액 10 ㎖ (4 × 10 6 세포) (100mm X 20mm)를 전송하고 (37 ° C, 5 % CO 2) CO 2 배양기에서 배양한다. 3 일에 10 ML 신선한 매체 (75 NG ML -1 MGM-CSF의 최종 농도를 유지)와 오래된 매체를 보충. 하루에 6, 오래된 매체의 10 ML을 제거하고 보충10 ML 신선한 배지로 (MGM-CSF 최종 농도 = 75 NG ML -1). 8 일에 오래 된 매체의 10 ML을 제거하고 10 ML 신선한 매체 (MGM-CSF 최종 농도 = 150 NG ML -1)로 보충. </li><li> 하루 10, 24 시간 동안 1 μg ML -1 리포 다당류 (LPS)로 차별화 된 DC 성숙. </li></ol> 2. 19 F 풍부한 입자와 수지상 세포의 레이블 <ol><li> 24 시간 성숙 단계 (1.5), 라벨 DC시에 1 mM의 불소가 풍부한 퍼플 루오-15-크라운 - 5 - 에테르 (PFCE)는 24 시간 동안 입자 (500-560 nm의). 세포 방해 티타늄 sonotrode를 사용하여 60 초 동안 연속 펄스 프로그램 (진폭 100 %, 전력 = 250 W)를 고용 (총 부피 2.5 ml)에 플루로 닉 F-68에 PFCE을 유화로 큰 불소라는 입자를 준비합니다. </li><li> 상기 배양 단계에 따라 50 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 조직 배양 세포 스크레이퍼, 전송을 사용하여 성숙하고 불소 표시 DC 수확500 실온에서 5 분 × g. </li><li> 남은 입자와 죽은 세포를 씻어, 폴리-L-라이신 요리를 준수 수확 세포를 둡니다. 이 단계를 준비하려면 1 시간 37 ° C에서 폴리-L-라이신 (1 MG ML -1)로 코팅 페트리 접시는 이후 PBS와 언 바운드 폴리-L-라이신을 씻어. </li><li> 혈청이없는 배지에서 폴리-L-라이신 - 코팅 접시에 수확 세포보다 배양하고 (37에서 1 시간 ° C, 5 % CO 2) 세포가 부착 할 수 있습니다. </li><li> 비 부착 세포, 나머지 입자와 죽은 세포를 버리고로 3 회 세척 매체를 씻어 사전 예열 (37 ° C) PBS. </li><li> 트립신-EDTA 처리 (0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 37 ° C에서 3 분 배양)하여 수확 자기편 세포를. </li><li> 다른 세척 원심 분리 단계에 따라 혈청이없는 멸균 PBS에서 성숙 DC의 필요한 금액을 resuspend을. </li><li> 세포가 성공적으로 표시되었는지 여부를 확인하려면, 그것은 physicoche을 확인하는 것이 좋습니다유동 세포 계측법 (FACS)를 사용하여 세포의 화학적 인 특성. 이전 11 설명 된대로 옆으로 분산 (SSC)는,이 세포에서 증가 단위를 공개해야한다. 그것은 또한 섬유 아세포는 DC 문화를 오염 할 수 있으며 병렬 19 F 입자를 취할 수있는 염두에 보관해야합니다. 따라서 DC의 순도는 생체 내 응용 프로그램에서 이전에 (FACS를 사용하여 CD11c + CD11b + 세포의 비율을 측정하여) 평가되어야한다. </li></ol> 3. 19 F-라벨 수지상 세포의 생체 내 응용 프로그램 <ol><li> 홀더에 마우스를 배치하여 intracutaneously C57BL / 6 마우스의 뒷다리에 100 μL를 조심스럽게 피부의 상위 계층에 26 ½ G 바늘을 삽입 - 50의 볼륨 - DC를 (10 7 10 6) 관리 이전 응용 프로그램 (영구적으로 부착 된 바늘을 사용 0.5 ML의 투베르쿨린 주사기를 죽은 양을 최소화하기 위해). 을 보장하기 위해N 적절한 피내 응용 프로그램, 그것은 바늘의 삽입 된 부분은 피부 아래에 부분적으로 표시하는 것이 중요합니다. 바늘이 더 이상 표시되지 않는 경우, 바늘은 피부 층에 너무 깊이 삽입되었습니다. 훈련받지 않은 개인에 대한, 피내 응용 프로그램은 마취하에 수행 할 수 있습니다. </li><li> 생체 불소에 의한 이미지 사지 (19 F) / 양성자 (1 H) MRI (다음 섹션 참조) 21 시간 뒤에 주입. </li></ol> 4. VIVO에서 19 F / 1 H 자기 공명 영상 MR 스캔 설정을위한 자세한 설명은 제어 소프트웨어 Paravison (버전 5.1)를 사용하여 브루 커 MR 스캐너를 참조하십시오. 공급 업체 특정 기능과 항목을 참조 이름은 이탤릭체로 강조되었다. 다른 MR 스캐너에 대해 이러한 단계는 제조업체의 지침에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. <ol><li> 전용 액세스를 정렬작은 동물 MR 스캐너. 빠른 바이오 메드, 뷔르츠부르크,, 적절한 화질, 9.4 테슬라 이상과 맞춤형 고주파 코일 (예를 들어 1 시간 / 19 F 이중 조정 볼륨 RF 코일, 35mm 내경 50 mm 길이의 자기장 강도 시스템에 대한 독일) 권장됩니다. </li><li> MRI 이전에, 마취 및 생리적 모니터링을위한 MRI 스캐너의 설정을 준비합니다. 동물 침대 / 홀더의 호흡 마스크가 isoflurane을 시스템에 연결하고 온도 프로브와 호흡 패드 원격 동물 모니터링 시스템 (eg 모델 1025, SA 인스트루먼츠, 뉴욕, USA)에 연결되어 있는지 확인합니다. 후자는 체온과 호흡과 같은 동물의 중요한 매개 변수를 모니터링하는 역할을한다. </li><li> isoflurane을 시스템에 연결된 마우스 챔버를 사용하여 흡입 마취로 마우스를 마취. 0.2 L 분 -1 0.1 L 분 -1, 각각에 공기와 O 2의 유량을 조정및 마취의 필요한 수준까지 약 2 분 isoflurane을 3 %는 (기화기에서 조정) (응답이 다음 발가락 핀치)에 도달. 최적의 유량은 사용중인 설정에 따라 다를 수 있습니다. 높은 유량 탈수로 이어질 수도 있다는 점에 유의해야합니다. 위에서 언급 한 동물의 상태를주의 깊게 모니터링은 항상 필요합니다. </li><li> 작은 동물 MR 스캐너 (그림 1)의 마우스 침대 / 홀더 경향 마우스를 놓습니다. </li><li> 공기와 O 2 일정에 대한 유량을 유지하면서, 0.8 isoflurane을 기화기 조정 - 1.5 %를 최적의 호흡 패턴에 도달 할 때까지. 50 호흡 - 분당 70 심호흡을 권장합니다. </li><li> 따뜻한 물 (또는 양자 택일로 따뜻한 공기) 순환 시스템을 채택하여 실험 기간 동안 36-37 ° C에서 체온을 유지합니다. </li><li> 측정하는 동안 멸균 눈 바르는 연고와 마우스 수분의 눈을 유지합니다. </li><li> 동물을 확보 한 후영상 홀더 및 모니터링 시스템에 대한 연결에, 1 H / 19 F RF 코일 (동물 스캐너 자석의 등각에 위치하는)의 중심에 홀더를 이동합니다. </li><li> 자동화 된 방법 (예 : 모터 구동 동물 홀더와 결합 위치 레이저를 사용하여)으로 또는 수동으로 홀더를 이동해야하는 거리를 계산하여도, 무릎 자석의 등각 내에 자리 잡고있는 등 마우스의 위치를 설정 자석에 등각에 도달. </li><li> 스캐너의 동물의 정확한 위치를 확인하고 나중에 이미지 슬라이스 구조 (공간 즉 크기, 위치 및 회전)의 계획에 대해 신속하고 낮은 해상도의 이미지를 사용하여 세 가지 표준 방향 (시상, 관상, 축)의 이미지를 정찰 획득 취득 방법 (FLASH 펄스 시퀀스를 사용 예 TriPilot 프로토콜). </li><li> 1 H 공진 주파수에 RF 코일을 조정 (예를 들어,. 400.1 9.4 T에 대한 MHz 이상)와 19 F 공진 주파수 (예 : 9.4 T를위한 376.3 MHz 이상)과 동물 MR 스캐너의 튜닝 모니터를 사용하는 50 옴 코일의 특성 임피던스를 일치합니다. 튜닝 및 매칭 전송 및 신호 수신을위한 최적의 조건을 달성하기 위해 필요합니다. </li><li> RF 진폭 (조정하려면 마우스 라 모어 주파수 (예를 들어, ADJ_SF) 및 참조 이득 RF를 조정 미세 조정에 자기장 (예 : ADJ_SHIM) 시스템 주파수 조정의 동질성을 shimming 등 필요한 자동 시스템 설정을 수행 예를 들어 ADJ_REFG). 이러한 모든 설정은 가능한 한 균질로 관심의 영역에서 정적 변수 마그네틱 필드 (B 0, B 1)을 확인하는 것이 중요합니다. </li><li> 시야 (FOV) 등이 낮은 사지를 모두 AR을 조정 한 후, 세 개의 직교 방향에 따라 정찰 이미지의 두 번째 (위)를 취득골반에서 도보 (LXWXH = 50x25x25 mm)로 표시 마. 이러한 이미지는 최종 3 차원 1 H / 19 F 스캔의 방향을 계획하는 역할을한다. </li><li> TR / TE = 1500 / 53 밀리, FOV = 50x25x25 mm, 행렬 = 400x200x200, RARE 요인 = 16 (. 스캔 시간 약 60 분) : 1 H-스캔 TurboRARE 3D 프로토콜을 설정합니다. 스카우트 이미지의 도움으로 FOV를 조정 (신호등) 스캔을 시작합니다. </li><li> 적어도 1,000 밀리의 TR로 단일 펄스 FID 시퀀스를 넣습니다. 편집 스캔을 열고 19 F.를 핵으로 설정 도구 상자의 편집 방법에서 자동으로 참조 게인을 취소하여 수동 게인 설정을 사용합니다. </li><li> GSP를 (설치 이동)을 사용하여 실시간으로 MR 신호를 표시하는 데이터를 기록하지 않고 측정을 시작합니다. 수집 창 내에서 19 F 스펙트럼 신호가 너무 낮 으면, 편집 방법 및 / 더 평균을 추가하거나시까지 펄스 감쇠기 (TX0 또는 SP0 슬라이더)를 조절gnal 명확하게 볼 수 있습니다. 인수 창에서 0 Hz에서 19 F 스펙트럼 피크 중간에 순서대로 기본 주파수를 조정합니다. 기본 주파수 및 보도 중지를 적용합니다. 마취로 사용 isoflurane을가 배경 신호를 생성 할 수 있습니다. 9.4 테슬라 MRI에서 19 F-함유 입자와 isoflurane을 사이에 화학적 변화는 1,800 Hz의 정도입니다. 여기 대역폭이 19 F-라벨 세포 나 입자 흥미로운 isoflurane을 함께를 피하기 위해 3,600 Hz보다 작은 지 확인합니다. 기본 주파수는 19 F-라벨 세포에 의해 생성 된 신호에서 올바르게 설정해야합니다. 실험이 적합하다고으로 또는 마취의 다른 방법을 사용할 수 있습니다. </li><li> 복제 (중복) 이전 1 H 스캔 TurboRARE 3D 프로토콜입니다. 방법 및 선택 해제 자동 참조 이득 (위)을 편집 이동합니다. 편집 스캔에서 19 F 핵을 설정합니다. 128x64x64 행렬을 변경그리고 적어도 40 (최대 64)까지 RARE-팩터. TR / TE 1000 / 6 밀리와 64 평균의 경우, 검사 시간은 약 70 분입니다. 101 (도구 상자)에 수신기 이득을 설정하고 GOP를 (파이프 라인을 이동)를 사용하여 더 이상 조정하지 않고 스캔을 시작합니다. </li><li> 스캔이 완료되면 MR 스캐너에서 마우스 홀더를 철회. 주의 홀더에서 마우스를 분리합니다. 마우스 생체 분석 (예 : 조직학 또는 분광 아래 참조) 희생하지 않을 경우 완전히 마취에서 회복 될 때까지 직접 MR 측정 한 후, 밀접하게 모니터링 할 수 있습니다. 체온 조절이 마취에 의해 영향 때문에 복구 프로세스 동안 따뜻한 온도 조절 패드에 배치되는 별도의 새장에 마우스를 넣습니다. 마우스가 완전히 마취에서 회복되면, 그 보유 케이지와 동물 방에 그것을 반환합니다. </li><li> 19 F 이미지 1 H 이미지에 오버레이하려면보기 메뉴 O를 사용하여동일한 소프트웨어 (Paravison)에 ption를. 언더 기능은 상관 관계에서 찾을 수 있습니다. , 언더을 저장할 새 이미지를로드하고 표까지 봐에서 새 색상을 정의하여 19 F 계층을 강조 표시합니다. 19 F, 1 H 검사를 구별하기 위해, 19 F 신호가 선택한 색상과 배경 1 H 이미지를 가질 것이라고 같은 그레이 스케일로 유지됩니다 (잘라 테이블을보십시오) 선택한 색상에 대한 임계 값을 변경합니다. 다른 후 처리 프로그램 (예를 들어 ImageJ에) 1 H / 19 F 이미지 오버레이를 만들 수 있습니다. </li><li> 19 F 신호의 생체 정량화가 필요하다면, 이전에 15,16을 설명한대로 간단한 양적 프로토콜을 따르십시오. 간단히, 정량화가 마우스 옆에 FOV 내에서 PFCE - 에멀젼의 알려진 농도 기준 관을 배치하여 수행 할 수 있습니다. MR 이미지, 콴을 획득 한 후관심 영역 (ROI) 분석을 사용하여 19 F 신호의 강도를 tify 그림 2와 같이 체외 보정 곡선을 비교합니다. </li></ol> 5. 림프절 자기 공명 분광법 (MRS) <ol><li> 마우스를 희생 한 후, 작은 5 개 mm NMR 튜브에 오금 림프절과 장소를 제거하고 2 % PFA 100 μl를 추가합니다. </li><li> 림프절을 포함하는 NMR 튜브를 들고 최소 5 ㎜의 구멍을 가진 19 F 분광 코일 (토 로이드 코일 등) 설치합니다. </li><li> 코일 내부의 NMR 튜브를 놓고 자석의 등각에 코일을 이동합니다. </li><li> 19 F 공진 주파수 (예를 들어, 9.4 T를위한 376.3 MHz 이상)에 RF 코일을 조정하고 동물 MR 스캐너의 튜닝 모니터를 사용하는 50 옴 코일의 특성 임피던스를 일치합니다. 튜닝 및 매칭 전송 및 신호를위한 최적의 조건을 달성 할 필요가있다수신. </li><li> 0 Shimming 도구 상자 내의 모든 심 매개 변수를 설정하고 Apply (적용)를 누릅니다. 보통은 샘플의 양이 상대적으로 작기 때문에 shimming 방법을 적용 할 필요가 없습니다. 충분한 19 F 신호를 사용할 수있는 경우 자동 방법은 shimming 시스템 주파수 및 상기 한 바와 같이 수신기의 이익을 위해 적용 할 수있다. </li><li> 적어도 1,000 밀리의 TR로 단일 펄스 FID 순서를로드합니다. 스캔을 편집하고 19 F.에 핵을 설정 열기 도구 상자의 편집 방법에서 자동으로 참조 게인을 취소하여 수동 게인 설정을 사용합니다. 1로 평균의 수를 설정합니다. </li><li> GSP를 사용하여 시퀀스를 시작합니다. 수집 창 내에서 19 F 스펙트럼 신호가 너무 낮 으면, 편집 방법 및 / 더 평균을 추가하거나 신호까지 펄스 감쇠기 (TX0 또는 SP0 슬라이더)가 명확하게 볼 수 조절. 기본 주파수를 조정하므로 19 F의 SPEctral 최대 0 Hz에서 수집 창의 중앙에 있고 기본 주파수를 적용합니다. 90 ° 여기에 도달하는 신호를 최대화하기 위해 다시 펄스 감쇠기를 조정합니다. 신호가 최대 눌러 정지에있을 때. </li><li> 64 256 사이의 편집 방법 (또는 그 이상 필요한 경우, 신호에 따라)의 평균을 설정하고 GOP를 사용하여 인수를 시작합니다. 감지 된 신호는 평균의 수에 비례 상관 관계. 정량화하는 동안 감지 된 신호가 하나의 평균으로 정규화해야한다는 점에 유의하십시오. 또한, 알려진 농도 또는 교정 곡선의 보정 표준은 표준화 된 19 F 신호 (그림 2) 세포의 수를 계산하는 것이 필요하다. </li><li> 검사가 완료되면, 샘플을 제거 다음 샘플을 배치 단계 5.3를 진행합니다. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluoroctylbromide+as+a+diagnostic+contrast+medium+in+gastroenterography.">Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography.</a> Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).</li><li>Kwiatkowska, K., Sobota, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+phagocytosis.">Signaling pathways in phagocytosis.</a> Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).</li><li>Mitragotri, S., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+approaches+to+biomaterial+design.">Physical approaches to biomaterial design.</a> Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).</li><li>Hoult, D. I., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal-to-noise+ratio+of+the+nuclear+magnetic+resonance+experiment.">The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment.</a> J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).</li><li>Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenically+cooled+probes+-+a+leap+in+NMR+technology.">Cryogenically cooled probes - a leap in NMR technology.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).</li><li>Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Cellular+Infiltrates+during+Early+Stages+of+Brain+Inflammation+with+Magnetic+Resonance+Microscopy.">Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (3), e32796 (2012).</li><li>Haacke, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , (1999).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

19 F / 1 H MRI는 림프 노드에 DC의 움직임에 따라 고용이 방법은 생체 내에서 면역 세포의 이동 패턴을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 수지상 세포는 빠르게 단단히 특정 기판에 17 준수하지 않고 입체 구조를 통해 기동 할 수있는 면역 세포를 마이그레이션 훌륭한 예입니다. 기술 기술의 낮은 공간 해상도 (μm의 범위)이 기술로, 다중 광자 현미경으로 얻을 수있는 ...

생체 내에서 세포의 추적 생물 의약의 여러 분야에서 중요한 측면이다. 이 경우, 선택적으로 일정 기간 동안 세포를 지역화 할 수 있습니다 비침 투 이미징 기술은 매우 가치가있다. 세 가지 차원 자기 공명 영상 (MRI)의 개발에 앞서, 면역 세포 이동의 추적 현미경 분석 또는 조직 생검에 국한되었다. MRI의 도움으로 세포 추적은 생체 내에서 면역 세포의 행동을 연구 면역을 위해뿐만 아니라, 지난 몇 년 동안 엄청난 주목을 받았다뿐만 아니라, 임상 및 줄기 세포 연구자있다. 90 년대 중반 동안, 산화철의 첫 번째 연구는 1 MRI로 추적 셀 개발의 폭포를 시작 나노 입자. 산화철 입자는 레이블 세포의 MR 휴식 시간 (T2 *) 단축함으로써 MR 영상에서 신호 고갈의 원인이됩니다. 산화철 입자는 라벨 식세포 2, 희소 돌기 아교 세포 P로 사용되어왔다rogenitors 3 그리고 많은 다른 세포 유형. 이들 입자 중 일부는 임상 흑색 종 환자 4 세포 백신을 라벨에 대한 FDA에 의해 승인되었습니다. 생체 또는 철 산화물 입자와 세포의 생체 라벨링 때문에 T2 * 신호의 단축에 의존하고 후자는 같은 마이크로 출혈, 철의 예금이나 기포 등의 생체 감수성 관련 T2 * 효과에 의해 초래 될 수있다 그것은 다른 배경에서 생체 내에서 T2 * 신호 멸종 5 레이블 셀을 식별하기 어려울 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 19 F / 1 H 자기 공명 영상 (MRI)을 이용하여 생체 내에서 수지상 세포 (DC)를 추적하는 방법을 설명합니다. 이 세포 추적 기술은 MRI의 19 F에 대한 최초의 인식 응용 프로그램은 7보고했다 몇 년 후 2005 년 6에 도입되었다. 하나의 중요한 ADVA산화철 입자 셀 라벨에 19 F의 ntage는 조직의 19 F의 낮은 생물 발생이다, 이것은 기본적으로 배경이없는 이미지를 매우 선택적으로 세포를 추적 할 수 있습니다. 또한, 기존의 상반기 MRI에서 얻은 해부 영상과 이식 표시된 세포에서 19 F MR 신호를 중첩 할 수 있습니다. 19 F / 1 H MRI 따라서 생체 내에서 세포의 이동을 조사 연구에 상당히 관련이 있습니다. 이 방법으로 공부 세포는 19 F 풍부한 입자로 표시되어 있습니다. 주로 탄소와 불소 원자 구성된 합성 파생 된 과불 화탄소 (PFCs의)는 일반적으로 입자를 제조하는 데 사용됩니다. 이 화합물은 물에 불용성이며, 관내 또는 생체 내 응용 프로그램에 앞서 유화해야합니다. F-MRI 추적 실험은 생체 내 19에 대해 다른 그룹에 의해 고용 된 PFC 입자의 일반적인 크기100 nm의 245 nm의 6,8-10 사이의 범위. 우리는 그러나 표시 한 증가 입자 크기 (&gt; 560 nm의)와 퍼플 루오-15-크라운 - 5 - 에테르 (PFCE) 입자의 증가와 수지상 세포를 라벨에 효율 11.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6 mice</td>
 <td>Charles River, Berlin</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21875-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS Superior</td>
 <td>Biochrom AG</td>
 <td>S 0615</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Gibco-Invitrogen</td>
 <td>15630-056</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15140-122</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25030-024</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D8662</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFA</td>
 <td>Santa Cruz</td>
 <td>sc-281692</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfluoro-15-crown-5-ether </td>
 <td>ChemPur</td>
 <td>391-1996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F-68 </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P5556</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes (35 x 10 mm)</td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>391-1996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>27 &frac12; G syringes</td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>612-0151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon cell strainers (100 &mu;m mesh) </td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>734-0004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NMR tubes </td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>634-0461</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection tools</td>
 <td>FST</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 incubator </td>
 <td>Binder</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small animal MR system</td>
 <td>Bruker Biospin</td>
 <td></td>
 <td>9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1H/19F dual-tunable volume RF coil </td>
 <td>Rapid Biomed, W&uuml;rzburg, Germany</td>
 <td></td>
 <td>35 mm inner diameter, 50 mm length</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>19F spectroscopy coil </td>
 <td>in-house</td>
 <td></td>
 <td>tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isoflurane inhalation system</td>
 <td>F&ouml;hr Medical Instruments GmbH</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Animal monitoring system Model 1025</td>
 <td>SA Instruments Inc., New York, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

monitoring dendritic cell migration using 19f / 1h magnetic resonance imaging

이러한 자기 공명 영상 (MRI)와 같은 비 침습적 영상 기법의 지속적인 발전은 크게 살아있는 유기체의 생리 학적 또는 병리학 적 과정을 연구하는 능력을 개선했습니다. MRI는 생체 내 이식 된 세포를 캡처를위한 유용한 도구로 증명된다. MR 휴식 시간에 영향을 미치는 조영제 MRI 만들어 사용 초기 셀 라벨 전략 (T1, T2, T2 *)와 라벨 세포가 존재하는 신호의 향상 (T1) 또는 고갈 (T2 *)로 이어집니다. T2와 같은 초소형 산화철 에이전트 (USPIO) 등 * 개선 에이전트는 세포 이동 및 일부도 임상 적 적용을위한 FDA에 의해 승인 된 공부를하기 위해 고용되었다. T2 * 에이전트의 단점은 혈전, 마이크로 출혈이나 기포와 같은 다른 아티팩트의 표시 세포에 의해 생성 된 신호 멸종을 구별하는 어려움이있다. 이 문서에서는, 우리는 생체 내 추적 세포에 대한 새로운 기술을 설명하는불소 (19 F) 부유 입자와 세포를 라벨링을 기반으로합니다. 이러한 입자는 퍼 플루오르 카본 (PFC) 화합물을 유화하고 이후 MRI 19 F로 군데 할 수있는 레이블 세포를 사용하여 준비가되어 있습니다. 생체 포함 (I) 후 19 F MR 분광법에 의해 세포 신호를 정량화하는 배경이없는 이미지와 완전한 세포 selectivityand (II)의 가능성을 산출 생체 내 탄소 결합 19 F,의 부재에서 세포 추적을위한 PFCs의 중요한 장점 .

피내 응용 프로그램에 다음과 같은 여덟에 이십일시간는 19 F-라벨 돌기 세포 (DC)의 배수 오금 림프절로 마이그레이션 할 수 있습니다. 배수 politeal 림프절로 림프 덕트를 통해 DC의 움직임은 19 F DC의 이미지 (그림 2A)와 1 H 해부 영상을 중첩에 의해 평가 될 수있다. 우리는 이전에 생체 내에서 이러한 세포의 이동뿐만 아니라, 흡수 효율 11 등 DC immu...

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Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

MRI를 사용하여 세포 추적 지난 몇 년 동안 괄목할만한 주목을 받고있다. 이 프로토콜은 불소와 수지상 세포의 라벨 설명 (<sup&gt; 19</sup&gt; F)이 풍부한 이들 세포의 생체 내 응용 프로그램에서 입자와 함께 배수 림프절에 그들의 마이 그 레이션의 정도를 모니터링<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H MRI와<sup&gt; 19</sup&gt; F MRS.

사용 모니터링 수지상 세포 이동<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H 자기 공명 영상

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

monitoring-dendritic-cell-migration-using-19f-1h-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

11.7K 조회수.  A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine. MRI를 사용하여 세포 추적 지난 몇 년 동안 괄목할만한 주목을 받고있다. 이 프로토콜은 불소와 수지상 세포의 라벨 설명 ( 19 F)이 풍부한 이들 세포의 생체 내 응용 프로그램에서 입자와 함께 배수 림프절에 그들의 마이 그 레이션의 정도를 모니터링 19 F / 1 H MRI와 19 F MRS.

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

연구

면역학 및 감염병학

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Leukotriene B의 실시간 영상 4 중재 셀 마이 그 레이션 및 β - arrestin로 BLT1 상호 작용

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

굿 - 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 공부 경쟁력 호밍 Assays

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

의 샘플 준비<em&gt; Mycobacterium 결핵</em핵 자기 공명 Metabolomic의 연구&gt; 압축을 풉니 다

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

알레르기기도 염증 동안 폐 돌기 세포 성숙과 마이 그 레이션 분석

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

흑색종과 편평상피암 줄기세포를 이용한 새로운 수지상 세포 백신의 생성

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석<em&gt; 소 결핵균</em&gt; Bacille 칼 메트 - GUERIN

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...