이 작품은 (TMD, JDL 및 ATS에) NIH / NINDS 부여 R01NS070159에 의해 지원되었다.

모든 실험 절차는 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소와 엄격한에 따라 실시하고, 검토, 승인 및 조지아 기관 동물 관리 및 사용의 대학에 의해 우연히 목격 된 프로토콜 번호의 A2011 09-003을 관찰 하였다 위원회. 1. 장비 설치 <ol><li> 개두술에 대한 재관류 시스템 성인의 고정화는 물고기에 용해 된 산소를 전달하는 삽관 시스템을 필요로한다. 시스템의 다양한 활용 될 수 있지만, 60 ㎖의 주사기로 이루어진 단순한 중력 시스템이 사용된다. 일관 ~ 1 ㎖ / 분의 유속을 산출 높이로 압력을 상승 헤드. 이 주사기는 전기 생리 관류 시스템에 사용되는 주사기와 직렬로 배치 될 수있다. <ol><li> 하나의 60 ML 루어 락 주사기 튜브를 얻고 플런저를 제거합니다. </li><li> 약 8 &amp;에 주사기를 일시 중단# 160; 클램프를 사용하여 링 스탠드의베이스 위. </li><li> 주사기의 끝 단방향 스톱 콕을 연결한다. 꼭지의 반대쪽에, 삽관 기지로 확장 할만큼 긴 튜브의 조각, 직경 2 ㎜를 연결합니다. </li></ol></li><li> 전기 생리학에 대한 재관류 시스템 전기 생리 실험의 경우, 실험 과정 동안 다양한 화합물을 도입하는 것이 필요하다. 시스템의 다양한 사용할 수 있지만, 시리즈 60 ㎖를 주사기로 이루어진 중력 시스템이 사용될 수있다. 이 설정은 해당 마개를 열어 수행 할 수있는 솔루션의 간단한 직렬 소개 할 수 있습니다. <ol><li> 두 개 이상의 60 ML 루어 락 주사기를 확보하고 각에서 플런저를 제거합니다. 하나의 주사기는 이후의 각 튜브 물고기에 약물 다양한 화합물을 관리하는 데 사용할 수있는 반면, 물고기 서식지의 물을 관리하는 데 필요합니다. </li><li> 3 각 주사기를 연결합니다 -방법 루어 연결 꼭지. </li><li> 한쪽 끝에서 남성 루어 잠금 장치 시리즈에 주사기를 연결하는 외부 직경 (OD) 튜브의 ⅛를 사용합니다. </li><li> 압력 헤드가 상기베이스 (27)의 높이, 또는 지속적 ~ 1 ㎖ / 분의 유속을 산출 높이까지 상승되도록 장치를 고정. </li></ol></li><li> 삽관 캐뉼라 삽관 정맥 물고기 유체의 도입을 용이하게한다. 이 설정은 가장 좋은 위치에 동물의 입 안에 정맥에 유연성과 탄력을 모두 제공합니다. <ol><li> 가위의 일반 쌍 (예.는 Fiskars) 또는 면도날을 사용하여 P-200 피펫 팁의 넓은 끝에서 1.5 cm의 부분을 제거합니다. </li><li> Tuohy BORST 어댑터 즉 여성 루어 잠금 캡과 실리콘 페룰와 감압 밸브에 튜브의 6cm X 1mm의 조각을 삽입하고 수정 피펫 팁으로이 캐 뉼러를 삽입합니다. 루어 L와 위치에 피펫 팁을 잡고직경의 튜브에 ⅛의 짧은 부분을 사용하여 옥토퍼스. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51065/51065fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51065/51065fig1.jpg" /> 그림 1 </li></ol></li><li> 삽관 법의 기본 이 접시는 안정된 직립 위치에 고정화 동물을 보유하고 삽관 통해 동물들이 유체의 제거를 용이하게하기 위해 사용된다. 이가 올바르게 설정되지 않은 경우, 풀링은 전기 생리학 녹음에 방해가 진동 신호로 이어지는 발생할 수 있습니다. <ol><li> 100mm X 15mm 플라스틱 페트리 접시의 기본 요리를 얻습니다. </li><li> 납땜 도구를 사용하여 접시의 측면에 구멍 직경 6mm와 림 립 아래 7.5 mm를 용융. 같은 도구를 사용하여, 구멍 직경 10 ㎜, 요리의 입술 아래 11mm ~ 74 ° 시계 반대 방향으로 녹아<html> 작은 구멍. 이 구멍은 배수 구멍이 될 것입니다. </li><li> 튜브 삽입 단부와 구멍에 직경 1cm는 끝이 차단 될 수 없다는 등을 해제. 그런 다음 작은 구멍에 P-200 Pipetteman 팁을 삽입,이 더미 정맥이 될 것입니다. </li><li> 약간 큰 구멍의 측면에 상승 페트리 접시로, 정맥 구멍이 약간 덮여 있도록 접시에 녹은 통조림 왁스를 붓는다. 이 지역은 정맥이 물고기의 입으로 ~ 3mm 삽입 할 수 있도록 정지 될 것입니다. 이 세트의 최대 응고 허용되어야한다. </li><li> 화염 가열 금속 가장자리를 사용하여, 채널이 캐뉼라의 선단에서 시작하여 약 1-2 인치 연장되도록 물고기를 보유하는 채널을 개척 <ol><li> 주의 배수 포트에 캐 뉼러 영역으로부터 연속 하향 각이 형성되는 것을 보장하기 위해주의해야한다.065fig2.jpg &quot;너비 =&quot;400px &quot;/&gt; 그림 2 </li></ol></li></ol></li><li> 관류 설치 <ol><li> 시작하기 전에 모든 기포를 제거하는 것을 보장, 서식지의 물을 살포 셋업을 세척하십시오. </li><li> 개두술 관류 설정에 ~ 30 ㎖의 0.016 % (630 μM) tricaine 솔루션을 추가하고 ~ 2 ㎖ 그 tricaine이 관류 개시에 동물에 전달됩니다 보장하기 위해 튜브를 통해 실행할 수 있습니다. 희석 단계 2.2를 참조하십시오. </li><li> 주요 관류 설치하려면 첫 번째 튜브에 서식지의 물 ~ 50 ㎖를 추가합니다. 나머지 튜브에 각각 원하는 실험 화합물을 추가합니다. </li><li> 삽관베이스의 작은 구멍에 정맥 설치를 놓습니다. </li><li> 단단한 나선형으로 42cm의 킴 와이프의 넓은 스트립에 1을 비틀 킴 와이프가 양쪽에 확장되도록 배수 튜브에 삽입합니다. 이 조직은 관류 액을 제거하는 심지 역할을하고 t 내 유체 상승을 방지하기 위해그는 전기 생리학 기록을 방해 할 수있는 기반을 삽관. </li><li> 하단 모두 관류 폐기물을 수집 할만큼 큰 불활성 접시에 확장 할 수 있도록, 페트리 접시의 큰 구멍에 튜브의 한쪽 끝을 삽입합니다. 이 요리는 설치에 대한 유출 저수지 역할을합니다. 일단 동물의 복부 지역 근처에 거짓말을 할 수 있도록 조직을 배치하고 하단 확장은 접시에 똑 수 있습니다. </li><li> 해부 현미경 근처에있는이 완료 삽관 법의 기초를 놓으십시오. tricaine 관류 튜브에 정맥의 루어 잠금 장치를 연결합니다. </li></ol></li><li> 모세관 바늘 전극 <ol><li> 실버 와이어 및 설정을 접지 같은 와이어의 15으로 구성되어야한다 보조 전극에 0.010에서 2.5로 구성된 기본 전극을 얻습니다. 보조 전극의 경우, 적합 할 수있는 납땜 팁, 실버 와이어 0.010의 섹션 15를 사용머리 단계의 뒷면. <ol><li> 염화물 이온으로 기본 및 보조은 와이어 팁을 전기 도금을한다. </li><li> 마이크로 피펫 풀러를 사용하여, &lt;15 밀리 옴의 저항과 얇은 벽, 붕 규산염 모세관 바늘을 빼냅니다. <ol><li> 2-3 2 M 염화칼륨 μL, 또는 부분적으로 실버 와이어의 염화 코팅 끝을 커버하기에 충분한와 모세관 바늘을 입력합니다. </li><li> 모세관 머리에 기본 전극을 삽입하고 전극 홀더에 장착. </li><li> 미세 조작기로 머리 단계를 장착 한 다음 두 번째 미세 조작기에 보조 전극을 탑재합니다. 각 전극의 설치, 최초의 위치로 한 다음 머리 단계의 뒷면에 보조 전극의 납땜 끝을 맞습니다. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2. 솔루션의 제조, 관류 시스템, 전기 생리학 녹음 장비 <ol><li> 서식지 물 1 L를 얻물고기 수족관에서. </li><li> 0.016 %의 T] tricaine 메탄 (tricaine) (630 μM의 50 ㎖) 24. <ol><li> 0.4 % 트리스 버퍼 tricaine, 산도 7.2의 나누어지는 해동. </li><li> 서식지의 물 47.9 ㎖의 0.4 % 트리스 버퍼 tricaine 2.1 mL를 넣고 섞는다. </li></ol></li><li> 원하는 수용성 실험 화합물 (예를 들어, 300 MM의 pentylenetetrazol, 일반적인 chemoconvulsant)의 주식 농도를 해동. </li><li> 링거액 1 ㎍ / μL의 pancuronium 브로마이드 나누어지는을 녹여. </li><li> 마취 및 서식지 물 실험 삽관 시스템을 모두 채우고 튜브에서 모든 거품을 제거하기 위해 적어도 충분히 배수. 거품이 동물의 질식을 선도, 유체의 흐름을 방해하기 때문에 수행해야합니다. <ol><li> 완전히 연결 튜브에 공기를 허용하지 않고 약물을 보유 할 관류 관 배수. </li><li> 0.016 % (630 μM) tricaine 솔루션 마취 튜브를 기입하고 exper를 배치실험 관류 시스템에 추가 튜브 (들) imental 화합물 (들). <ol><li> 실험 관류의 첫 번째 관은 서식지의 물을 포함해야합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 빈 60mm X 15mm 페트리 접시에 서식지 물과 장소에 작은 구멍 스폰지 십니다. 마취제를 주입하는 동안이 요리는 생선을 보관하는 데 사용됩니다. </li></ol> 3. 개두 <ol><li> 그것을하는 방식의 4 분의 3을 채우기 위해 15 X 60mm 페트리 접시에 630 μM의 tricaine 솔루션을 충분히 추가합니다. 채워진 접시의 무게를 측정. 상기 마취 복강 주입 될 수 있도록이 동물을 고정화하기 위해 사용된다. </li><li> 접시 포함 tricaine에 동물을 담그고 다시 접시의 무게. <ol><li> 물고기의 중량을 구하는 단계 1과 2의 가중치의 차이를 뺀다. </li><li> 동물이 조용하고 대부분의 동작이 정지 될 때까지 tricaine 솔루션에 남아 있습니다. </li></ol></li><li> 넓은 포셉 한 켤레를 사용하여 물기가 스펀지에 물고기를 전송하고 가로 방향으로 배치합니다. 꼬리 물고기를 전송하면이 프로세스에 대해 잘 작동합니다. <ol><li> 해부 현미경으로 스폰지와 물고기를 놓습니다. </li></ol></li><li> 34 G 바늘을 포함하는 Nanofil 주사기로, 물고기의 무게의 1 ㎍ / g이되도록 충분히 pancuronium 브로마이드를 측정합니다. </li><li> 복강 Nanofil 주사기를 사용하여 pancuronium 브로마이드를 관리, 안정을 유지하는 물고기의 지느러미 측면을 따라 아이스 스틱을 사용. </li><li> 미세 집게를 사용하여, 아래턱으로 물고기를 잡아 빠르게 삽관베이스에 동물을 전송합니다. </li><li> 이 왁스 형태와 1mm 캐 뉼러가 입으로 삽입 될 수 있도록 등쪽에 근접되도록 동물을 배치. 물고기를 기동과 정맥 주위에 입을 열 미세 집게를 사용합니다. 때문에 삽관 트레이의 화장에, 정지가 가능, 기본으로 설계되었다정맥은 물고기의 입에 3mm를 삽입 할 수 있습니다. <ol><li> 일단 위치, tricaine을 포함하는 중력 공급 살포 튜브를 켭니다. </li></ol></li><li> Kimqipe 조직의 3cm 2 부분을 잘라 서식지 물을 적시고. <ol><li> 건조를 방지하기 위해 동물을 통해 조직을 놓습니다. 킴 와이프 ​​섹션은 또한 동물 지느러미해서 들고 돕기 위해 위치 될 수있다. </li></ol></li><li> 해부 현미경, 광학 tectum을 덮고있는 두개골의 ~ 2mm 2 섹션을 제거하기 위해 베나 스프링 가위를 사용합니다. 이 지역은 눈 뒤에 앉아 어두운, 뼈 판처럼 보인다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51065/51065fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51065/51065fig3.jpg" width="400px" /> 그림 3 <ol><li> 판의 가장자리에있는 베나 가위 중 하나 블레이드를 삽입하고에 침투 할 수있을 정도의 충분한 힘으로 밀어뇌를 관통하지 않고, 뼈 테. 뼈를 싹둑 가위를 닫습니다. </li><li> 뼈 조각을 제거합니다. </li><li> 모든 혈액이 존재하는 경우에, 킴 와이프의 에지를 이용하여 제거한다. 일반적으로 출혈하는 것은 곧 뇌 수술을 수행 한 후 정지합니다. </li></ol></li></ol> 4. 전기 생리학 <ol><li> 삽관 스톱 콕을 차단하고 신속하게 tricaine 물방울에 삽관베이스를 연결하는 루어 잠금 장치를 분리합니다. <ol><li> 전기 생리학 현미경에 그대로 삽관 설정을 이동하고 관류 시스템에 연결합니다. </li><li> 서식지의 물을 켜고 tricaine을 세척하기 위하여, ~ 1 시간 동안 1 ㎖ / 분의 속도로 perfuse. </li></ol></li><li> 전극 팁은 동물의 콧 구멍으로 또는 위턱 뒤에 딥에 삽입 될 수 있도록 카메라 제어 하에서 미세 조작기를 사용하여, 보조 전극을 위치. </li><li> 개두술 개방에 기본 전극 바늘을 삽입합니다. 삽입팁은 광섬유 tectum 내의 상당히 피상적 위치하도록, 조직으로 바늘. <ol><li> 전극이 더 깊어 경우, 전기 신호가 작을 수있다. </li></ol></li><li> 상환과 주 및 보조 기준 전극 사이에 기록 된 전기 차를 분석한다. 이 프로세스는 얻어지는 세포 레코딩을 허용한다. <ol><li> 0.1 kHz의 로우 패스 필터 및 1 Hz의 고역 통과 필터와, 5 kHz 샘플 레이트에서 갭이없는 모드에서 데이터를 수집. </li><li> 서식지의 물이 45 분의 최소 관류 때까지 전기 생리학 활동 기록을 시작하지 마십시오. </li><li> 이전의 실험적인 약의 추가에 적어도 15 분 동안 기본 활동의 기준을 기록합니다. 원하는 시간에 대한 선택과 기록의 실험 약물 관류를 시작합니다. 건강한 제제에서는, 2-3 시간 동안 신경 활동을 기록 할 수있다. </li></ol></li></ol> 5. 정리 </P&gt; <ol><li> 실험의 끝에, 두개골 및 비공으로부터 전극을 제거하고 삽관 설정을 제거한다. <ol><li> 미국 수의학 협회 (AVMA) 동물의 안락사 (2013)에 대한 지침에 의해 설명 된대로, 관습에 따라 tricaine를 사용하여 약물 과다 복용으로 동물을 안락사. </li><li> 안락사 할 지브라 피쉬가 200-500 ㎎ / L.에서 tricaine 용액에 배치해야 물고기들이 죽음을 보장하기 위해 안락사 (자궁 절개)의 물리적 수단을 실시하고, 그 후에 리듬 아가미 활성의 정지 후 10 분간의 최소, 대 용액에 남아하여야한다. </li></ol></li><li> 재관류 설정에 삽관베이스를 연결하는 루어 잠금을 해제합니다. 적절한 폐기 관류 시스템에 남아있는 액체를 수집합니다. <ol><li> 모든 튜브를 통해 DI 물을 실행하고 위험한 경우, 적절한 처리를 위해 수집합니다. </li></ol></li><li> 재관류 시스템을 소독하기 위해 R,유엔 70 % 에탄올 모든 튜브를 통해 적절한 처분을 위해 수집합니다. <ol><li> 공기 건조를 용이하게하기 위해 열린 위치에 각각의 튜브 스톱 코크를 남겨주세요. </li><li> 70 % 에탄올에 전극을 담가 건조한 공기 수 있습니다. </li></ol></li><li> 날카로운 물건 용기의 주 전극에 사용되는 모세관 바늘 폐기하십시오. </li><li> 삽관 설치를 해체하고 물을 모든 조각을 씻어. <ol><li> 70 % 에탄올로 각 조각을 청소하고 건조한 공기 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Henze, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+features+predicted+by+extracellular+recordings+in+the+hippocampus+in+vivo.">Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo.</a> J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).</li><li>Gabriel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+pattern+in+the+adult+zebrafish+spinal+cord+in+vitro.">Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro.</a> J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).</li><li>Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+brain+in+research+and+teaching:+a+simple+in+vivo+and+in+vitro+model+for+the+study+of+spontaneous+neural+activity.">The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity.</a> Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).</li><li>Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inexpensive+device+for+non-invasive+electroretinography+in+small+aquatic+vertebrates.">An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates.</a> J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).</li><li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects.">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).</li><li>Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior,+neural+activity+and+c-fos+expression.">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. 131, 759-768 (2005).</li><li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+mutagenesis+screen+to+identify+seizure-resistant+zebrafish.">A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish.</a> Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).</li><li>Maximino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , (2012).</li><li>Bally-Cuif, L., Vernier, P., Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fish Physiology: Zebrafish. 29, (2010).</li><li>Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orexin/hypocretin+system+in+zebrafish+is+connected+to+the+aminergic+and+cholinergic+systems.">The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems.</a> J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).</li><li>McLean, D. L., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+innervation+patterns+of+dopaminergic,+noradrenergic,+and+serotonergic+neurons+in+larval+zebrafish.">Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).</li><li>Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+central+nervous+cholinergic+system+of+a+neurogenetic+model+animal,+the+zebrafish+Danio+rerio.">The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio.</a> Brain Res. 1011, 156-169 (2004).</li><li>Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+properties+of+spinal+interneurons+in+embryonic+and+larval+zebrafish.">Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).</li><li>Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Functional+Connectivity+between+Neuronal+Ensembles+with+Larval+Zebrafish+Transgenic+for+a+Ratiometric+Calcium+Indicator.">Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator.</a> Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).</li><li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+statistical+methods+enhance+imaging+of+cameleon+fluorescence+resonance+energy+transfer+in+cultured+zebrafish+spinal+neurons.">New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).</li><li>Burgess, H. A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+gating+in+larval+zebrafish.">Sensorimotor gating in larval zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 4984-4994 (2007).</li><li>Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+retinal+pathways+drive+spatial+orientation+behaviors+in+zebrafish+navigation.">Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation.</a> Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).</li><li>Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+neurobiology:+how+larval+fish+orient+towards+the+light.">Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light.</a> Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).</li><li>Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+acuity+in+larval+zebrafish:+behavior+and+histology.">Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology.</a> Front. Zool. 7, 8 (2010).</li><li>Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+and+motor+control+over+the+last+decade.">Zebrafish and motor control over the last decade.</a> Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).</li><li>Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+evidence+of+GABAA+and+GABAC+receptors+on+zebrafish+retinal+bipolar+cells.">Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells.</a> Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).</li><li>Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+evidence+of+GABAergic+neurons+in+parts+of+the+brain+of+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).</li><li>Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+regulation+of+odorant+receptor+gene+choice+and+subsequent+axonal+projection+of+olfactory+sensory+neurons+in+zebrafish.">Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).</li><li>Lazarova, M., Samanin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiation+by+yohimbine+of+pentylenetetrazol-induced+seizures+in+rats:+role+of+alpha+2+adrenergic+receptors.">Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors.</a> Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).</li><li>Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+technical,+biological+and+pharmacological+factors+in+the+laboratory+evaluation+of+anticonvulsant+drugs.+III.+Pentylenetetrazole+seizure+models.">The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models.</a> Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).</li><li>DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+neurotoxicity+of+pyrethroid+insecticides+in+zebrafish+embryos.">Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos.</a> Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).</li><li>Arnolds, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+effects+of+tricaine+on+the+supramedullary/dorsal+neurons+of+the+cunner,+Tautogolabrus+adspersus.">Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus.</a> Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 프로토콜은 생체 내 성인 지브라 피쉬의 신경 활동을 측정하는 데 사용되었다. 기록 된 활동의 특성 (진폭 및 이벤트의 모양) 개별 물고기에 따라 다를 수 있지만 연습으로, 신경 활동은 지속적으로 관찰 할 수있다. 세포 녹음 기술의 활용이 관찰을 설명 할 수 있습니다. 상기 방법은 제 1 지역 내의 다수의 셀의 동시 모니터링을 제공하므로 주 전극의 위치에서의 변화는 관찰 활?...

이 글에서, 프로토콜은 성인 제브라 피쉬의 신경 활동의 생체 내 녹음에 얻기위한 설명되어 있습니다. 세포 외 기록 방법은 신경 조직의 소 영역 내의 전기적 활동의 전압 측정을 제공하는 데 사용된다. 조사의이 방법은 동물 행동 하나에 다수의 셀을 모니터링하는 것을 포함한다. 이전 슬라이스 녹음은 아이 컵 준비 및 전위도 녹음이로, 성인과 유충 모두에서 수행되었다. 이 실험은 대부분 다양한 감각 시스템 2-5의 생리적 반응은 세부 사항을 수행하고 있습니다. 최근까지 그대로 뇌의 준비는 호흡과 산소 확산이 피부를 통해 발생할 수있는 제브라 피쉬의 유충 3,6,7,와 전기 생리학을 수행 할 수 있었다. 우리의 준비는 동물이 O를 완전히 의식과 인식 남아있는 동안 성인 제브라 피쉬의 기본 신경 활동을 측정 할 수 있습니다F 그 주변. 제브라 피쉬 (다니오 rerio)는 현재, 유전 독성, 약물 및 physiopathological 연구 3에 대한 모델로 기본적인 역할을한다. 그들은 유전, 신경 및 내분비 레벨 8의 포유 동물과 광범위한 동성을 공유하고 있기 때문에, 제브라 피쉬의 신경 과학 분야 내에서 가시성을 얻고있다. 지난 10 년간 표준 neuroanatomic과 면역 조직 화학 기술은 제브라 피쉬의 신경 9-12의 다른 신경 전달 물질 3,8,13의 분포의 상세한 특성 조직을 결정하는 데 사용되었다. 최근 연구자들은 행동 프로세스 16-19 감각 시스템 2,13,20의 전기 생리학 특성을 중심으로 많은 중 기능 연구 (14, 15), 자신의 포커스를 이동했다. 이러한 연구의 소수 Adul 5의 특정 영역의 전기적 활성도에 집중했다제브라 피쉬 뇌 21-23 톤 있지만 생체 내 접근법을 사용하여 수행되지 않았다. 이 프로토콜은 특정 뇌 영역에서 활동의 패턴을 설명하기 위해 제브라 신경계 내의 모두 자발적이고 유발 활성의 전기 생리학 연구에 적용 할 수있다. 이 기술의 사용은 비교가 젊은 유생 단계와 성인의 신경 활동 사이에 할 수 있습니다. 또한, 우리의 프로토콜은 유전자 또는 약물 학적 변화 사이의 비교를 허용합니다. 함께 같은 유전 공학 또는 약물 테스트와 같은 다른 접근 방법으로,이 방법은 늦게 발병 간질이나 신경 퇴행성 과정을 공부하는 등의 잠재적 인 응용 프로그램에 대한 신경 세포의 통신 및 소성 그대로 동​​물 성인뿐만 아니라의 기능 분석을위한 새로운 가능성을 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:91px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:111px;">2750HC</td>
			<td style="width:132px;">Dilute 100% to 70% with DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">2 M Potassium Chloride</td>
			<td style="width:91px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">2 M Sodium Chloride</td>
			<td style="width:91px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:111px;">3624-05</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:207px;">0.4% Tris-Buffered Tricaine</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">E10521</td>
			<td style="width:132px;">pH 7.2-7.4; stored at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">Pancuronium Bromide</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1918</td>
			<td style="width:132px;">Diluted to 1 &#956;g/&#956;l in 1x phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:207px;">Habitat water</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 &#956;S; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">Pentylenetetrazol</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P6500</td>
			<td style="width:132px;">Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:207px;">Nanofil syringe</td>
			<td style="width:91px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">06A</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:207px;">34 G Beveled needle</td>
			<td style="width:91px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">NF34BV</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Sponge</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Small pore and chemical-free</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:207px;">Foam-backed fine sand paper</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">5 x 5 cm2 is large enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">9 V Battery</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">Wires with alligator clips</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Need 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">37 cm x 42 cm Kimwipe</td>
			<td style="width:91px;">Kimberly-Clark Professional</td>
			<td style="width:111px;">TW31KEM</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">11 cm x 21 cm Kimwipe</td>
			<td style="width:91px;">Kimberly-Clark Professional</td>
			<td style="width:111px;">TW31KWP</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">1/8 in diameter tube</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">1 cm diameter tube</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">1 mm diameter tube</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule</td>
			<td style="width:91px;">Qosina</td>
			<td style="width:111px;">51505</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Microscope (Leica MZ APO)</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Another microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:207px;">Vanna scissors</td>
			<td style="width:91px;">Roboz Surgical Instruments Co., Inc.</td>
			<td style="width:111px;">15018-10</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:207px;">60 ml Luer lock syringe tubes</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:111px;">309653</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">3-way Stopcocks with Luer connections</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">1-way Stopcock with Luer connection</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">NC9299146</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">S67961</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">4 in Borosilicate capillary tube</td>
			<td style="width:91px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">TW100F-4</td>
			<td style="width:132px;">Can contain a filament to aid in filling with solution</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:91px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Digidata 1440</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Axon Aloclamp 900A</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Axoclamp software</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">HS-9Ax 1U headstage</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">0.010 in Silver wire</td>
			<td style="width:91px;">A-M Systems, Inc.</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Q-series electrode holder</td>
			<td style="width:91px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:111px;">QSW-A10P</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">10 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1 mm x 15 in Tubing</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:91px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Need 2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">Microsoft-based PC</td>
			<td style="width:91px;">Dell</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">Faraday Cage</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">Air Table</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish

이전 성인 제브라 피쉬의 전기 생리학 연구는 준비 또는 아이 컵 준비 및 electrorentinogram 녹음에 슬라이스를 제한되었습니다. 이 논문은 신경 활동의 기록을 허용, 성인 제브라 피쉬는, 고정 삽관 및 생체 전기 생리학 실험에 사용 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 성인의 고정화는 구강 및 아가미 운동 대신 아가미로 용존 산소를 전달하는 메커니즘이 필요합니다. 우리의 기술로, 동물을 고정하고이 요구 사항을 충족하기 위해 서식지 물을 관류. 개두술은 tricaine 메탄하에 수행된다 (MS-222; tricaine) 마취는 뇌에 대한 액세스를 제공하기 위해. 주 전극이어서 세포 뇌 활동을 기록 개두 윈도우 내에 위치된다. multitube 관류 시스템의 사용을 통해, 약물 화합물의 다양한 신경 활동에 성어 및 변경에 투여 될 수있다관찰 할 수있다. 방법론은 신경 활동의 변화에​​ 대하여 만들어 질 관측을 허용 할뿐만 아니라 비교는 유충 및 성인 zebrafish의 사이는 것이 또한 허용한다. 이는 연구자에게 인해 상이한 수명 단계에서의 다양한 화합물의 도입에 신경 활동의 변화를 식별 할 수있는 능력을 준다.

이 프로토콜은 생체 내 성인 지브라 피쉬의 신경 활동을 측정하는 데 사용되었다. 이러한 전기 생리학 기록은 일관되고 재현를 얻을 수있다. pentylenetetrazol (PTZ), 공통 chemoconvulsant 6,7,25,26가 삽관에 도입 될 때 그림 5는 성인 제브라 피쉬의 신경 활동의 기본 및 유도 변경의 대표적인 예를 보여줍니다 설치. 성인 제브라 피쉬의 기본 신경 활동은 각 실...

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Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

이 논문은 성인 제브라 피쉬는, 고정 삽관 및 녹음 및 손상 동물에서 신경 활동의 조작을 허용하는 생체 전기 생리학 실험에 사용 할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

온전한 성인 Zebrafish의의 뇌에 전기 생리학 기록

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

electrophysiological-recording-in-the-brain-of-intact-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.3K 조회수.  University of Georgia.  이 논문은 성인 제브라 피쉬는, 고정 삽관 및 녹음 및 손상 동물에서 신경 활동의 조작을 허용하는 생체 전기 생리학 실험에 사용 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 

비디오: Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

연구

신경과학

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

형질 전환 생선의 본래 뇌에서 발견 뉴런의 전기적 활동을 기록

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

모르 올리고 뉴클레오티드의 Cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 Zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

아 밀 로이드-β42 독성 그리고 Zebrafish 두뇌에서 Neurodegeneration 모델링

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain activity from freely moving fish would advance research on the neural basis of fish behavior considerably. Moreover, precise control of the recording location in the brain is critical to studying coordinated neural activity across regions in fish brain. Here, we present a technique that records wirelessly from the brain of freely swimming fish while controlling for the depth of the recording location. The system is based on a neural logger associated with a novel water-compatible implant that can adjust the recording location by microdrive-controlled tetrodes. The capabilities of the system are illustrated through recordings from the telencephalon of goldfish.

A novel wireless technique for recording extracellular neural signals from the brain of freely swimming goldfish is presented. The recording device is composed of two tetrodes, a microdrive, a neural data logger, and a waterproof case. All parts are custom-made except for the data logger and its connector.

자유롭게 수영 물고기에서 이동 식 Tetrodes에 의해 뉴런의 무선 전기 생리적 기록

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

성인 얼룩말 피시의 무딘 힘 부상의 효과를 연구하는 확장 가능한 모델

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo imaging with subcellular resolution. 3PM has two major advantages for deep-tissue imaging over 2PM that has been widely used in biology laboratories: (i) longer attenuation length in scattering tissues by employing ~1,300 nm or ~1,700 nm excitation laser; (ii) less background fluorescence generation due to higher-order nonlinear excitation. As a result, 3PM allows high-contrast structural and functional imaging deep within scattering tissues such as intact mouse brain from the cortical layers to the hippocampus and the entire forebrain of adult zebrafish.
Today, laser sources suitable for 3PM are commercially available, enabling the conversion of an existing two-photon (2P) imaging system to a three-photon (3P) system. Additionally, multiple commercial 3P microscopes are available, which makes this technique readily available to biology research laboratories. This paper shows the optimization of a typical 3PM setup, particularly targeting biology groups that already have a 2P setup, and demonstrates intravital 3D imaging in intact mouse and adult zebrafish brains. This protocol covers the full experimental procedure of 3P imaging, including microscope alignment, prechirping of ~1,300 and ~1,700 nm laser pulses, animal preparation, and intravital 3P fluorescence imaging deep in adult zebrafish and mouse brains.

Three-photon microscopy enables high-contrast fluorescence imaging deep in living biological tissues, such as mouse and zebrafish brains, with high spatiotemporal resolution.

Deep-Tissue Three-Photon 형광 현미경 검사 in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...