우리는 원고의 중요한 읽기위한 박사님 스미다 감사합니다. 이 작품은 베크 만 젊은 탐정 수상 (SY), 헬맨 가족 새로운 교수진 수상 (SY), NIH 유레카, 캘리포니아 암 연구 조정위원회의 대학에 의해 지원되었다.

1. 안정적인 세포주의 생성 (예 : MDCK 세포) <ol><li> p35 접시에 confluency 80~90%에서 플레이트 세포. 세포 transfection 효율을 줄일 수 백퍼센트 합류 monolayer를 형성하게하지 마십시오. </li><li> Lipofectamine 2000을 사용하는 관심의 플라스미드와 세포 Transfect. 제조 업체의 프로토콜을 사용하여 transfection 조건을 최적화합니다. </li><li> 다음날,이 통로 p150 배양 접시에 세포. 큰 접시는 안정적인 식민지 사이에 충분한 간격을 허용하는 것이 좋습니다. </li><li> 다음날, 미디어를 변경하고 각각의 접시 500 μg / G418의 ML을 추가합니다. G418의 농도는 각각의 세포 라인에 최적화된해야합니다. </li><li> 약 2 주 동안 매일 미디어를 변경합니다. 이주 후, G418 방지 식민지가 형성되기 시작하고, 육안으로 볼 수 있습니다. </li><li> 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 GFP 긍정적인 식민지를 확인합니다. sharpie 펜을 사용하여 접시에 이러한 식민지를 표시합니다. </li><li> s의electively, 조직 문화 판에서 식민지 trypsinize 미디어를 대기음, 그리고 PBS 또는 트립신 솔루션으로 두 번 세포를 씻으십시오. 두 번째 세척에서 모든 솔루션을 기음하지 않습니다. 건조로부터 세포를 방지하기 위해 접시의 바닥에 액체의 얇은 레이어를 둡니다. </li><li> 각 표시 식민지 경우 : 식민지의 가장자리 주위에 최대한 닦아 소독 면봉을 사용합니다. 이것은 세포 식민지를 포함한 서부 유럽 표준시 지역 섬을 생성합니다. 식민지에 트립신의 피펫 10 μl. 모든 식민지에 대한 반복하고 건조하지 않도록 신속하게 진행합니다. 경험이 풍부한 연구자는 대개 p150 플레이트 회 ~ 12 식민지를 선택할 수 있습니다. </li><li> 37 판을 품어 ° C 50~10분에 대한 세포 접시에서 분리하고 둥근 나타날 때까지. </li><li> 각 식민지의 경우 : 피펫 10 식민지에 트립신의 μl, 그리고 접시에서 세포를 분리하기 위해 몇 시간을 위아래로 피펫. 다음 24 잘 접시에 하나의 잘으로 식민지의 모든 세포를 피펫. </li> &lt;리&gt; 안정적인 식민지가 성장 후, 각 식민지의 단백질 표현이 표준 서양 얼룩과 immunofluorescence를 사용하여 분석합니다. 자세한 분석을 위해 이들 세포 라인을 확장합니다. </li></ol> 2. 최적의 콜라겐 바인딩 (선택 사항) 유리 바닥 접시의 표면 수정 <ol><li> 10mm 오프닝 각 p35 요리의 유리 부분에 유리를 silanize하기 위해, 2 %의 피펫 300 μl 3 - Aminopropyltrimethoxysilane 솔루션입니다. silanization 및 상호 연결 배선도 그림 1을 참조하십시오. 3 Aminopropyltrimethoxysilane이 필터링 물에 희석합니다. </li><li> 상온에서 1 시간 품어. </li><li> 3 Aminopropyltrimethoxysilane 솔루션을 기음 10 분 각각에 대한 필터링 물로 세 번 씻는다. </li><li> ° C 1 시간 50로 설정 뜨거운 접시에 물과 장소 요리를 기음. 약간 접시에서 요리 장소 정상 접시에 습기가 탈출 수 있습니다. </li><li> 더위에서 요리를 제거하고 쿠 수나 </li><li> 각 요리의 유리 부분에 2 % 글루 타 알데히드 솔루션의 피펫 300 μl. 글루 타 알데히드는 PBS에 희석됩니다. </li><li> 1 시간 품어. </li><li> 글루 타 알데히드 솔루션을 기음 10 분 각각 PBS로 세 번 설거지. </li><li> 1 시간 동안 자외선에 노출하여 요리를 소독. silanized 요리는 상온에서 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 추적 입자로 3D 콜라겐 젤의 준비 <ol><li> 5 분 15,000 rpm으로 원심 분리기의 주식 추적 입자 (10 10 입자 / ML) 100 μl를 회전하여 형광 추적 입자를 워시, 액체를 대기음, 미디어 500 μl를 추가합니다. 5 번 반복합니다. 마지막으로 세척 후, 미디어 30 μl에 resuspend 입자. </li><li> 평소처럼 표현 GFP 세포를 Trypsinize. </li><li> 약 2 × 10 6 세포 / ML로 Resuspend 세포 펠릿. </li><li> eppendorf 튜브로 성장 미디어 피펫 240 μl. </li><li> 1M Hepes의 12.6 μl, 여과 물 20 μl, 세포 용액 50 μl 후, 형광 입자의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 마지막으로, 소 진피의 콜라겐 전 용액 (1 MG / ML의 작업 농도를 얻기 위해)의 167 μl를 추가합니다. </li><li> 철저 솔루션을 섞어 다음 silanized 유리 바닥 접시의 유리 부분에 솔루션의 80 μl를 피펫. </li><li> 장소 인큐베이터에 요리와 젤, 37에서 중합 수 있도록 ° C 30 분. p35 유리 바닥 접시에있는 전형적인 콜라겐 젤에 대한 그림 1A를 참조하십시오. </li><li> 각각의 접시에 신중하게 성장 미디어 2 ML을 추가합니다. </li></ol> 4. 시간 저속 이미지 수집을위한 절차 <ol><li> 현미경 인클로저의 온도 제어의 전원을 켜고 37 ° C.에 범위 챔버가 안정 상태의 온도로 평형하자 라이브 세포 이미징 시스템의 예를 들어 그림 2를 참조하십시오. </li><li> 중성 산도를 유지하는 25 밀리미터 Hepes와 보충의 새로운 미디어로 미디어를 변경합니다. 에DIC 이미지, 유리 톱을 가지고 하나와 접시의 교환 상단. parafilm의 얇은 스트립을 사용하여 미디어 증발을 방지하기 위해 접시의 측면을 다룹니다. </li><li> 기름 침지 목적은 목적에 침지 액 한방울을 넣으십시오. </li><li> 현미경 스테이지에 접시를 포함하고있는 콜라겐 젤 장소, 요리 침지 액체와 접촉하게 있는지 확인하십시오. </li><li> 샘플 및 이미지에 관심이 세포에 대한 검색 중점을두고 있습니다. 무대 드리프트를 최소화하기 위해 요리 긴 캡처를 시작하기 전에 약 45 분 동안 정착하실 수 있습니다. </li><li> 이미지 수집의 매개 변수를 지정합니다. modulating 레이저 파워, 노출 시간, 주파수 및 캡처 시간의 기간에 의해 세포가 손상될 수 레이저 노출을 최소화합니다. 실제 매개 변수는 현미경 시스템과 세포 유형과 다릅니다. </li><li> 시간 경과 수집하는 동안 억제제는 추가할 수 있습니다. 억제제 추가 실험, parafilm으로 접시를 봉인하지 않습니다. <ol><li> 준비하다Hepes는 원하는 작업 농도의 약물과 미디어를 보충하고 있습니다. </li><li> 미디어, 일시 정지 이미지 캡처에 약물을 추가하고 조심스럽게 접시를 방해하지 않고 접시 상단을 제거하면 준비 완료. </li><li> 접시에있는 미디어를 대기음, 그리고 그릇에 미디어를 포함하는 마약을 피펫. 그런 다음, 접시 위로 조심스럽게를 교체하십시오. </li><li> 샘플 수 뉴 미디어의 추가로 인해 밖에서 초점, 초점을 다시 조정. </li><li> 캡처를 다시 시작한 후, 다음 30 분 동안 캡처를 모니터링하고, 필요에 따라 초점을 다시 조정. 약물 또한 실험의 예를 들어 그림 4를 참조하십시오. </li></ol></li></ol> 5. FRAP 절차 및 분석 <ol><li> FRAP 설치 프로그램은 시스템 사이에 제조 업체의 지침을 따라 다릅니다. </li><li> 라이브 세포 이미징을위한 매개 변수를 설정합니다. </li><li> photobleaching에 대한 매개 변수를 설정합니다. 세포를 손상하지 않고 형광 신호를 photobleach 충분한 레이저 파워를 사용합니다. 이 액면을 테스트연습 세포에 ameters. </li><li> 이미지 캡처를 시작하고 관심 영역을 photobleaching하기 전에 이미지 캡처의 적어도 5 프레임을 수 있습니다. </li><li> 캡처 계속 및 복구 시간은 전체 형광 복구를 캡처하기에 충분해야합니다. FRAP 실험의 예를 들어 그림 5를 참조하십시오. </li><li> photobleached 지역의 평균 형광 강도 (이전과 photobleaching 후) 시간이 지남에 따라 측정하여 형광 복구를 분석합니다. 통계 분석 소프트웨어 (예 : 엑셀)를 사용하여 지수 방정식에 복구 곡선에 맞게 : I = I F (1 - E - 캐럿), 내가 F의 최종 강도이며, 강도이고, t는 시간이며, τ ½이 절반 최종 값에 도달하는 농도에 대한 걸리는 시간입니다 τ ½ = 에선 (2) / K. 하프 타임은 단백질의 이동성의 속도를 측정하기위한 한 방법입니다. </li><li> 매개 변수, 하프 타임 및 지수 - 맞게 곡선의 최종 강도를 얻을 수 있습니다. 일을 계산초기 형광 농도에 최종의 비율을 복용하여 전자 모바일 분수. </li></ol> 6. 대표 결과 매트릭스 내에서 건강한 상피 세포의 살아있는 세포 이미징의 예제는 그림 3에 표시됩니다. 건강하지 못한 세포가 종종 중단 막, 그리고 vacuoles의 과도한 번호 반면 건강한 세포는 부드럽고, 지속적인 멤브레인, 그리고 독특한 핵을 나타냅니다. 3D 매트릭스에서 하나의 상피 세포는 1 마이 그 레이션하고, 며칠에 걸쳐, 상피 세포의 매트릭스 2 시간 입체, 구형, 다중 세포 cysts를 형성하고 있습니다. 세포는 매우 동적이며, 낭종 (그림 3) 이내에 마이 그 레이션. 마이 그 레이션 세포 끼쳤다 견인 세력의 결과로 매트릭스 변형은 주변 행렬 (그림 4)에 포함된 추적 입자의 변위를 분석합니다. 추적 입자의 움직임은 다릅니다 최대 투사 이미지로 표시됩니다엔트 시간 점, 각 시점의 시간 (그림 4B)을 표시하는 의사 색입니다. 또는 개별 추적 입자의 이미지는 시간이 지남에 따라 추적 입자 (그림 4C)의 움직임을 보여주는 몽타주로 표시됩니다. 모든 이미지 분석 ImageJ를 사용하여 이루어졌다. 매트릭스 변형 이러한 질적 평가는, 따라서 마이 그 레이션 세포 끼쳤다 세력은 트랙션 힘의 분포의 유용 첫번째 근사치입니다. 3D로 마이 그 레이션 세포 끼쳤다 견인 세력의 양적 평가는이 프로토콜의 범위를 벗어납니다 등에서 3,4 설명되어 있습니다. 실험을 photobleaching 후 전형적인 형광 복구는 그림 5에 표시됩니다. 관심 지역은 건강하고 손상되지 않은 세포를 유지하면서 형광 강도가 가시, 배경 수준 (신호 대 잡음 비율을 극대화하기)에 비해 감소되도록 최적의 레이저 설정을 사용 photobleached해야합니다. 최적의 설정은 B한다각 FRAP 설정이 다른이므로 E는 경험적으로 결정 (예, FRAP를 사용하여 레이저를 스캐닝 공촛점 시스템). 포스트 FRAP 이미지 수집의 노출 시간 간격은 신중하게 배경 photobleaching을 피하기 위해 제어해야합니다. 낮은 레이저 파워, 짧은 노출 시간 및 민감한 카메라의 사용과 높은 효율적인 광학의 사용은 높은 품질의 FRAP 이미징을 위해 필수적입니다. 이미지 수집 중 표백 형광이 중요한 경우이 배경 페이딩은 계량 및 관찰 형광 강도 복구에서 정상화해야합니다. 환경의 3D 특성으로 인해, 형광 강도 복구의 Z - 구성 요소가 상당한 될 수 있습니다. 따라서, photobleached 지역의 전후 3D - 스택 이미지를 복용하여 photobleached 볼륨을 정의하는 것이 중요합니다. 또한 분석 및 형광 회복의 모델링은 다른 5,6 설명되어 있습니다. 라이브 세포 이미징 t의 독​​특한 조합echniques : GFP 매트릭스 변형 및 억제제의 추가를 모니터 cytoskeletal 단백질, 빨간색 형광 추적 입자의 역학에 따라이 단백질 역학, 견인 강제 및 분자 경로의 분석을 위해 동시에 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig1.jpg" /> 그림 1. 콜라겐 젤의 작성. 유리 바닥 접시에) Polymerized의 콜라겐 매트릭스. 젤의 핑크 색상이 포함된 형광 입자에 의한 것입니다. B) 절차 유리 표면에 콜라겐 젤 crosslink하는 유리 바닥 요리를 취급합니다. 첫째, 유리 바닥 요리는 3 Aminopropyltrimethoxysilane 솔루션, 유리 콜라겐 매트릭스를 crosslinks 후 글루 타 알데히드 솔루션으로 처리됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig2.jpg" /> 그림 2. FRAP / 공촛점 현미경 설정의 설계도. 공촛점현미경은 CoolSnap HQ II CCD 카메라와 자이스 혈구 AxioObserver에 따라 완전히 Slidebook 소프트웨어 (지능형 이미징 혁신)에 의해 자동으로 진행됩니다. 공촛점 단위 맞춤 설계되었습니다 두 레이저 사이를 전환할 밀리초를 허용하도록 Yokogawa 회전 디스크 장치 CSU10 및 음향 광학 조정할 수있는 필터 (AOTF) 두 고체 레이저 (50 MW 40 MW와 561 nm의와 488 nm의)에 따라. 방출 필터 (# 118661과 # 118085, 채도 기술) 50분의 525 NM 및 60분의 620 NM하고 이색성 거울 488-568 BrightLine 듀얼 밴드 (Semrock)입니다. 목표는 NA 1.1 및 0.62 mm의 작동 거리와 긴 작동 거리 40x C - 고차 색지움 목표 및 NA 1.4와 63x 계획 - 고차 색지움 목표 및 0.19 mm의 작동 거리입니다. 현미경은 광학 섬유 염료 레이저, 컴퓨터 제어 빔 위치와 강도, 그리고 회절 제한된 장소의 크기를 펌핑 구성되어 FRAP의 photoablation 시스템을 포함하고 있습니다. 또한 현미경을 갖추고있다각 축에 0.1 미크론 선형 인코더를 포함 XY 전동 무대. 시간 경과 이미징 동안 환경 온도 맞춤 설계된 현미경 챔버 및 피드백 온도 제어 히터에 의해 유지됩니다. 모든 소음 및 진동을 분리하려면 전체 현미경 시스템은 진동이없는 테이블에 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig3.jpg" /> 그림 3. GFP - 굴지 표현 상피 세포의 세포 이미징을 살고 있습니다. 이러한 세포는 3D 콜라겐 매트릭스에 문화 4 일 후에 낭종을 형성. 다른 낭종의 내부 (빨간색 화살촉) 내에서 마이 그 레이션하는 동안 일부 세포가 낭종 (노란색 화살촉)의 표면을 따라 이동합니다. 스케일 바 10 μm의, 시간 시간. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig4.jpg" /> 그림 4. 트랙션위원회에서 Rho - 키나제의 효과가 억제. G을 표현하는 마이 그 레이션 MDCK 세포) DIC 이미지FP는 핵 마커 태그. 이미지는 Rho - 키나제 억제제 Y - 27632의 치료 직전 찍은 거예요. 스케일 바 10 μm의. B) 입자 변위는 Y - 27632의 추가로 인한. 다양한 시간 포인트 (0-52 분)에있는 입자의 위치는 강도 규모에 따라 의사 색의했고 다음 하나의 이미지에 투영. 흰색 영역은 마이 그 레이션 세포에있는 GFP 긍정적인 핵이다. 스케일 바 10 μm의. 분 시간. 세포의 후행 가장자리 C) 입자 운동 (B의 화살표 참조). 별표 Y - 27632 또한 이전에 캡처된 마지막 프레임을 나타냅니다. 추적 입자는 각각 방향과 거리에서 마이 그 레이션하기 전에 세포의 후행 가장자리와 Y - 27632의 추가 이후에 옮겼습니다. 스케일 바 1 μm의. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig5.jpg" /> 그림 5. 3 차원 매트릭스의 세포 마이 그 레이션을 표현 GFP - 굴지의 FRAP 분석. 의) Timelapse 이미지 GFP -굴지의 ph​​otobleaching 전후의 세포를 표현. 휴대폰 뒤쪽에 축적된 GFP - 굴지의 작은 지역은 timepoint 0 (빨간색 화살촉) photobleached되었습니다. 시간 (초), 스케일 바 5 μm의. B) photobleached 지역 (실선)과 형광 복구 (원)의 기하 급수적인 적합의 평균 형광 강도는 시간이 지남에 꾸몄다. 형광 강도는 photobleaching 전에 초기 값을 정상화되었습니다.

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	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기서 우리는 3 차원 매트릭스의 세포 이주의 메커니즘을 연구 라이브 세포 이미징을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 성공은 안정적으로 GFP - 태그 단백질을 표현하는 &quot;좋은&quot;클론을 얻는 방법에 따라 달라집니다. GFP 단백질의 낮은 수준이 너무 높은 GFP 레벨 셀에 바람직하지 않은 부작용이되지만, 세포의 건강을 위태롭게 할 여분의 자극에 노출이 필요합니다. 따라서 세포에 유전...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 콜라겐은 소, 전을 입력합니다 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354,231 </td><td> 주식 3 MG / ML에 관한 </td></tr><tr><td> 3 aminopropyltrimethoxysilane </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 281,778 </td><td> 물에 희석 </td></tr><tr><td> 글루 타 알데히드 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 340,855 </td><td> PBS에 희석 </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres의 폴리스티렌 microspheres 1 μm의 빨강, 형광 (605분의 580) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></TR&gt; <tr><td colspan="4"> 문화 미디어 구성 요소 : </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

전통적으로, 세포 마이 그 레이션은 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에서 연구되었습니다. 그러나, 상처 치료, 조직 재생 및 암 전이 중요한 생물 학적 과정 동안 세포는 복잡한, 3 차원 세포 조직을 통해 이동해야합니다. 더 나은 이러한 생물 학적 과정의 배후 메커니즘을 이해하기 위해서는 세포 마이 그 레이션을 운전을 담당하는 단백질의 역할을 검토하는 것이 중요합니다. 여기, 우리는 상피 세포 라인을 (MDCK)를 사용하여 셀 마이 그 레이션의 메커니즘을 연구하기위한 프로토콜을 개요 및 모델 시스템으로 3 차원, 섬유, 자기 polymerizing 매트릭스. 이 광학 명확 세포외 매트릭스는 라이브 세포 이미징 연구에 쉽게 의무가 있으며, 더 좋은 방법은 생리, 부드러운 조직 환경을 모방한 것이었 지요. 이 보고서는 직접 단백질 현지화 및 역학을 시각에 대한 기술, 그리고 주변의 세 차원 매트릭스의 변형을 보여줍니다. 시험세포 공정 중에 단백질 현지화 및 역학 ination 단백질의 기능에 중요한 통찰력을 제공합니다. 유전자 인코딩 형광 태그는 단백질 현지화 및 역학을 관찰에 대해 고유한 방법을 제공합니다. 이 기법을 사용하여 우리가 키 subcellular 축적을 분석할 수, 강제로 생성 매트릭스를 통해 세포 기동으로 실시간으로 cytoskeletal 구성 요소를. 또한, 서로 다른 파장 여러 형광 태그를 사용하여, 우리는 따라서 우리는 서로 다른 단백질이 비슷하거나 분기하는 역할을 가지고 있는지, 예를 들어, 테스트 수 있도록, 동시에 여러 단백질의 지방화를 검사할 수 있습니다. 또한, 찬란 태그 단백질의 역학은 (FRAP) 분석을 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하여 계량하실 수 있습니다. 이 측정 assays는 단백질 이동성과 방법을 안정적으로 단백질을 구속은 cytoskeletal 네트워크에 있습니다. 단백질 기능 억제제의 치료와 함께 라이브 세포 이미징을 결합함으로써,우리는 단백질과 마이 그 레이션 세포의 형태의 배포판에 실시간으로 변경 확인할 수 있습니다. 또한, 우리는 셀 마이 그 레이션하는 동안 행렬 변형을 시각화하기 위해 매트릭스 내에 포함된 형광 추적 입자의 사용과 라이브 세포 이미징을 결합하여. 따라서, 우리는 마이 그 레이션 세포는 강제로 생성 단백질을 배포하는 방법 시각화 수 있으며, 어디 견인 세력은 주변 매트릭스 끼쳤다 있습니다. 이러한 기술을 통해, 우리는 세포 이주의 메커니즘에 특정 단백질과 공헌의 역할에 가치있는 통찰력을 얻을 수 있습니다.

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Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K 조회수.  University of California, Davis. 이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

연구

생체공학

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

전도성 잉크의 평면 및 3 차원 인쇄

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

범용 실시간으로 깊은 조직 인간의 혈관 조영술과 기능 전임상 연구를위한 3 차원 광 음향 이미징 프로브를 손 개최

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

조직 공학 응용 프로그램에 대 한 제어 형태학과 3 차원 Poly(ε-caprolactone) 장비의 전기 글 녹아

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...