NSF (0,854,551)에 의해 기금을 마련했습니다.

1. 사전 실험 준비 <ol><li> 다음과 같은 솔루션을 (작품에 대한 표 1 참조) 준비 : () 1리터의 NFR (일반 개구리 벨소리), (B) 100 ML 10 % 염분, (C) 100 ML CMF (CA 2 + / MG 2 + - 무료 솔루션 ), (D) 1 ML ITS (인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄, 시그마 I1884), (E) 100 ML L-15 배양액 (F) 10 ML HCG (인간 chorionic 생식샘 자극 호르몬 시그마 CG-10), (g)는 100 ML K + - 내부 솔루션, 솔루션 1의 삼투 강도가 그 증기 압력 osmometer (예를 들면 Wescor 모델 # 5100C)를 사용하여 약 260 mOsM되어 있는지 확인하기 위해 확인해야 Amphotericin B.에 대한 (H) 100 ML K +-내부 솔루션 . </li><li> (B) 솔루션을 소독 필터링 및 (c). 솔루션 (A) (B)하며 (C) 4 ° C. 3 개월까지 저장할 수 있습니다 25 게이지 주사기 바늘과 주사기 필터를 통해 동결 건조 분말이 들어있는 유리 병에 1 ML deionized H 2 O를 추가하여 솔루션 (D)를 준비합니다. 이 최종 해결책 &#39;C30 일 동안 4 ° C에 보관. </li><li> 비커 나 플라스크에있는 모든 구성 요소를 결합하여 층류 후드에 솔루션 (전자)를 준비합니다. 최종 솔루션을 소독하고 멸균 원심 분리기 튜브에 10 ML aliquots을 전송 필터링 할 수 있습니다. -20 ° C.에 저장 </li><li> 25 게이지 주사기 바늘과 주사기 필터를 통해 동결 건조 분말이 들어있는 유리 병에 H 2 0을 deionized 10 ML을 추가하여 HCG (솔루션 (F)) 준비합니다. 이 최종 솔루션은 30 일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 접착 시아 노 아세틸렌 접착제와 유리 파스퇴르 피펫의 끝 부분에 Minutien 핀 (26002-10 좋아, 과학 도구)에 의해 적어도 두 개의 microdissection 도구를 제조. 피펫 약 0.5 cm의 끝을 지났 확장하는 핀의 날카로운 끝을 허용합니다. </li><li> 준비 문화 이틀전 일 다음 절차 번식을 유도. 평면 스와의 여성과 검게 착색되어 눈에 잘 띄는, 붉은 배설강을 관찰하여 Xenopus의 번식 - 준비 쌍을 식별남성의 전면 발 rface. 이 탈출 할 수 있도록 시간 순 각 개구리 하나는은 그물과 싱크에 복부 측면을 누른 상태로 유지합니다. 등쪽의 림프 주머니의 그물과 피하에 하나를 통해 솔루션 1 ML (F)를 주입. </li><li> 물을 대상 십갤런 탱크에서 함께 번식 쌍을 배치합니다. 동물 새로 마련 및 수정 된 알을 짓밟되지 않도록하려면 약의 메쉬 크기 ½ 탱크의 바닥 (그림 1A) 위의 &quot;장착되어 약 1-2인치와 스크린 층을 설치합니다. </li><li> 동물 amplexus에 있고 수정 된 계란이 화면 아래에있는 층 (그림 1b)에 관찰 될 때까지 12-48 시간에 방해받지 개구리 둡니다. </li><li> 탱크에서 동물을 제거하지만, 더 이상 최소 24 시간의 알은 그대로 두십시오. 개구리의이 한 쌍의 6 주 후에 다시 사육 할 수 있습니다. </li><li> 탱크의 바닥에서 배아를 느슨하게 4, 5 60x15 mm의 컬트로 전송10 %의 생리 (솔루션 B)를 포함 우레 요리. Niewkoop와 페이버 (ref. 20)의 계획에 따라 단계로 배아를 정렬하십시오. 유용한 배아 무대 22-24에 해당 될 것입니다. 그림 2B는 (약 무대 28) 유용 할 개발에 따라 너무 멀리있는 배아를 표시 할 경우 그림 2A는 약 스테이지 22 배아를 보여줍니다. 그것은 건강한 배아를 선택하는 것이 중요합니다 : 빛 갈색과 흰색 mottling과 외관에 부드러운되어있는이 이상적입니다. 큰 검은 색 또는 흰색 패치가 태아는 일반적으로 건강에 해로운되어 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2. Xenopus의 태아의 Microdissection <ol><li> 층류 흐름 후드, 라벨 내부와 약 절반 세 60x15 mm 멸균 문화 10 % 식염수에 요리 기입하고, CMF과 하나가 있습니다. </li><li> 10 %의 염분이 포함 된 요리 중 하나에 살균, 유리 파스퇴르 피펫 전송 5-10 단계 22-24 배아를 사용합니다. 스테레오 줌의 도움이 해부와후드 내부 ING 현미경 (10 × 접안 렌즈와 0.6-5 배)는 무균 # 5 포셉 (11251-30 좋아, 과학 도구)의 두 쌍을 사용하여 각 배아에서 젤리 코트와 vitelline 막을 제거합니다. (인물 3A 및 3B를 참조하십시오.) </li><li> 10 % 식염수의 나머지 2 요리를 통해 마지막으로 CMF를 포함하는 요리로, 한 번에 하나의 그들에게 전달하여 맨 배아를 씻으십시오. 각 전송을 위해 새로운 멸균 피펫을 사용하고 요리에서 요리에 전송 솔루션의 볼륨을 최소화합니다. </li><li> 회전 단계 1.5에서 만들었 microdissection 도구를 사용하여, 포셉 한 쌍의 완만하지만 단단히 각각의 배아를 개최하고, 신경 튜브과 동물의 가장 등쪽 부분에 위치하고 있습니다 연관된 myotomes를 제​​거합니다. 세 조각, 신경 튜브의 위치와 (그림 4A) 있도록 외부 단지 복부의 양쪽 끝에 한을 만들어이 작업을 수행합니다. 거리에 난황 granul에서 요리의 깨끗한 부분으로 각 해부 신경 튜브 / myotome 이동에스와 다른 부스러기 (그림 4B). 등쪽 - 복부 축, 그리고 신경 튜브와 myotomes의 위치는 그림 4에 표시됩니다. </li><li> 이 솔루션에서 15 분 정도 후 (CMF) 사용 포셉 해부 조직의 무료 색소 피부를 리프트 및 삭제합니다. 그들은 서로 (그림 4C)에서 dissociated 될 때 추가로 30-60 분 후, 세포는 &quot;모래 더미&quot;를 형성합니다. </li></ol> 3. 신경 근육 공동 문화의 작성 <ol><li> 문화 매체의 10 ML 튜브를 해동하고 무균 70 μl를 추가 ITS 35 NG / ML BDNF (시그마 B3795). </li><li> 라벨 및 멸균 35mm 문화 요리 (FD35-100 세계 정밀 계측기) 약 반 L-15 배양액 (솔루션 (E)), 해부하는 각 배아에 대한 하나를 채 웁니다. </li><li> 불꽃 위에 테이퍼 부분을 누른 상태 유리 파스퇴르 피펫의 각 끝을 쥐었고하여 도금 피펫을 제조. 에 대한 1로 끝을 분리 당겨0cm 후 약 0.2 mm의 팁을 얻을 수 있도록 끝을 중지. </li><li> 그린 솔루션의 양을 최소화 한 배아에서 &quot;모래 더미를&quot;빨아 도금 피펫을 사용합니다. 배양 접시의 바닥에 세포를 배출. 여러 줄에 플레이트 세포를. 도금 undifferentiated 세포를 (그림 5A 및 5B) 관찰. </li><li> 셀 시간이 접시에 부착 할 수 있도록 적어도 15 분 동안 방해받지 도금 세포의 요리를 둡니다. </li></ol> 4. 패치 클램핑 신경 근육 시냅스 <ol><li> 근육 세포가 스핀들 모양이되어 척추 뉴런이 긴 프로세스 (그림 6) 연장 : 문화에 12-24 시간 후, 도금 전지는 별개의 형태학의 특성에 걸릴. neurite varicosities와 근육 세포 사이의 시냅스 기능 연락처를 동시 페어링 electrophysiological 레코딩을 확인 할 수 있습니다. &quot;M&quot;, &quot;S&quot;와 &quot;V&quot;는 neuronal, 근육 세포를 각각 참조소마와 presynaptic varicosity. </li><li> presynaptic varicosity 한과 근육 세포에 대해 하나 : 기록을위한 두 패치 전극을 준비합니다. </li><li> presynaptic 전극 들어, 다음과 같이 amphotericin 함유 솔루션을 준비 : 5 밀리그램 amphotericin B (시그마 A4888)를 포함하는 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 100 μl DMSO를 추가합니다. 10 초에 소용돌이이 솔루션입니다. 다음으로, Amphotericin B (솔루션 (H))에 대한 + - 내부 솔루션 625 μl K가 포함 된 두 번째 microcentrifuge 튜브에이 솔루션을 10 μl를 추가합니다. 위와 같이 와동. </li><li> amphotericin 함유 K 단계 4.3에서 조리 + - 내부 솔루션과 K +-내부 솔루션 (솔루션 (g))과 후 신경 전극과 미리 신경 전극을 입력합니다. </li><li> NFR과 배양 접시에서 미디어를 교체하고 위상 대비 광학가 장착 역 현미경으로 변경합니다. </li><li> 단지 각각의 목표 위의 두 전극을 배치합니다. 전체 셀 공동을 확보varicosity 전극으로 구멍 패치 구성하기 전에 근육 세포 전극과 nfiguration. </li><li> 시냅스의 기능을 확인하려면, 소프트웨어 제어하에 (예 : Axopatch 200B, 분자 장치) 패치 클램프 증폭기로 varicosity을 depolarize (pCLAMP 9, 분자 장치의 예)와 동시 presynaptic과 postsynaptic 전류를 관찰합니다. 그림 7은 본 전류를 보여줍니다 40 뮤직 비디오에 -30 뮤직 비디오에서 10 뮤직 비디오 단위의 presynaptic varicosity에게 전압의 단계를 depolarizing에 대응 인치 presynaptic 셀에 볼 안쪽으로 전류가 그렇단 + 및 CA 2 +와 K +를하여 외부 전류에 의해 실행됩니다. postsynaptic 셀에 기록 된 전류는 varicosity에서 출시 된 신경 전달 물질에 반응하고 nicotinic 아세틸 콜린 수용체 채널을 통해 오세영의 +에 의해 주로 수행하고 있습니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

motoneurons 및 근육 세포의 성공적인 공동 배양의 주요 단계를 적절하게 Xenopus 개구리 유도 사육에서 생산 배아를 조작의 사용 및 undifferentiated 척추 뉴런과 myoblasts의주의 무균 해부 있습니다. 빨리 자주 개발을 halts 이동로가 약 정도 (10) 개최에 도달 할 때까지 수정 된 달걀은 그대로 남아있을 것입니다. 건강한 태아는 부드러운 모양과 갈색과 흰색 얼룩덜룩 한 색소에 의해 식별됩니다. 이 근세포가 크게 차별화 한 단지 신경 튜브 닫히면 후에 전에 개발 중에 지점이기 때문에 스테이지 22-24 태아가 가장 유용합니다. 또한, 이전 배아의 세포는 CMF에 잘 해리하지. 그 배에 강력하게 준수로 vitelline 막 제거 할 때주의가 필요합니다. 배아는 그대로 나옵니다 있도록 막은 날카로운 집게를 사용하여 해체해야합니다. 또 다른 중요한 precaution은 배양 접시 (오히려이 정착 두는 것보다)의 하단에 세포를주의 깊게을 배치하는 것입니다. 이 세포가 배양 접시를 준수 될 확률이 높아집니다으로이 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 신경과 근육 사이의 기능 neurotransmission 단 postsynaptic 기록으로 결정 할 수 있으며, 자주 innervation 후 자발적인 근육 수축의 관찰에 의해 ascertained 수 있습니다. 취소 innervated 근육 세포는 문화에 경련하지 않습니다. 혼자 Postsynaptic 녹음이 미니어처 endplate 전류 또는 전위하지만 evoked 출시 측정 사전 및 postsynaptic 전류 presynaptic 자극, 그리고 상관 관계 패치 - 클램프 더블을 필요로 필요를 기록하는 데 유용합니다. 여기에 설명 된 페어 - 패치 녹화 방법 외에,이 준비는이 수있는 neuronal 소마 5 삼분의 일 피펫을 소개 할 수있는 기회를 제공하는 행위 가능성이 THA의 생성t는 presynaptic varicosity에 전파하고 신경 전달 물질의 방출을 유도 할 수 있습니다. 또한, 중재 할 생각이 신경 전달을 조절 아르 putative 대리인은 시냅스의 양쪽에 도입 될 수있다 : 근육 세포 피펫을 통해 또는 소마에 배치 삼분의 일 피펫의 확산을 통해.

<table border="1"><tbody><tr><td> 장비 / 용품 </td><td> 공급 업체 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td></td></tr><tr><td> 인슐린 트랜스페린 - 셀레늄 </td><td> 시그마 </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 Chorionic 생식샘 자극 호르몬 </td><td> 시그마 </td><td> CG-10 </td><td></td></tr><tr><td> 증기 압력 Osmometer </td><td> Wescor </td><td> 5100C </td><td></td></tr><tr><td> Minutien 핀 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 26002-10 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> 시그마 </td><td> A4888 </td><td></td></tr><tr><td> 집게 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11251-30 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 솔루션 이름 </td><td> 조리법 </td></tr><tr><td> (A) NFR (일반 개구리 벨소리 (MM)을 </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, 1.8 CaCl 2, 5 오세영 + - HEPES, pH를 7.35. </td></tr><tr><td> (B) 10 % 염분 </td><td> 10 ML NFR 90 ML은 H 2 O를 deionized </td></tr><tr><td> (주) CMF (CA 2 + / MG 2 + 무료 솔루션) </td><td> 125 NaCl, 2 KCl, 1.2 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5 오세영 + - HEPES, pH를 7.35. </td></tr><tr><td> (E) L-15 문화 미디어 </td><td> 50 ML L-15 미디어 (시그마 L1518) + 50 ML의 NFR. </td></tr><tr><td> (g) K +-내부 솔루션 (MM)을 </td><td> 116 KCl, 1 NaCl, 1 MgCl 2, 10 EGTA, 5 HEPES, pH를 7.3 </td></tr><tr><td> Amphotericin B에 대한 (H) K +-내부 솔루션 (MM)을 </td><td> 52 K 2 SO 4, 38 KCl, 1 EGTA, 5 HEPES, pH를 7.3 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table> TablE 1.

simultaneous pre- and post-synaptic electrophysiological recording from xenopus nerve-muscle co-cultures

신경 전달 물질의 방출과 presynaptic 이온 전류의 커플 링에 대한 많은 정보는 특히 invertebrate 준비, 오징어 거대한 시냅스 1 일부터 취득했습니다. 그러나, 준비를 제외하고 여기에 설명 된, 몇 가지 척추의 준비는 신경 전달 물질 자료와 presynaptic 이온 전류의 동시 측정을 할 수 있습니다있는 존재합니다. (때까지 12-24시간 내에 기능 시냅스를 형성하고, 며칠 동안 신경과 근육 세포 개발과 신경의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수있는, 배아 Xenopus의 motoneurons와 근육 세포는 실온에서 간단한 문화 매체에서 함께 성장하실 수 있습니다 전면에 자라 난)가 발생합니다. 다른 척추 동물의 준비 이상이 공동 문화의 장점은 준비의 단순함, 상온에서 문화와 작업을 유지 할 수있는 능력, 2를 형성 시냅스의 준비 접근성을 포함-4. 준비는 presynaptic 이온 채널과 송신기 릴리스 5-8의 규정에의 biophysical 속성을 공부하고 널리 사용되었습니다. 또한, 준비는 9-12 neurite 가지와 synaptogenesis 연구, 신경 전달 물질 릴리스 13-15, neuromodulation 16,17의 diffusible 메신저의 역할의 분자 메커니즘, 그리고 체외 신경 소성 18 등 다른 용도로 자신을 빌려하고 있습니다 - 19.

그림 4B는 즉시 22 Xenopus의 배아. 그림 4C 그, CA 2 +-MG 2 + 무료 솔루션 피부 제거 및 부화 (CMF, 솔루션 후 (표시하는 단계에서의 제거 후 코드 / myotome 격리 된 척추의 등보기를 보여줍니다 C)), 셀은 &quot;모래 더미&quot;로 해리와 도금을위한 준비가되어 있습니다. 문화 매체 세포에 도금 약간의 형태학의 변화 (그림 5B)를 전시하지만, 문화에 이십사시간 후 독특한 모양에 걸릴 즉시. 뉴런이 확장 neurites하면서 구형 유지하면서 근육 세포는 스핀들 모양이 될 근육 세포와 시냅스 (그림 6)에서 정교한 varicosites.주세요 presynaptic varicosity과 postsynaptic 근육 세포 (그림 7)에서 동시 페어링 패치 녹음이 신경 전달 물질의 방출과 resulta과 관련된 presynaptic 안쪽과 바깥쪽으로 전류를 보여NT postsynaptic 전류를 흥분성의. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1 A :.. 화면 꼭대기에 결합 양동이의 개구리 사육 쌍 B : 수정 된 계란과 amplexus에 개구리. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2 A :.. &quot;적합&quot;단계 22 배아 B : &quot;적합&quot;단계 28 배아. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3 :. 스테이지 22 배아 vitelline 막과 젤리 코트의 제거 전에. 화살표는 젤리 코트의 바깥 쪽 가장자리로 가리 킵니다. vitelline 막이 embr에 밀접하게 준수야와 거의 보이지 않는 B는 :. 맨 배아. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4 A : 될 수있는 해부하는 부분 B를 나타내는 점선이있는 스테이지 22 배아 :.. 배의 심하게 격리 등쪽 부분을, &quot;D&quot;와 &quot;V&quot;는 배아의 등 및 복부 측면을 참조하는 동안 &quot;m&quot; 와 &quot;N&quot;은 mytomes과 신경 튜브의 대략적인 위치를 나타냅니다 C는 :. CMF에서 60 분 후 세포의 &quot;모래 더미&quot;. 스케일 바는 1 음, 그리고 B와 C에 대한 0.5 mm를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig5.jpg" alt="그림 5"/> 그림 5 A :. 바로 도금 후 문화에 세포의 5 배 전력 전망이 있습니다. B : 40x에서 같은 문화. 규모바 40 μm 및 B. 5 μm을 나타냅니다 <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig6.jpg" alt="그림 6"/> 그림 6. neuronal 소마 (S), presynaptic varicosity (V) 및 postsynaptic 근육 세포 (M)의 식별과 문화에 신경 근육 접합부. 규모 바 : 5 μm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7.jpg" alt="그림 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7highres.jpg"/> 10 MV 증분 전압의 응용 프로그램에 대한 응답으로 보는 그림 7. Presynaptic (위)와 postsynaptic (하단) 전류가 -30 뮤직 비디오에서 40 뮤직 비디오에 presynaptic varicosity에 제출 단계를 반복합니다. 전압 단계는 presynaptic 흔적의 일부 옆에 표시됩니다. 두 세포의 개최 가능성은 -70 MV했다.

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Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

이 동영상은 배아의 주 문화를 성장하는 데 사용되는 절차를 설명합니다<em&gt; Xenopus</em&gt; 신경과 근육 세포와 동시 사전 및 사후 신경 패치 클램프 녹음을 만들기위한이 준비 유용성.

동시 사전 및 사후 신경 Electrophysiological 녹화에서<em&gt; Xenopus</em&gt; 신경 근육 공동 문화

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

simultaneous-pre-post-synaptic-electrophysiological-recording-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

10.8K 조회수.  David Geffen School of Medicine at UCLA. 이 동영상은 배아의 주 문화를 성장하는 데 사용되는 절차를 설명합니다 Xenopus 신경과 근육 세포와 동시 사전 및 사후 신경 패치 클램프 녹음을 만들기위한이 준비 유용성.

비디오: Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

포스트 - 나탈 Murine 조직의 공동 문화를 Myelinating 풍부한 Oligodendrocyte 문화와 Oligodendrocyte / 신경 세포의 유도

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

연구

신경과학

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

에서 신경 Explant의 문화<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

온전한 성인 Zebrafish의의 뇌에 전기 생리학 기록

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant characteristics.&#160;This precludes a rational selection of a particular implant as optimal for a particular application and the development of new materials based on the most critical performance parameters.&#160;This article develops a protocol for in vitro and in vivo testing of neural recording electrodes.&#160;Recommended parameters for electrochemical and electrophysiological testing are documented with the key steps and potential issues discussed.&#160;This method eliminates or reduces the impact of many systematic errors present in simpler in vivo testing paradigms, especially variations in electrode/neuron distance and between animal models.&#160;The result is a strong correlation between the critical in vitro and in vivo responses, such as impedance and signal-to-noise ratio.&#160;This protocol can easily be adapted to test other electrode materials and designs.&#160;The in vitro techniques can be expanded to any other nondestructive method to determine further important performance indicators.&#160;The principles used for the surgical approach in the auditory pathway can also be modified to other neural regions or tissue.

Different electrode coatings affect neural recording performance through changes to electrochemical, chemical and mechanical properties. Comparison of electrodes in vitro is relatively simple, however comparison of in vivo response is typically complicated by variations in electrode/neuron distance and between animals. This article provides a robust method to compare neural recording electrodes.

신경 기록 전극의 체계적인 전기 및 전기 생리 평가를위한 방법

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

에서 전기 생리학 기록<em&gt; 초파리</em&gt; Labellar는 Sensilla 맛

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the electrical responses of the retina to light stimulation, while the VEP measures the corresponding functional integrity of the visual pathways from the retina to the primary visual cortex following the same light event. The ERG waveform can be broken down into components that reflect responses from different retinal neuronal and glial cell classes. The early components of the VEP waveform represent the integrity of the optic nerve and higher cortical centers. These recordings can be conducted in isolation or together, depending on the application. The methodology described in this paper allows simultaneous assessment of retinal and cortical visual evoked electrophysiology from both eyes and both hemispheres. This is a useful way to more comprehensively assess retinal function and the upstream effects that changes in retinal function can have on visual evoked cortical function.

This protocol describes simultaneous measurement of electroretinogram and visual evoked potentials in anesthetized rats.

전위도의 동시 녹화 및 마취 된 흰쥐의 비주얼 사건 관련 전위

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the ...