저자는 hippocampal 슬라이스 문화의 준비를 위해 매튜 피렌체 감사드립니다. 이 작품은 미국 국립 노화에 연구소 NZG에 알츠하이머 협회에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. 정착 Fixatives는 발암 성이다; 장갑을 착용하고 연기 후드에 fixatives를 처리합니다. 별도로 명시하지 않는 한, 모든 incubations은 얼음에 완료하고 모든 솔루션은 사용하기 전에 필터링해야합니다. 전자 현미경 수준의 시약을 사용합니다. 1 일 <ol><li class="jove_content"> 실험 조건 후 (예 : 바이러스 주입, 약물 치료)에 organotypic hippocampal 슬라이스로 막 배치 60 X 얼음처럼 차가운 0.1 M 인산 버퍼 (소렌슨의 인산 완충), pH를 7.3를 포함하는 15mm의 폴리스티렌 페트리 접시. 1 추가 - 직접 조각 위에 0.1 M 인산 버퍼 2 ML 그들에게 차가운 유지할 수 있습니다. </li></ol> 임계 단계 : 항상 신선하게 조리 된 버퍼와 fixatives을 사용합니다. 버퍼의 pH가 원하는 범위 내에 있는지 확인하십시오. 그렇게 할 실패 세포 구조를 손상 수 있습니다. <ol start="2"><li> 슬라이스의 CA1의 subfield를 분리하려면,를 사용하여부드럽게 CA1 세포 레이어 (그림 1)에 평행 DG 옆에있는 슬라이스에 걸쳐자를 일회용 메스. 그런 다음 세로로 CA3 subfield과 subiculum를 제거하는 나머지 조각을 잘라. 조직의 상단 표면을 식별하는 데 도움이 슬라이스의 모서리를 잘라. </li></ol> 참고 : 관심 단백질의 어떤 바이러스 전달이 필요하지 않습니다 경우에는 미디어가 얼음처럼 차가운 버퍼 씻어 부드러운로 제거 된 후, 전체 조직 슬라이스가 해결 될 수 있습니다. 이것은 다음 CA1을 절단을합니다. 임계 단계 : 나중에 격자의 적절한 sectioning 수 있도록 조직의 갑판을 확인합니다. <ol start="3"><li> 조심스럽게 메스의 뒷면을 사용하여 막에서 조직을 제거합니다. 부드럽게 0.1 M 인산 버퍼를 포함하는 12 잘 판에 조직을 전송하는 파스퇴르 피펫을 사용합니다. </li><li> 접시에서 잘에있는 버퍼를 제거하고 추가 500 &amp; mU; 난 - 1 다음으로 구성 얼음처럼 차가운 정착액의 ML (산도 7.3) : 0.1 % 피크르산, 1 % paraformaldehyde와 0.1 M 인산 버퍼에 2.5 %의 글 루타 알데히드. 4에서 2 시간에 품다 ° C. </li></ol> 참고 : 피크르산 때 건조 폭발 할 수 있습니다. 가 단단히 닫혀 용기에 물과 침수하세요. 건조하고 환기가 잘되는 장소에 보관하십시오. <ol start="5"><li> 우물에서 정착액을 제거하고 0.1 M 인산 버퍼에 샘플 3 회 (20 분마다)을 씻는다. </li><li> 0.1 M의 maleate 버퍼, 산도 6.0의 1퍼센트 타닌산 (w / V)에서 40 분에 품다. </li><li> maleate 버퍼에 (20 분마다) 두 번 씻어. </li><li> 어둠 속에서 maleate 버퍼의 1 % uranyl 아세트산 (w / V)에서 40 분에 품다. Uranyl 아세테이트은 빛에 민감하고 방사성 있습니다. 용해시 Parafilm로 비커를 커버와 4 ° C.에 어둠 속에서 사용되지 않는 버퍼를 저장 </li><li> maleate 버퍼에 (20 분마다) 두 번 씻어. </li><li> 0.5 % 플래티넘 chlor에 20 분에 품다maleate 버퍼의 IDE (w / V). </li><li> maleate 버퍼에 (20 분마다) 두 번 씻어. 4에서 샘플을 저장 ° C가 더 처리를위한 준비가 될 때까지. </li></ol> 2. 탈수 및 삽입 프로필렌 산화물은 발암 있습니다. 연기 후드에 작업하여 증기를 사용하지 마십시오. 물의 흔적을 포함하지 절대, 100 % 순수 에탄올을 사용합니다. 탈수에 대해 서로 다른 농도를 생성하기 위해이 절대 에탄올을 희석. 2 일 <ol><li> 50 % 에탄올 5 분 동안 배양 한 후 70 % 에탄올 5 분에. </li><li> 70 % 에탄올에서 신선하게 조리 된 1퍼센트 P-phenylenediamine (PPD)에서 15 분에 품다. </li><li> 70 % 에탄올에 세 번 씻어. </li><li> 80 % 에탄올 5 분 동안하고 95 % 에탄올 5 분에 품다. </li><li> 100 % 에탄올에 두 번 5 분 각각 품다. </li><li> 나사 모자와 유리 병을 준비하고 깨끗하고 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 유리 병에 조각을 전송하고간단하고 명확하게 각 유리 병에 라벨. </li><li> 프로필렌 산화물 : 1시 1분 에탄올에 5 분에 품다. </li><li> 100 % 프로필렌 산화물에 두 번 5 분 각각 품다. </li><li> 프로필렌 산화물과 1:1 혼합물을 각 유리 병에 수지 (Epon)를 추가합니다. 부드럽게 2 시간에 섞는다. 퍼가기에 영향을 줄 수 있습니다 거품을 방지하기 위해 너무 엄격하게 병을 흔들지 마세요. </li><li> 프로필렌 산화물, 그리고 2 시간에 혼합 3시 1분 혼합물을 만들기 위해 수지를 추가합니다. </li><li> 100 % 수지로 갈아 품다 O / N. </li></ol> 3 일 <ol start="12"><li> 60 ACLAR 플라스틱 및 2​​4 시간에 대한 치료의 스트립 사이에 샌드위치 샘플 ° C. </li></ol> 3. Sectioning 및 격자에 장착 4 일 <ol><li> 준 얇은 (0.5 μm) 부분을 잘라 1% toluidine 블루 + 샘플의 정확한 방향을 결정하는 1 %의 붕사와 얼룩. </li><li> ultrathin 섹션 (60 나노 미터)를 잘라 니켈 격자, 격자 당 하나의 섹션에 탑재합니다. </li></ol>4. Immunohistochemistry 모든 버퍼와 물은 사용하기 전에 필터링해야합니다. 5 일 <ol><li> 평평한 표면에 깨끗한 Parafilm의 한 부분에 1 % Tween-20/phosphate 버퍼 (T / PB), 산도 7.5, 한 방울 (~ 50 μl)를 배치합니다. 부드럽게 가장자리가 깨끗한 포셉으로 격자을 선택하고 버퍼 섹션 아래, 그리고 RT 10 분에 품다에 떠. </li><li> 종이를 필터링 섹션에면을 배치하여 격자에서 초과 액체를 배출 한 후 RT 15 분 동안 T / PB 50 MM 글리신을 떠. </li></ol> 임계 단계 : 피하려면 과도한 &#39;연행를 통해&#39;한 솔루션 비말에서 incubations 동안 다음에 대한 해결 방법, 부드럽게 각 솔루션의 변화 사이의 # 1 거름 종이에 격자의 가장자리를 터치하여 초과 액체를 배수한다. 또한 EM의 팔 사이에 갇혀있는 솔루션을 제거 부드럽게 포셉의 팔 사이에 필터 종이 조각을 wicking하여 그리드를 잡고 집게 동안 ensu섹션 완전히 건조하지 않습니다 반지. <ol start="3"><li> 거름 종이로 격자를 건조하고 RT에서 30 분을위한 T / PB의 보조 항체의 동물에서 2.5 % BSA와 2.5 %의 혈청을 포함하는 솔루션을 차단에 떠. </li><li> 4 ° C.에서 RT 또는 O / N에서 기본 항체 (T / PB에)에 품다 최적의 시간과 온도 부화의뿐만 아니라 항체 농도는 실험적으로 결정해야합니다. </li><li> 그리드에게 T / PB와 세 번 (2 분 각각)를 씻으십시오. </li><li> RT에서 1 시간에 차 항체 (10 나노 미터의 금으로 커플 링 1시 20분 백신 토끼 또는 안티 마우스)에 품다. </li><li> T / PB와 세 번 (2 분 각각)를 씻으십시오. </li><li> 5 분을위한 T / PB의 2 % 글 루타 알데히드와 접미사. </li><li> 그런 다음 T / PB 세 배 (2 분 각) 필터링 물을 세 번 (2 분 각각)를 씻으십시오. </li><li> 10 분 물에 2 % uranyl 아세트산을 품다. </li></ol> 그리드는 얼룩하는 동안 placin하여 CO 2 무료 챔버를 준비유리 페트리 접시의 중앙에 Parafilm의 GA 기사. 그런 다음 공중에 CO 2를 흡수 할 수 Parafilm 주변의 접시에 NaOH의 4-6 알약을 넣습니다. 몇 분 동안 상단을 감고. 파스퇴르 피펫을 사용하여 신속하게 유리 배양 접시에 Parafilm에 대한 레이놀즈 리드 구연산 솔루션의 작은 볼륨을 전송할 수 있습니다. 챔버에 CO 2의 재 도입을 최소화하기 위해 파스퇴르 피펫를 삽입 할 충분한 상단을 엽니 다. 참고 : 레이놀즈 리드 구연산 솔루션을 만들려면, 전자 렌지에 탈 이온수 100 ML을 끓여야하고 밀폐 용기에 시원한 보자. 스토퍼로 50 ML 용적 플라스크에 혼합 1.33 g 리드 질산염, 1 분 동안 힘차게 흔들어하여 1.76 g 나트륨 구연산과 삶은 물 30 ML. 그런 다음 30 분에 간헐적으로 흔들림. 이 흐린 솔루션으로, 1 M의 수산화 나트륨 8 ML을 추가하고 천천히 플라스크에게 몇 번 반전. 솔루션 명백해질 것이다. 삶은 구미시와 함께 50 ML에 대한 해결책을 가져적이. 단단히 봉인 솔루션을 저장합니다. 침전물가 나타나면 취소하고 새로운 하나를합니다. <ol start="11"><li> 에 세 작은 비커은 따뜻한 갓 삶은 탈 이온수를 준비합니다. 첫 번째 비커에 격자를 찍어 30 초 주위에 부드럽게 소용돌이를하여 uranyl 아세트산을 씻으십시오. 다른 두 비커에서이 단계를 반복합니다. </li><li> 레이놀즈 리드 구연산 솔루션의 드롭 격자를 배치 할 충분한 유리 페트리 접시의 상단을 엽니 다. 가능하면 리드 구연산에서 호흡을 방지하고 석출물의 형성을 방지하기 위해이 일을하는 동안 마스크를 착용하십시오. 10 분에 품다. </li><li> 그리드를 제거 할 충분한 상단을 엽니 다. 리드 구연산 호흡을하지 마십시오. 따뜻하고 신선한 삶은 증류수는 3 비커에 순​​차적으로를 찍어하여 그리드 세 번 씻으십시오. 필터 종이, 절까지의 부분에 격자가 건조 보자. 샘플은 현재 전자 현미경을위한 준비가되었습니다. </li></ol>

<ol>
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Cytochem. 40, 845-857 (1992).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+ultracryotomy+of+CNS+tissue+for+ultrastructural+and+immunogold+analyses.">Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses.</a> J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).</li><li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructual+localization+of+lysozyme+in+human+colon+eosinophils+using+the+protein+A-gold+technique:+effects+of+processing+on+probe+distribution.">Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution.</a> J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).</li><li>Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. 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Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+targets+calmodulin+and+lowers+the+threshold+for+the+induction+of+long-term+potentiation.">Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation.</a> PloS one. 7, e41275 (2012).</li><li>Horisberger, M., Vauthey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+of+colloidal+gold+with+protein.+A+quantitative+study+using+beta-lactoglobulin.">Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin.</a> Histochemistry. 80, 13-18 (1984).</li><li>Bendayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+potential+and+versatility+of+colloidal+gold+cytochemical+labeling+for+molecular+morphology.">A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology.</a> Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).</li><li>Racz, B., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+coflin+in+dendritic+spines.">Spatial organization of coflin in dendritic spines.</a> J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).</li><li>Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. 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우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 쥐 hippocampal 슬라이스 문화의 수지상 쪽을 연구하는 뇌와 척추의 조직에 대한 Phend와 와인버그 방법을 채택했다. hippocampal CA3-CA1 지역의 수지상 쪽은 neuronal 기능을 조절에 중요​​한 역할을 단백질의 광대 한 다양한을 포함하는 섬세한 구조입니다. 제시 방법은 적절한 라벨 효율성과 척추 내 특정 항원의 분포를 특성화하는 데 유용합니다 좋은 재현성을 허용, 좋은 ultr...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>NAME OF REAGENT</td>
 <td>COMPANY</td>
 <td>CATALOG NUMBER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 x 15 mm polystyrene Petri dish</td>
 <td>Falcon</td>
 <td>351007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable scalpel</td>
 <td>EXELINT</td>
 <td>29552</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell culture inserts</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>PICM03050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 nm Goat-anti-rabbit gold</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>25108</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Neurogranin antibody</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AB5620</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Picric acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>19550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96% Paraformaldehyde</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>AC41678-0030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25% Glutaraldehyde (EM grade)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p-Phenylenediamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P6001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum (IV) chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>379840</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

post-embedding immunogold labeling of synaptic proteins in hippocampal slice cultures

Immunoelectron 현미경은 subcellular 수준에서 생물 분자를 연구 할 수있는 강력한 도구입니다. 이러한 콜로이드 금과 같은 전자 - 고밀도 마커에 연결된 항체가 다양한 조직 1 특정 항원의 지역화 및 배포를 공개 할 수 있습니다. 두 가장 널리 사용되는 기법은 사전 삽입 및 사후 삽입 기술이다. 사전 퍼가기 immunogold - 전자 현미경 (EM) 기술에서, 조직은이 내장되기 전에 항체 침투를 허용하도록 permeabilized해야합니다. 이 기술은 구조이지만 항체의 가난한 침투는 (보통은 처음 몇 ㎛) 상당한 단점 2를 보존 이상적입니다. 항원이 더 쉽게 접근 할 수있는 곳 라벨이 고정 조직의 섹션에서 진행하기 때문에 사후 퍼가기 라벨 방법이 문제를 피할 수 있습니다. 지난 몇 년 동안, 수정 번호 immunoreactivity을 강화하고 ultrastructure을 유지하기 후 삽입 방법을 향상 <suP&gt; 3-5. 조직 고정은 EM 연구의 중요한 부분입니다. Fixatives는 화학적 곳에서 조직 구조를 잠글 고분자를 crosslink. 정착액의 선택은 구조 보존뿐만 아니라 항원 및 대비뿐만 아니라 영향을 미칩니다. 오스뮴의 tetroxide (OSO 4), 포름 알데히드, 그리고 글 루타 알데히드는 중추 신경계 (CNS) 화학 및 물리적 처리 중 구조적인 손상에 특히 경향이 조직에 포함 수십 년 동안 표준 fixatives했습니다. 불행하게도, OSO 4 반응성이 매우 높은이며, 가난하고 부족한 라벨의 결과로, 항원에게 6 숨길 수 표시되었습니다. 화학 고정을 피하기 위해 다른 접근 방법은 조직을 동결 있습니다. 하지만이 기술은 고가의 계측을 수행하고 필요로하기가 어렵습니다. 이러한 문제 중 일부를 해결하려면 및 CNS의 조직 라벨, Phend 외를 향상시킬 수 있도록 지원합니다. uranyl 아세트산 (UA)과 타닌 성의 ACI와 OSO 4 교체D (TA), 그리고 성공적으로 항원 검출 및 뇌 및 척수의 조직 7 구조 보존의 감도를 향상시키기 위해 추가 수정을 소개했다. 우리는 쥐의 뇌 조직이 오스뮴 무료 후 퍼가기 방법을 채택하고 신경 단백질을 감지하고 공부하기 immunogold 라벨 기술을 최적화했습니다. 우리는 여기서 쥐 hippocampal CA1 피라미드 뉴런의 시냅스 단백질의 ultrastructural 현지화를 결정하는 방법을 제시한다. 우리는 organotypic hippocampal 조각 양식을 사용합니다. 이 조각은 해마의 trisynaptic 회로를 유지하고, 따라서이 신경 소성을 공부에 특히 유용합니다, 메커니즘이 널리 학습과 기억을 기초 생각. 출생 후의 일 5와 6 마우스 / 쥐 새끼에서 Organotypic hippocampal 슬라이스는 이전에 8에 설명 된대로 준비하고, 심하게 분해 또는 overexpress 외인성 단백질에 특히 유용합니다 수 있습니다. 우리는 이전에 채널이 프로토콜을 사용했습니다neurogranin (잉), 신경 기능 할 8,9을 조절에 중요한 역할이있는 뉴런 특정 단백질을 aracterize. 우리는 또한 calmodulin (CAM) 및 CA 2 + / CAM에 의존 단백질 키나제 II (CaMKII) 10의 ultrastructural 현지화를 특징하는 데 사용했습니다. 결과에 도시 된 바와 같이,이 프로토콜은 수지상 쪽과 척추 8의 분포를 특성화하는 데 도움이 잉 효율적으로 라벨을 잘 ultrastructural 보존 할 수 있습니다. 또한, 여기에 설명 된 절차는 neuronal 기능에 관여 다른 많은 단백질을 연구에 다양한 응용을 할 수 있습니다.

그림 2B는 CA1 hippocampal 피라미드 뉴런의 수지상 쪽의 내생 잉 분자의 분포의 예를 보여줍니다. 해마의 CA1 영역을 (그림 2A에서 본)이 포함 된 ultrathin (60 나노 미터) 조직과 니켈 격자은 1 %에 덮여 된 후 반으로 부화하기 전에 2.5 % BSA와 혈청 2.5 %로 차단 T / PB, 50 MM 글리신, - 잉 항체. T / PB와 함께 세탁하면, 격자는 이후 10 나노 미터의 금으로 커플 링 방지 토끼 차 항체로 덮여 ...

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Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

단백질의 지역화 및 배포는 세포 기능을 이해하기위한 중요한 정보를 제공합니다. 전자 현미경의 우수한 공간 해상도 (EM)는 주어진 항원에 따라 immunohistochemistry의 subcellular 지방화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 유지 항원은 EM 연구에 특히 곤란했던 반면 구조적 무결성을 유지 중추 신경계 (CNS)의 조직하십시오. 여기, 우리는 공부를 할 수있는 CNS에 구조와 항원을 보존하고 쥐 hippocampal CA1 피라미드 뉴런에서 시냅스 단백질을 특성화하는 데 사용 된 절차를 채택한다.

Hippocampal 슬라이스 문화의 시냅틱 단백질의 포스트 퍼가기 Immunogold 라벨링

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

post-embedding-immunogold-labeling-synaptic-proteins-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.0K 조회수.  Medical College of Wisconsin. 단백질의 지역화 및 배포는 세포 기능을 이해하기위한 중요한 정보를 제공합니다. 전자 현미경의 우수한 공간 해상도 (EM)는 주어진 항원에 따라 immunohistochemistry의 subcellular 지방화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 유지 항원은 EM 연구에 특히 곤란했던 반면 구조적 무결성을 유지 중추 신경계 (CNS)의 조직하십시오. 여기, 우리는 공부를 할 수있는 CNS에 구조?...

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Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

연구

신경과학

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

의 연결을 부상을 검사에 대한 Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 모델

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

Organotypic 슬라이스 문화의 Purkinje 세포 수지상의 형태학의 분석

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

설치류에서 급성 해마 조각을 사용하여 시냅스 태그 / 캡처 및 크로스 캡처 조사

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고해상도 양이 Immunogold 분석

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...