이 작업은 바젤 (Basel) 대학 생물 의약 부, 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (31003A-116624)에 의해 지원되었다.

1. Organotypic 소뇌 슬라이스 문화 설정 소뇌 슬라이스 문화가 출생 후의 일에서 정적 부화 방법 (10)을 사용하여 8 P (8) 마우스 새끼를 준비하고 있습니다. 저희 연구실에서는, 우리는 B6CF1 마우스를 사용합니다. 일부 실험에서도 유전자 변형 생쥐는 Purkinje 세포에 선택적으로 EGFP을 표현하는 데 사용되었습니다. 슬라이스 문화의 준비는 6 마우스 새끼의 쓰레기에 마우스 새끼, 즉 3시간 당 약 30 분 정도 소요됩니다. 모든 단계를 소독 수술기구와 층류의 작업대에서 무균 조건 하에서 수행됩니다. <ol><li> P8 마우스 새끼의 소뇌는 stereomicroscope를 사용하여 얼음처럼 차가운 준비 매체 (가상 (Gibco 카탈로그 번호 11012) glutamax 1:100, 산도 7.3 포함)의 뇌 분석하던됩니다. </li><li> 소뇌는 McIlwain 조직 헬기를 사용하여 시상 ​​방향으로 350 μm 두께의 조각으로 절단됩니다. </li><li> 조각은 Millipore 세포 배양 삽입 (approx.6 슬라이스에 배치됩니다삽입, Millipore PICM03050) 당 s와는 0.75 ML 당 잘의 부화 매체 (48.35 ML 가상, 25 ML 이글 보통, 25 ML 말 혈청, 1ml glutamax I, 살균 10 % 포도당의 0.65 ML과 6 잘 접시에 incubated 아르 37 번 5 % CO 2 humidified 분위기 속에서 솔루션 산도 7.3) ° C. 모든 조직 문화 시약은 Gibco, Invitrogen에서 있었다. </li><li> 약리 치료는 일반적으로 문화 매체에 원하는 농도로 약물을 추가하여 체외 (DIV3)에서 3 일 시작됩니다. Phorbol 12 myristate의 13-아세테이트 (PMA)와 (RS) -3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)는 Tocris, 영국에서 있었다. 많은 마약이 주식 솔루션 (예 : PMA)를 준비 DMSO 또는 에탄올의 사용을 필요로하기 때문에 용매의 총 금액은 (물론 당 7.5 μl) 1 %를 초과하지 않는 문화 매체에 추가 한주의주의해야한다. 약물은 문화 매체 매 2 차 또는 3 일의 변화와 함께 갱신됩니다. </li></ol> 2. 고정 및 ImmunosOrganotypic 소뇌 슬라이스 문화의 taining 소뇌의 중요한 장점은 항체가 특별히 밝은 교장 소뇌 뉴런, 즉 Purkinje 세포와 과립 세포를 금방 치료하실 수 있습니다 것입니다. Purkinje 세포의 수지상 형태는 반 calbindin의 D28K과 immunostaining에 의해 공개 할 수 있습니다. <ol><li> 문화의 고정은 문화 매체가 제거되고 0.1M 인산 버퍼 (산도 7.4)에서 추운 4 % paraformaldehyde 3 ML 잘 막에 부착 된 소뇌 슬라이스로 Millicell 삽입을 포함하는 당 신중 추가됩니다. 문화는 하루 아침에 해결되는 다음 정착액이 제거되고 문화가 인산염 버퍼로 헹구어 있습니다. </li><li> immunostaining를 들어 다음과 같은 항체를 사용합니다 : 토끼 반 calbindin D-28K을 (Swant, Bellinzona, 스위스) 1:1000에서 선택적으로 선택적으로 granu를 시각화에 대한 1:500에서 Purkinje 세포와 단클론 항 NeuN (Chemicon, Millipore)를 시각화에 대한르 세포 12. 토끼 반 GFP는 Abcam, 영국에서왔다. 형광등 보조 알렉사 항체는 분자 프로브, Invitrogen에서 있었다. </li><li> 문화는 0.1 M 인산 버퍼 (솔루션을 차단)에 3% 정상 염소 혈청 + 0.3 % TritonX100을 추가하여 permeabilized 및 차단됩니다. 안티 calbindin D28K 및 안티 NeuN이 솔루션을 차단에 희석되고 문화가 약​​간의 동요에 따라 4에 밤새 항체 ° C를 포함하는 차단 솔루션을 incubated 수 있습니다. 모든 dilutions가 % (V / V)로 표시됩니다, 트리톤의 X100은 pipetting을 촉진하기 위해 10 %의 재고 솔루션에서 가져옵니다. </li><li> 문화는 0.1 M 인산 버퍼로 3 배 헹구어 된 다음 적절한 초 항체, 예를 들어 염소 안티 - 토끼 알렉사 568과 염소 안티 - 마우스 알렉사 488와 incubated 아르는 + 0.1 % TritonX100에서 2 시간 동안 0.1M 인산 버퍼에 1:500을 희석 실내 온도. 문화 그런 다음 0.1M 인산 버퍼로 3 배 헹구어 있습니다. </li><li> 스테인드 조각은 문화에서 삭제됩니다잘 붓으로하고 Superfrost 플러스 유리 슬라이드에 장착하고 적절한 장착 매체, 예를 들어 Mowiol과 ​​coverslipped. 문화는 이제 epifluorescence 장비를 갖춘 일반 현미경 또는 공 촛점 현미경으로 볼 수 있습니다. </li></ol> 3. Organotypic 슬라이스 문화에서 개인 Purkinje 세포보기 <ol><li> Calbindin D28k과 immunostaining 후 Purkinje 세포의 전체 세포질는 밝은 수석과 축삭 등의 얼룩이 있습니다. Purkinje 세포 레이어에 Purkinje 세포의 조밀 한 배열로 인해, 대부분의 Purkinje 세포의 수지상 울타리, 나무는 힘들 개별 셀의 전체 아버을 공부하고 중복되어 있습니다. 그러나 준비 과정에서 일부 Purkinje 세포의 세포 사망으로 인해, 많은 문화에 일부 지역은 Purkinje 세포의 감소 밀도 존재한다. 이러한 지역에서는 다른 C와 중복되지 않는 완전한 수지상의 아버와 Purkinje 세포를 발견 할 수 있습니다ells. 이러한 세포에서 수지상 식목일을 볼 수 있으며, Golgi의 착색에 필적하는 품질 분석했다. 소뇌에 Purkinje 세포가 Calbindin D28K을 표현하는 유일한 세포 유형입니다 때문에 세포도 Purkinje 세포로 표시되어 있습니다. </li><li> 다른 방법은 B6에서 파생 문화를 사용하는 것입니다, FVB-TG (Pcp2-EGFP) 146.244Yuza / J 마우스 (여기서 Pcp2-EGFP 마우스라는, 잭슨 실험실에서 사용할 수)은 Purkinje 세포 특정 L7 발기인 11에서 EGFP을 표현된다. 이러한 슬라이스 문화에 살고있는 Purkinje 세포는 EGFP의 표현으로 시각화 할 수 있습니다. 그것은 시간이 지남에 따라 하나의 세포의 수지상 형태를 따라하는 것도 가능합니다. 또는 고정 후, EGFP-표현 Purkinje 세포는 안티 - GFP 항체와 immunostained 할 수 있습니다. 두 방법은 착색의 수석, 세포 기관 및 organotypic 문화의 Purkinje 세포의 axons에 적합합니다. Pcp2-EGFP 마우스의 L7 발기인은 모든 Purkinje 세포에 표현 및 V가 있습니다 있지 않기 때문에마우스 (Kapfhammer, 데이터가 표시되지 않음) 사이의 Purkinje 세포를 표현의 주파수에 ariations이 마우스에서 파생 된 문화가 쉽게 다른 Purkinje 세포 수지상 나무와 중복 수지상 나무를 Purkinje 세포를 시각화하고 측정 할 수 있도록 잘라. 수지상 나무를 중복으로 이웃 Purkinje 세포는 명시 적 GFP (그림 1A, B) 안하면 이러한 수지상 나무는 개별적으로 볼 수 있습니다. </li></ol> 4. Purkinje 세포 수지상 트리 크기 및 지점 포인트의 측정 <ol><li> 수지상 나무 크기입니다. 나무가 다른 세포와 중복되지 않는 경우 Purkinje 세포의 형광 라벨과 함께 주어진 셀의 수지상 나무의 크기는 쉽게 측정 할 수 있습니다. Calbindin의 immunostaining 라벨 모든 Purkinje 세포 있기 때문에 수지상 나무를 겹치지와 세포를 식별하기 어려울 수 있습니다. 이 경우 Pcp2-EGFP의 사용은 충분한 Purkinje 세포의 식별을 단순화하는 것이 좋습니다겹치지 수지상 나무들. 겹치지 수지상 나무와 Purkinje 세포가 확인되면,이 20x 렌즈 조회되고 이미지는 디지털 카메라로 기록됩니다. 이 이미지는 다음 이미지 분석 프로그램 분석 할 수 있습니다. 우리는 모드 (그림 2A)를 측정 마술 지팡이 도구를 사용하여 한 번의 마우스 클릭으로 세포의 수지상 트리를 요약 할 수 있습니다 이미지 프로 플러스를 사용합니다. 이 프로그램은 다음 수지상 트리에 포함하고 MS 엑셀로 수출 영역을 계산합니다. 데이터의 통계 분석은 GraphPad의 프리즘 소프트웨어 (아래)로 이루어집니다. </li><li> 지점 지점의​​ 개수입니다. Purkinje 세포 수지상의 나뭇 가지 포인트의 높은 분지와 훌륭한 형태로 인해 수동으로 계산해야합니다. Purkinje 세포의 20x 이미지 파일은 어도비 포토샵을 사용하여 화면의 대부분을 포함하는 등 확대됩니다. 그런 다음 모든 지점 지점 계산하고 밝은 점 (그림 2B)로 표시됩니다. </li></ol> 문화 기간 동안 Purkinje 세포 수지상 나무의 개발을 모니터링 Purkinje 세포에 구체적으로 EGFP을 표현 Pcp2-EGFP 마우스에서 파생 Organotypic 슬라이스 문화는 문화에 몇 일 동안 개별 셀의 형태를 연구 할 수 있습니다. 이 방법은 문화 기간 동안 수지상 나무의 성장과 발전은 멋지게 문서화 할 수 있습니다. 생활 식별 Purkinje 세포는 10 배 목적과 문화 기간 동안 매 2 차 또는 3 일 촬영했다. 이 저전력 목적은 형광등과 조명으로 인해 셀에 phototoxic 손상을 방지하고 최소화하기 위해 선정되었습니다. 그림 3은 생활 문화에 사진 Purkinje 세포의 두 가지 예를 보여줍니다. 첫 번째 셀은 체외 (그림 3, AC) 7 일까지 체외에서 2 일에서졌습니다. 그것은 분명입니다 dendriti이 기간 동안 세포의 C 트리은 다음과 같은 여러 가지 새로운 지점을 증가하고 크기가 확장됩니다. 두 번째 예에서, Purkinje 세포는 체외 (그림 3, DF)에 4-11일에서졌습니다. DIV4에 참석 작은 수지상 나무는이 기간 동안 실질적으로 확장됩니다. 두 예는 Purkinje 세포의 수지상 나무의 대부분은 실제로 문화 발전 않은 문화 시대의 끝 부분에 제시 보여준다. Purkinje 세포 수지상 나무의 개발은 PKC 또는 mGluR1 자극에 의해 저해된다 Organotypic 소뇌 슬라이스 문화는 11 일 동안 배양 하였다. 문화의 일부가 문화가 해결 될 때까지 PMA (50 NM), PKC 또는 DHPG (10 μM), mGluR1 작용제을 자극 phorbol 에스테르, 하나와 대우, 체외에서 2 차 일에 시작합니다. 두 화합물은 Purkinje 세포 수지상의 성장 7, 8, 9, 5을 억제하고 제한하는 이전에 표시되어 있습니다.치료 컨트롤에 조각 Purkinje 세포는 안티 GFP (그림 4D)로 immunostaining에 의해, 항 Calbindin immunostaining (그림 4A) 또는 EGFP - 표현 Purkinje 세포와 문화의 중 시각화 된 전형적인 크고 높은 분기 수지상 나무를 개발했다. PMA로 치료 문화에서 수지상 나무의 형태는 뿌리깊은 변경되었습니다. 수석이 두꺼워 나타나 단 몇 짧은 사이드 가지를했다. 많은 Purkinje 세포는, 컨트롤 문화 달리, 하나의 기본 dendrite는 전지 본체에서 냄새가 나는데과 함께 더 이상 유니 폴라 없었하지만, 두 개 더 주 수석 (그림 4B, E)를 개발했다. 수지상 나무의 적용 영역이 현저하게 (아래) 감소했다. 비슷한 상황은 DHPG - 처리 문화에 존재했다. Purkinje 세포의 수지상 나무는 크게 크기 감소 및 브랜칭이 현저하게 (그림 4C, F) 감소했다. 그러나 일부 qualitat도있었습니다필자의 차이는 PMA-처리 문화를 비교했다. 이 수지상 가지의 더 두꺼워은 없었고 차 수석이 신호 이벤트가 유사하지만 동일하지 수 있습니다 PMA와 DHPG - 처리 Purkinje 세포에가는 것을 제안합니다 (그림 4C, F) 많은 아주 짧은 보조 수석를 실었다. 위에서 설명한 Purkinje 세포 수지상 나무의 크기와 정량 평가를위한 지사 지점의 정량 평가, Purkinje 세포 수지상 나무와 Purkinje 세포 당 분기 지점의 수의 크기가 측정됩니다. 적어도 세 독립적 인 실험의 결과는 함께 풀링, 20 셀의 최소 분석 할 필요가있다. 제어 실험을위한 수지상 나무의 적용 영역의 평균이 결정에서 100 %로 설정하고, 다른 실험의 값이 그에 따라 %의 값으로 표현됩니다 있습니다. 데이터의 통계 분석은 GraphPad의 프리즘 소프트웨어와 함께 이루어집니다. 우리는하지 때문에결정 모든 값이 가우스 분포의 일부 가정, 우리는 측정 값의 이러한 분포를 가정하지 않는 통계 테스트를 사용합니다. 통계적 유의미성에 대해 여러 조건과 테스트를 비교를 들어, 우리는 GraphPad의 프리즘에서 던의 포스트 테스트에 구현 예를 들어, 같은 순위 기반의 통계에 대한 게시물 임시 검사에 대해 적절한 절차에 이어 Kruskal-월리스 테스트를 사용합니다. 결과는 일반적으로 막대 그래프로 표시됩니다. 이러한 통계 평가의 예는 그림 5에 있습니다. 수지상 나무 크기의 분석 (그림 5A)와 Purkinje 세포 당 분기 포인트 (그림 5B)의 수를 모두 제어 상태와 DHPG 또는 PMA 치료 사이의 명확한 차이를 보여줍니다. 두 매개 변수는 Kruskal-월리스 시험에 따라 P &lt;0.001의 통계적 유의미성과 달랐다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig1.jpg" /> Figu1 다시. Purkinje 세포 EGFP - 라벨. Pcp2-EGFP 쥐 모든 Purkinje 세포 특급 EGFP. 따라서 일부 Purkinje 세포의 수지상 나무 (긍정적, A에 표시된 EGFP 채널에 부정적인 표시된 방지 Calbindin 착색의 사람들이 표현 EGFP (A에서 EGFP 채널)와 수지상 나무를 중복으로 이웃 Purkinje 세포 안 때 개별적으로 볼 수 있습니다 B의 붉은 색 채널에). 스케일 바 = 50 μm. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig2.jpg" /> 그림 2. Purkinje 세포의 수지상 매개 변수의 측정. (A). 수지상 나무의 크기는 쉽게 이미지 분석 소프트웨어 이미지 프로에서 하나의 마우스 클릭으로 Purkinje 세포의 윤곽을 추적 플러스 마술 지팡이 도구를 사용하여 측정 할 수 있습니다. 마법 지팡이 도구는 셀 소마 모든 수지상 지점을 포함하여 전체 수지상 트리가 완전히 라인들로 둘러 쌓여 있고 그러한 사용됩니다. (B). 지점 지점의​​ 수는 불은입니다Purkinje 세포의 이미지를 수동으로 nted. 모든 분기점은 노란색 점으로 표시됩니다. 스케일 바 = 50 μm. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig3.jpg" /> 그림 3. Purkinje 세포 수지상 나무의 개발을 모니터링. 확인 된 Purkinje 세포는 수지상 나무의 성장을 모니터링하기 위해 반복적으로 촬영되었다. (AC) : Purkinje 세포의 수지상 나무가 DIV7 때까지 체외 (DIV) 2 일부터 성장과 개발. 이 문화 기간 동안 수석의 지속적인 성장과 분기가 있습니다. (DF) : Purkinje 세포의 수지상 나무가 DIV11까지 DIV4에서 성장과 개발. 수지상 나무는이 문화 기간 동안 실질적으로 확장됩니다. 스케일 바 = 50 μm. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig4.jpg" /> 4 그림. Purkinje 세포 수지상 나무의 개발은 PKC 또는 mGluR1 stimulati에 의해 저해된다의 (A), (D) :. 잘 개발 수지상 나무 치료 제어 세포. (B), (E) : PMA 처리 수석 9 일이 지나면 두꺼워 표시하고 수지상 나무는 강력 크기에 감소된다. 세포는 종종 자신의 분극을 잃게 양극성 (E)됩니다. (C), (F) : DHPG 치료의 9 일 후 수지상 나무는 크게 크기로 줄어 듭니다. PMA 처리는 달리, 많은 아주 좋아하고 짧은 사이드 가지 기본 및 보조 수석에 존재한다. 세포는 종종 자신의 분극을 잃게 양극성 (F)이된다. (- F D)에 Pcp2-EGFP 마우스에서 파생 된 문화에서 - (C)와 EGFP 표현의 Purkinje 세포는 안티 Calbindin immunostaining으로 시각화했다. 스케일 바 = 50 μm. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig5.jpg" /> 그림 5. Purkinje 세포 수지상 나무의 크기와 가지. 수량 측정을의 양적 평가는 보여주고 수지상 나무 크기 (상단 막대 그래프)와 numbe 모두지점 포인트 (낮은 막대 그래프)의 연구가 크게 PMA 또는 DHPG 치료 후 감소된다. 제어 수지상 나무와 치료 문화의 Purkinje 세포의 수지상 나무 사이의 차이는 P로 크게 &lt;0.001이었다.

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	<li>Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TrkB+for+synapse+elimination+in+developing+cerebellar+Purkinje+cells.">Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells.</a> Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).</li><li>Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid-related+orphan+receptor+alpha+controls+the+early+steps+of+Purkinje+cell+dendritic+differentiation.">Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation.</a> J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).</li><li>Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+control+of+dendritic+growth+and+development+of+cerebellar+Purkinje+cells.">Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).</li><li>Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+slice+cultures.">Cerebellar slice cultures.</a> Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).</li><li>Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+size+of+the+dendritic+tree+does+not+protect+Purkinje+cells+from+excitotoxic+death.">Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death.</a> J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).</li><li>Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mediates+Purkinje+cell+dendritic+development+via+lysyl+oxidase+propeptide+and+NF-&#954;B+signaling.">mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-&#954;B signaling.</a> Neuron. 68, 45-60 (2010).</li><li>Metzger, F., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activity+modulates+dendritic+differentiation+of+rat+Purkinje+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).</li><li>Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+development+of+cerebellar+Purkinje+cells+in+slice+cultures+from+protein+kinase+C?-deficient+mice.">Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice.</a> Neuroscience. 110, 675-689 (2002).</li><li>Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+class+I+metabotropic+glutamate+receptors+limits+dendritic+growth+of+Purkinje+cells+in+organotypic+slice+cultures.">Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein.">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li><li>Weyer, A., Schilling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+cell+type-specific+expression+of+the+neuronal+marker+NeuN+in+the+murine+cerebellum.">Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum.</a> J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).</li></ol>

동물 실험은 1986년 11월 24일 (86/609/EEC)의 유럽 커뮤니티위원회 지침에 따라 수행되었으며, 검토 및 스위스 당국에 의해 허가되었습니다. 저자는 공개 할 수 없어요.

방법은 organotypic 소뇌 슬라이스 문화에 Purkinje 세포 수지상 개발을 연구하고 양적 수지상 나무의 크기와 수지상 지점 지점의​​ 수를 측정하여 Purkinje 세포 수지상 확장을 평가할 수 있습니다 여기에 소개했다. 물론, Purkinje 세포 수석의 더 광범위하고 정교한 정량 분석​​은 총 수지상의 길이를 결정하는 Sholl 분석을 수행하거나 수지상 나무의 프랙탈 차원을 결정하여 예를 들어, 수 있습니다. ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 조직 문화 삽입물 </td><td> Millipore </td><td> PICM 03,050 PICM ORG50 </td><td> PICMORG50 삽입은 낮은 림을 가지고 현미경에서 라이브 문화의보고 수 </td></tr><tr><td> 가상 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11012044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax 1 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050038 </td><td></td></tr><tr><td> 기초 Medum 독수리 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41010026 </td><td></td></tr><tr><td> 말 혈청 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 26050070 </td><td></td></tr><tr><td> Phorbol 12 myrista테 13 아세테이트 (PMA) </td><td> Tocris </td><td> 1201 </td><td></td></tr><tr><td> (RS) -3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) </td><td> Tocris </td><td> 0342 </td><td></td></tr><tr><td> 토끼 반 calbindin D-28K </td><td> Swant </td><td> CB38 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 NeuN, 클론 A60 </td><td> Chemicon, Millipore </td><td> MAB377 </td><td></td></tr><tr><td> 토끼 반 GFP </td><td> Abcam </td><td> Ab290 </td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures

사람들이 시상면에서 엄격하게 지향하고 작은 설치류 3 출생 후의 시대에 주로 개발하고 인상적인 수지상 트리를 가지고 있기 때문에 Purkinje 세포는 수지상 개발을 공부하기위한 매력적인 모델 시스템입니다. 또한, 여러 가지 항체 안티 Calbindin의 D28K있는 모든 프로세스를 포함 선택적으로하고 집중적으로 라벨 Purkinje 세포가 가장 널리 사용되는 어떤 사용할 수 있습니다. 살아있는 세포에서 수석의보고를 들어, Purkinje 세포 11 선택적으로 EGFP을 표현 마우스 잭슨 실험실을 통해 사용할 수 있습니다. Purkinje 세포 수지상 나무의 수지상 확장의 대부분은 실제로 문화 기간 4 동안 진행되기 때문에 Organotypic 소뇌 슬라이스 문화 전지는 Purkinje 세포 수지상 개발을 쉽게 실험 조작 할 수 있습니다. 여기 organotypi에서 재배 Purkinje 세포의 수지상 형태를보고하고 분석을위한 짧은 신뢰할 수있는 쉬운 프로토콜을 제시C 소뇌 슬라이스 문화. 다양한 용도를 들어, Purkinje 세포 수지상 나무의 양적 평가는 바람직하다. 우리는 신속하고 쉽게 방지 calbindin 스테인드 소뇌 슬라이스 문화로부터 결정될 수있다 두 개의 매개 변수, 수지상 나무의 크기와 분기점 번호에 여기에 집중. 이 두 매개 변수는 Purkinje 세포 수지상 나무의 변경 안정적이고 민감한 측정을 얻을 수 있습니다. 단백질 키나제 C (PKC) 활성 PMA 우리는 수지상 개발의 차이를 시각적으로 그리고 양적 평가 방법을 보여줍니다 metabotropic glutamate 수용체 1 (mGluR1)와 트리트먼트 예를 사용합니다. 다양한 수지상 나무, 선택과 강렬한 immunostaining 방법, 수지상의 메커니즘을 공개에 대한 Purkinje 세포 강력한 모델 시스템을 Purkinje 세포 특정 EGFP 발현과 수지상 성장과 마우스 모델의 기간을 커버 organotypic 슬라이스 문화의 존재의 결합 개발.

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The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

우리는 organotypic 소뇌 슬라이스 문화에서 자란 개별 Purkinje 세포의 수지상 나무의 형태를 확인하고 양적 엉덩이에 할 수 있습니다 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 Purkinje 세포 수지상 개발의 메커니즘에 대한 연구를 촉진하기위한 것입니다.

Organotypic 슬라이스 문화의 Purkinje 세포 수지상의 형태학의 분석

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

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Neuroscience

18.4K 조회수.  University of Basel. 우리는 organotypic 소뇌 슬라이스 문화에서 자란 개별 Purkinje 세포의 수지상 나무의 형태를 확인하고 양적 엉덩이에 할 수 있습니다 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 Purkinje 세포 수지상 개발의 메커니즘에 대한 연구를 촉진하기위한 것입니다.

비디오: The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

여러 스케일에서 디지털의 연결 형태론의 자동 숄 분석

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

연구

신경과학

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotypic 소뇌 문화 : Apoptotic 도전과 감지

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

네크로 텍스의 Organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Hippocampal 슬라이스 문화의 시냅틱 단백질의 포스트 퍼가기 Immunogold 라벨링

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.