나는 L 와타나베, M Gorczyca하고 유용한 의견과 토론 요시 연구소의 다른 회원들에게 감사드립니다. 나는 파리 주식, 실험을 시연을위한 S 요코야마, 기술적인 도움 신야 Iguchi 및 재료 정보에 대한 Nobuko 요시 위해 K. 스캇과 L. Looger 감사드립니다. 이 작품은 정신 건강 보조금 MH85958 국립 연구소, 그리고 내로 우스터 재단에 의해 지원되었다

1. 파리를 구축 <ol><li> 측벽에 녹아하고 적절한 각도와 두께 (; 그림 2 그림 1A)을 형성하기 위하여 그것을 조각하여 35mm 팔콘 요리의 뚜껑에서 플랫폼을 형성. mouthparts 자유롭게 챔버 (그림 1A)의 외부에 노출되는 등 파리 헤드 (그림 1A, B)를 수용하는 플랫폼에 구멍을 드릴 다운합니다. 파리가 관찰되는 매칭 크기, Pipetman 팁의 끝을 잘라요. 플랫폼에 접착제는 팁 파리 (그림 2)를 완료하기 위해 그림 1A와 같이. </li></ol> 2. 관측을위한 플라이 준비하기 <ol><li> 25 24 시간 동안 성인 파리를 굶어 ° C에서 기아가 필요한 경우에만 젖은 종이 타월과 함께 유리병에 넣어 의해 실험 이전. </li><li> 빙판에 서있는 15ml 플라스틱 튜브에 배치하여 파리를 마취. </li><li> 포셉 사용의 챔버로 플라이를 삽입파리, 그리고 움직이지 못할 때까지 가볍게에서 파리를 밀어. 그런 파리를 유지하기 위해 플러그를 삽입합니다. (그림 1A, B). </li><li> 구멍의 안쪽 가장자리에 근위 코 (연단)의 주변 부분을 밀봉, 양쪽에 가벼운 경화 접착제 (Tetric EvoFlow)의 소량을 적용하고부터 연단 위에 밖으로 (그림 3의 화살표). 파리의 안쪽에서 머리 지느러미 부분과 구멍의 내부 모서리 (그림 1B) 사이의 공간에 접착제도를 적용합니다. 연단 자유롭게 이동할 수 있도록하려면주의가 접착제를 확산 속눈썹 (또는 비교 무언가)을 사용하여 연단을 만져서 어떤 접착제를 방지하기 위해 이동해야합니다. 마지막으로, 과도한 열에서 파리 손상을 방지하기 위해 치료를위한 충분한 푸른 빛의 약한 조명과 접착제를 치료. 플러그를 제거합니다. </li><li> 연단 부분 (그림 3의 화살표) 해제를 개최하는 스레드 플라이를 안정시켜 고용 수 있습니다 &#39;SOG로 pharyngeal 부품의 충돌을 피하고, 특히 코가 완전히 철회되는 인두의 일부로 적용되는 Gr5a 뉴런 8의 영상 presynaptic 터미널에 대해, SOG의 복부 부분을 노출하여 s의 헤드. </li><li> , KCl, 2, MgCl 2, 4.5, CaCl 2, 1.5, 그리고 HEPES-NaOH, 5 7.1 10 산도와 NaCl, 140 : 무설탕 염분 함유 (㎜)을 함께 플랫폼의 표면을 채우십시오. 이 자당없는 염분은 일반적으로 사용되는 분들 자당 함유 같은 HL3.1 11로 salines을과 비슷한 tonicity 있습니다. </li><li> 맞춤 장치이며 원래 SOG를 (그림 4) 노출 표피와 호흡 관을 버리 박사 Kageyuki 야마오카, 일본, 설계한 가위처럼 날카롭게 조언과 텅스텐 칼날과 집게를 사용하여 헤드 캡슐을 엽니다. 지느러미 가장자리 상처 등 중요한 아니었 반면 머리 표피의 복부 가장자리는 가능한 한 복부으로 절단되었다. 첫째,을 통해 절개를 할후부 가장자리 텅스텐 블레이드를 사용. 그런 측면을 잘라 날카롭게 집게를 사용하여 앞부분은 가장자리. 컷 표피 조각은 집게와 함께 해제 및 제거해야합니다. 안테나 및 antennal 신경이 날카롭게 포셉 의해 절단해야합니다. </li><li> 녹음하는 동안 움직임 유물을 피하기 위해, 머리가 파리의 특정 부분의 제거를 통해 안정되어야합니다. 첫째, 선택적으로 SOG와 표피 사이에 공기 자루를 제거합니다. 인두쪽으로 끝에 및 인두와 뇌 사이의 연결을 제거하는 SOG로가는 끝에 식도를 잘라. 그렇다면 근육 16 12를 꺼내, 그리고 마지막으로, 두뇌와 표피를 연결하는 기관을 분리. </li><li> 우리는 스피닝 디스크 공촛점 현미경 시스템 (PerkinElmer에서 Improvision) (그림 5)에 연결된 올림푸스 BX51WI 현미경의 무대에서 우리의 파리를 설정합니다. 물 침지 렌즈, 예를 들어 40X/0.8 NA는 목욕탕 (그림 6에 열중했다 </strong&gt;). </li></ol> 3. 칼슘이 뇌 + 이미징 <ol><li> 칼슘 2 + 영상은 GCaMP3.0를 사용하여 1, 9가 Marella 외가 정한 방법을 통해 수행되었다. 8 (그림 6). 스피닝 디스크 공촛점 현미경 (Improvision) 사용하면, 관심있는 지역 (모터 신경 세포의 세포 본문, interneuron, 또는 presynaptic 터미널에 초점을 맞추고, 491nm 여기 레이저를 사용하여 122ms의 노출 시간과 4Hz에서 하나의 광학 부분을 받아 gustatory 감각 뉴런의) 속도 소프트웨어 버전과. 4.3 (Improvision). </li></ol> 4. 코을 자극 <ol><li> 팁 (그림 7)에서 튀어나온 작은 심지 (일본어 Washi 종이로 만든, 특정 시약의 표 참조)로 피하 주사 바늘로 100mM 수성 자당 솔루션을 기음. </li><li> 심지쪽으로 자당 솔루션의 작은 방울 방전 후 즉시 befor, 그것을 기음코 끝에 젖은 Washi 종이 심지를 적용 5. Washi 종이 심지는 포만 (그림 8)을 피하기 위해 즉각 신청해야합니다. 코 확장 응답 (당) 칼슘 2 + 이미징와 동시에 (그림 5) 해부 현미경에 부착된 CCD 카메라를 사용하여 동작을 모니터링합니다. 데이터 인당 응답이 이러한 조건 하에서 하나 이상의 시간 유지되지 않기 때문에 절개를 시작 후 한 시간 이내 촬영해야합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 연단의 분도기, 코 확장을위한 연단을 리프팅을 담당 주요 근육의 쌍의 모터 뉴런은 달콤한 자극 13 강력한 반응을 보여주보고되었습니다. 그림 9 보여주는 칼슘 2 + 신호 GCaMP3.0 1, 9까지로 표현 모터 신경 세포의 세포 시체에서 걸 네 드라이버, E49 13. 비디오, robu에 표시된 바와 같이일 인당는 칼슘 2 + 신호의 증가 synchrony에서 관찰되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> 1 그림. 플라이 두뇌 라이브 이미징 및 전기 생리학 무대 (파리)의 개략도. , 파리는 파리 머리는 똑바로 나오게하는 벽의 각도가 허용되는 등 내장되어 있습니다. 플라이 코 세 세그먼트는 색깔, 연단은 자홍색이다. 파리는 집게와 챔버에 삽입하고, Pipetman 팁의 끝 부분부터 잘라 조각 탈출 플라이를 차단하는 챔버의 뒷면에 연결합니다. B는, 구멍은 파리의 머리에 부합하는 지루합니다. 전혀 누수가없는 것을 확인하기 위해 지적대로 남아있는 격차는 광 경화 접착제로 봉인된다. 접착제가 완치되면 플러그 같은 Pipetman 팁이 제거됩니다. 식염수는 두뇌의 표면이 완전히 덮여있는 등 파리에 부어있다. 그것은 아무 식염수 누수가 없다는 것을 보장해야파리 머리의 앞부분 끝에 밖으로 접근한. 패널 B의 점선으로 둘러싸인 음영처리된 영역 밖으로 해부되는 부분을 보여줍니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> 그림 2. 파리 사진. 접착제의 초승달 모양의 벽이 (아교 총에서) 재관류 동안 생리 식염수의 흐름을 제어하고, 사용되는 염분의 양을 줄이기 위해 만들어졌다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> 그림 3. 파리의 정면보기 광 경화 접착제는 염분 방지 도장을 만들 플라이 (화살표)의 머리 주위에 적용되는 방법이 이미지는 파리가 파리에서 설정하는 방법을 보여줍니다. 파리에 마운트합니다. 파리의 코에 이르기까지 모든 식염수 누수 다음, 실험이 실패합니다 바랍니다. 무대 곁에 스레드 (화살촉) 완전히 retrac되지 않도록 위치 코를 개최하는 것입니다<html> 테드. 그렇지 않으면 그것은 SOG의 더 많은 복부 부분을 방해하고 운동 아티팩트를 일으킬 것이다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> 4 그림. 해부 플라이와 함께 파리 최고의 전망.이 이미지는 파리 다음과 표피 제거의 노출된 SOG를 보여줍니다. 식도, 근육 16 tracheae는 두뇌에 연결뿐만 아니라, 선택된 공기 자루는 또한 칼슘 신호의 유물로 이어질 수있는 두뇌를 방해 못하도록 방지하기 위해 제거되었습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> 그림 5. 감시 장치가.이 장치는 회전 디스크 공촛점 현미경 시스템 (Improvision)에 연결된 올림푸스 BX51WI 현미경에서 조립, 그리고 니콘 SMZ800 현미경 측면 - 마운트됩니다. 이 설정은 동작 인당 동안 뇌 활동의 라이브 영상을 허용합니다. 6 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; 6 그림. 파리의 측면 뷰를 게재할 사진은. 생리 식염수의 얇은 계층은 40X 물에 침지 렌즈와 플라이 사이에 끼워 넣었지있다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> 그림 7. Washi 종이 심지를 만들기위한 설계도. Gampi - Washi 종이는 (Haibara, 일본) 매우 얇고 매끄러운입니다 일본 전통 양피입니다. 그것은 또한 매우 강한 액체의 다량을 유지하실 수 있습니다. Washi 용지는 매우 구체적인 치수와 사다리꼴로 절단되어야하며 0.3 mm 및 0.7 mm 폭 및 길이 4-5밀리미터합니다 (). 이 사다리꼴 그때 23 G의 피하 바늘 끝으로 0.7 밀리미터 측면에서 삽입하며 V 자형 (B)에 굽습니다 곤충 핀의 삽입을 통해 안정 수 있습니다. C가, Washi 종이가된다 투명 다음 노출액체로,이 실험에 이상적입니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> 그림 8. Washi-심지가있는 파리에 코의 자극은. 피하 주사 바늘의 일각에 Washi 종이 심지는 한 손으로 조이스틱 조작하는 사람을 사용하여 인스턴트에 대해 적용됩니다. 바늘은 자당 솔루션을 aspirating 및 배출을 위해, 다른 한편으로 조작 주입기에 유연한 튜브를 통하여 연결되어 있습니다. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> 9 그림. 대표 결과입니다. 는 행위 당 stereomicroscope에 설치된 CCD 카메라를 통해 기록했습니다. 자극에 자극을하기 전에 확장 코 (화살표)와 100 밀리미터 자당의 수성 솔루션 (화살촉)를 포함하는 심지와 자극 후 굶주린 파리의 정면 전망이 있습니다. 조명이 사용 491 nm의 레이저에 의해 수행됩니다GCaMP 형광. B를 위해, 굶주린 상태에서 연단 근육의 분도기를위한 모터 신경 세포의 GCaMP 3.0 응답 자당 유발. 자극 전에 상단 패널, 하단 패널, 즉시 자극 후. 스케일 바, 10 μm의. C, 자당 유발 GCaMP 3.0 응답의 부량. 모터 뉴런은베이스 라인에 몇 초 정도의 복원 단계 다음에 형광의 급격한 증가에 의해 자당의 자극에 응답합니다.

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<p class="jove_content"&gt; 저는 공개할 게 없다.</p

파리 칼슘 2 + 신호와 PER 행동의 동시 녹음을 허용합니다. 비록 함께 식염수 정상 인당 행동에 노출되어 머리가 관찰되었다. 대신 원래 모세관 method7에서 사용 Kimwipe의 심지의 Gampi-Washi의 심지를 사용하여 높은 재현성과 안정 인당 행동을 용이하게하고 만들고 좋은 Kimwipe의 심지를 선택하는데 숙련된 될 필요성을 방지합니다. 실험 조언은 우리가 성공적으로 칼슘 2의 매우 안정적인 녹음으로 이어지는, 코의 움직임에 의해 교란을 피하기 위해 + 신호를 저소음으로 사용할 위에서 언급한. 때로는 조직 제거 가난한 결과로 이어지는, 세포를 노출하거나 적절하게 운동을 억제하기에 충분 아니었어요. 그러나 일단 우리가 숙련된 있었 준비를 80 % 이상 좋은 결과를 생산했다. 이 방법론은 칼슘 2 + 이미징을위한뿐만 아니라하지만, 행동에 따라 관찰하면서 또한 실시간 영상으로 적응 수 있습니다. 예를 들어, 우리를 통해 세포에 액세스할 수 있습니다직접 활동을 기록하는 전극을 사용하지 않습니다. 두 광자 여기 현미경과 결합하여, 우리의 행동 변화에 관한 수 시냅스 구조의 저속 이미징을 수행할 수 있습니다. 따라서, 행동 관찰을 통한 두뇌 이미징이 방법의 연결 네트워크의 기능적 해부에 대한 가치뿐만 아니라,하지만 메모리의 배후 메커니즘에 시냅스 소성의 14 연관시키는 강력한 도구로 사용될 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 장비 / 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar vivadent </td><td> M04115 </td><td> 광 경화 접착제 </td></tr><tr><td> BX51WI 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> BX51WI </td><td> 40X (NA 0.8) 물 침지 객관적인 렌즈로 </td></tr><tr><td> 디스크 공촛점 현미경 시스템을 스피닝 </td><td> PerkinElmer에서 Improvision </td><td></td><td> 491 nm의 레이저로 </td></tr><tr><td> Stereomicroscope </td><td> 니콘 </td><td> SMZ-800 </td><td> 스윙 암에 첨부. 스테레오보기는 아직 비디오 녹화 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> Gampi-Washi 종이 </td><td> Haibara, 일본 </td><td></td><td> 일본의 전통 종이의 특별한 종류 </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> 이미징 소스 </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1 / 2 &quot;1080 × 960 픽셀 SONY CCD </td></tr><tr><td> 조이스틱 조작하는 사람 </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of drosophila melanogaster

행동에서의 기능의 측면에서 네트워크의 연결을 공부하기 위해, 우리는 각각의 행동 패턴이 생성되면 뉴런이 작동 방법을 분석한다. 따라서,의 연결 활동 및 행동의 동시 녹음 행동 두뇌 활동을 연관시키는 것은 필수적입니다. 그러한 행동 분석은 과일 파리, Drosophila melanogaster, 우리 같은 GCaMP 1 등 유전자 인코딩 칼슘 지표를 통합할의 연결 활동을 모니터링하고, 특히 뉴런 2-5 확인된 활성화 optogenetic 또는 thermogenetic 기법에 대한 정교한 유전자 조작을 사용할 수 있습니다. thermogenetic 기법의 사용은 먹이 행동에 중요한 뉴런 (홍수 외., 개정 이하)을 찾기 위해 우리를 이끌었습니다. 의 코 또는 tarsi의 감각 세포에서 달콤한 자극에 반응; 동작을 먹이의 주요 부분으로 Drosophila 성인 6 (사람마다 코 확장 응답)를 먹일 때 그 코를 확장합니다. 공동행동 관찰과 동시에, suboesophageal 신경절 (SOG) - GCaMP3.0 1을 사용 칼슘 이미징 기법 8, 9와 7 작자에 대한 프로토콜을 mbining, 난 우리가 먹이 센터에서 뉴런의 활동을 모니터할 수있는 실험적인 시스템을 설립 코니다. 뇌의가 물 침지 렌즈를 통해 + 이미징 칼슘 2 목욕에 노출되는 동안의 코 자유롭게 이동할 수 있도록 Drosophila 성인을 수용할 수 있도록 : 나는 장치를 ( &quot;파리&quot; &quot;플라이 두뇌 라이브 이미징 및 전기 생리학 스테이지&quot;) 설계했습니다 . 파리 또한 electrophysiological 녹음이나 시냅스 형태의 저속 이미징과 같은 플라이 두뇌에 게재 실험의 여러 유형에 적합합니다. 라이브 이미징의 결과가 직접적으로 동시 인당 동작과 상호 수 있으므로,이 방법론의 연결 네트워크의 정보 처리를 공부하기위한 좋은 실험적인 시스템을 제공하고, 어떻게 사용자 수ellular 활동은 플라스틱 프로세스 및 메모리에 결합됩니다.

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Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

과일 파리,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;의 코 또는 족근에서 설탕 자극에 반응, 먹일의 코를 확장합니다. 난 우리가 행동 관찰과 함께 동시에, 두뇌의 뉴런의 활동을 감시할 수 있도록 칼슘 이미징 기술을 코 확장 반응 (당)의 관찰을 결합했습니다.

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

15.5K 조회수.  University of Massachusetts Medical School. 과일 파리, Drosophila melanogaster의 코 또는 족근에서 설탕 자극에 반응, 먹일의 코를 확장합니다. 난 우리가 행동 관찰과 함께 동시에, 두뇌의 뉴런의 활동을 감시할 수 있도록 칼슘 이미징 기술을 코 확장 반응 (당)의 관찰을 결합했습니다.

비디오: Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

곤충의 단일 Sensillum 레코딩 Drosophila melanogaster과 아노 펠 레스 gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

연구

신경과학

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

의 이스케이프 문제의 Optogenetic의 자극<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

형질 전환 생선의 본래 뇌에서 발견 뉴런의 전기적 활동을 기록

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

세포 내 기록, 감각이 필드를 매핑하고, 거머리의 배양 확인 된 뉴런, Hirudo의 medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

막 성인 쥐에서 Ventromedial 시상 하부 뉴런의 잠재적 인 염료 이미징은 포도당 감지를 연​​구하는

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

제 3-탈피 초파리 Melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

행동과 자극 반응 도중 전체 두뇌 화상 진찰을 위한 성인 Drosophila melanogaster를 준비합니다

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...