우리는 NIH (상 번호 MKL에 R00 NS072192, 까악 까악로 AS.L.에 HD029178, 2 RO1 NS032457)의 지원에 감사합니다. MKL은 어린이 병원 보스턴의 경력 개발 친목 / 하버드 의과 대학의 쇼어 친목과 알프레드 P. 슬로안 재단의 연구원의 수상자이다. 까악 까악는 하워드 휴즈 의학 연구소의 탐정입니다.

1. 배아 절연 / 준비 이 기술은 마우스 또는 쥐 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 CSF 수집 기술 및 마우스 배아의 뇌와 대뇌 피질 explant의 절개를 보여줍니다. 우리는 쥐 대 일반 기술 내에 존재 마우스의 중요한 차이점에 대해 언급합니다. 태아 연령 준비 시스템, E1은 쥐의 플러그 당일로 분류하고 있으며, E0.5는 마우스의 플러그 당일로 분류되어 있습니다. <ol><li> Sylgard 실리콘 탄성체와 마이크로 분해 요리를 준비합니다. Sylgard 184 실리콘 탄성체는 A와 파트 B. 부품은 A와 파트 B는 무게 나 부피 10시 1분 비율 혼합되어 두 부분 액체 구성 요소 부분으로 제공됩니다. 액체 구성 요소가 혼합 한 후, 음식의 전체 표면을 충당하기 위해 페트리 접시에 sylgard 탄성체를 따르다. 일부 기포가 경화 과정에서 사라지고 존재 할 수 있습니다. 에 페트리 접시 뚜껑을 놓고 elastom 수응급실은 치료가 있습니다. 엘라스토머는 24 시간 동안 실온에서 치유하거나, 빠른 경화 높은 온도 (예 : 37 ° C)에서. 할 수 있습니다 액체 구성 요소가 더욱 강화되면, 분해 요리 사용할 수 있습니다. 요리는이 절차에 따라 잘 청소되어 제공 여러 실험 반복적으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 마이크로 모세관 피펫 (바늘)의 준비. 마이크로 모세관 피펫은 열을 적용하여 준비하고 다음 설정을 사용하여 Narishige PC-10 수직 micropipette의 풀러를 사용 당겨됩니다 : 한 단계 끌어 오기를, 히터 # 2 58로 설정, 100g의 풀다운 무게. micropipette의 고급 팁 신중하게 잘 # 55 포셉을 사용하여 해제 부러 있습니다. 바늘의 결과 평균 내경 85 μm이다. </li><li> CSF의 흡인에 대한 흡인기 어셈블리를 준비합니다. 마이크로 플런저는 모세관 바늘로 마이크로 모세관 피펫와 함께 제공 넣습니다. 또는 t를 연결되어있는 흡인기 튜브 조립체의 끝 부분에 플라스틱 일회용 필터를 부착마이크로 모세관 피펫을 O. 흡인기 조립체의 반대편에 위치에 가스켓을 통해 바늘을 밀어. </li><li> 쓰레기에서 Sylgard로 만든 마이크로 해부 접시에 절연 배아를 전송합니다. </li><li> 배아는 명확하게 노출되어 있도록 특별히 배아 멤브레인 및 조직을 제거합니다. 각 조직 레이어 먼저 자궁 벽과 다음 decidua가 - 수 고급 iridectomy 가위 (예 : 정밀 과학 도구 # 15000-02)를 사용하여 해부. 각 주입 사이트에서 먼저 자궁 벽은 다음 decidua는 자궁의 긴 축에 평행 예리하게 찔 할 수 있으며, 절개 그런 다음 고급 집게를 사용하여 추가로 열 수 있습니다. decidua은 태아 세포막을 노출 비슷한 절개 후 제거 할 수 있습니다. 케어는 태아 막의은 예리하게 찔 또는 구멍되지 않도록 행사되어야한다. </li><li> 멸균 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)으로 세척하고 피펫뿐만 아니라 kimwipe 또는 필터를 사용하여 주변의 배아에서 초과 액체를 제거신문은 삼각형으로 자른다. </li></ol> 2. 심실 CSF 컬렉션 <ol><li> 해부 현미경 아래에서 배아를 시각화 : 마우스, 배 하나가 난자의 시상 전망을 같은 것으로, 그 옆에 누워해야합니다. 배아는 뒷면에 거짓말처럼 쥐 배아 E16 이상으로, 꼬리 방향으로 두개골에서의 긴 평면 차원을 따라, 그 등쪽 척추의 배아를 배치. 이러한 방식에서 CSF는 오른쪽과 왼쪽 모두 측면 심실에서 수령하실 수 있습니다. </li><li> 꾸준히 피펫가 삽입 된 후에 neuroepithelial 세포를 문의하지 시도, 측 방향 심실, mesencephalic 심실 또는 cisterna 마그나에 마이크로 모세관 피펫를 삽입합니다. 마우스 배아 E14.5 이상은 CSF는 우심실에서 흡입 한 후 바늘을 제거하고 왼쪽 심실에 삽입 할 수 있습니다. 태아의 심실과 신경 튜브의 명백으로 인해 젊은 E14.5보다전체 CSF 볼륨은 종종 하나의 바늘 삽입과 측면 심실에서 흡입 할 수 있습니다. 연결 심실의 발달 시간과 명백이 약간 다를 수 있으며, 따라서, 마이크로 모세관 피펫도 최대 CSF 볼륨을 수집하는 cisterna 마그나에 삽입 할 수 있습니다 그러나, 항상 그런 것은 아닙니다. </li><li> 마이크로 모세관 피펫은 신중하게, 측 방향 심실, mesencephalic 심실 또는 cisterna 마그나에 삽입하고 부드럽게 부정적인 압력을 생성하고 CSF를 대기음하는 중 마이크로 플런저를 사용하여 피펫으로 CSF를 aspirating 시작되면, 또는를 제공하여 CSF는 부드럽게 천천히 제어 방식으로 마이크로 모세관 피펫으로 흘러 시작되도록 입으로 만들어 부드러운 부정적인 압력. 우리는 뷰어가 이러한 방식에 대한 제도적 정책에 대한 자신의 지역 당국과 함께 확인하는 것이 좋습니다. </li><li> 부정적인 압력을 적용하고 마이크로 모세관 피펫으로 CSF를 수집하고 있습니다.E16.5/E17 이하의 마우스와 쥐 배아에서 모두는, 마이크로 모세관 피펫 나이 배아에서 인치입니다 머리의 측면에 형성 디 보트의 모습으로 약간 심실 붕괴를 관찰 할 수 있습니다 뇌의 큰 크기로 인해, 그것은 머리를 축소 관찰 할 수없는 경우가 있습니다. </li><li> 압력을 가해 그만하고 부드럽게 측면 심실에서 마이크로 모세관 피펫을 제거합니다. </li><li> 부드럽게 얼음에 냉각 된 Eppendorf 튜브에 CSF 샘플을 배출. </li><li> 동물의 전체 쓰레기에서 CSF를 계속 수집하고 같은 튜브에 샘플을 수영장을 보유하고 있습니다. </li><li> 모든 오염 세포를 제거하는 10 분 동안 4 ° C에서 10,000 XG에 원심 분리기. </li><li> neuroepithelial 셀이나 적혈구를 오염의 흔적에 대한 샘플을 분석합니다. 오염의 징후는 일반적으로 흐릿하거나 핑크 / 레드 나타나는 유체, 또는 혈액 물들어있는 곳이있는 펠릿의 존재에 의해 표시됩니다. 원심 분리 후, CSF는 셀이나 세포 파편의 증거에 대한 미세 분석 할 수 있습니다. 오염의 징후가있는 경우 유체는 폐기해야합니다. 추가 제어 기능으로, 펠릿 내용은 셀에 물들 일 수 있습니다. 깨끗한 CSF 샘플은 세포 배양, 대뇌 피질의 문화, 분석법, 서부 얼룩, 엘리사, 기타 assays에 사용하실 수 있습니다. 맑은 CSF는 새로운 살균 Eppendorf 튜브로 전송해야합니다. 샘플은 현재 액체 질소로 냉동 기타 샘플, 또는 스냅과 풀링 및 -80 ° C.에 저장, 분석에 사용될 수 있습니다 유체의 작은 샘플의 동결 융해는 작은 볼륨 감소 및 단백질 농도의 변화가 발생할 수 있습니다. 이 문제는 샘플을 건조 동결하여 방지 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 대뇌 피질의 Explant의 해부 <ol><li> Sylgard로 만든 마이크로 해부 요리로 쓰레기 분리 E14.5 배아를 전송합니다. </li><li> 단계 1.5에서 설명 된대로 추가 - 배아 멤브레인 및 조직에서 배아를 제거합니다. </li> &lt;멸균 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)과 피펫을 사용하여 주변의 배아에서 초과 액체를 제거와 리&gt; 워시. </li><li> 배의 나머지 (그림 1A)에서 머리를 분리 자궁 경부 지역을 해부. </li><li> 고급 메스 (안과 칼을)를 사용, 두피의 중간 선을 끊을. 고급 집게로이 절개의 각 측면을 파악하고 피부를 제거합니다. 다음, 개발 두개골의 중간 선의 길이를 실행 절개를 만들기 위해 iridectomy 가위를 사용합니다. 그 후, 개발 두개골의 앞쪽과 뒤쪽 끝에서 두 개의 절개, 거리의 약 1 / 3합니다. 두개골의 &quot;날개&quot;를 파악하기 위해 고급 집게를 사용하십시오 절개의이 부분으로 인해, 그리고 피질 (그림 1B) 노출 개발 두개골 조직을 제거합니다.주세요 </li><li> 오른쪽과 왼쪽 대뇌 피질의 뇌를 (그림 구분 중반 sagital 비행기에서 중간 선을 따라 메스를 이등분에게 뇌를 사용1B, C). 피아와 거미집 모양의은 피질에 부착 남아 있으며, 경질은 개발 두개골과 함께 제거됩니다. </li><li> 각각 대뇌 피질 반구를 준비합니다. 왜 그렇게 당신이 ganglionic 예하와 개발 피질 (그림 1C, D)를 참조 할 수있는 반구 안쪽면을 넣습니다. </li><li> 메스를 사용, 개발 후각 망울에 꼬리 대뇌 피질의 neuroepithelium을 통해 코로나 절개를합니다. 이 절개는 측면과 안쪽 ganglionic eminences의 앞쪽 경계에서 시작하고, 개발 대뇌 피질의 퇴화 기관 (그림 1E)의 앞 cingulate 지역을 확장해야합니다. </li><li> 측면 ganglionic 예하 (그림 1 층)의 뒤쪽 경계에서 불과 꼬리 또 다른 코로나 절개를합니다. 이 절개는 또한 개발 대뇌 피질의 퇴화 기관의 안쪽 벽에 ganglionic 예하의 측면 경계에서 연장해야합니다. </li><li> 대뇌 피질의 &quot;플랩&quot;crea를 철회피질에 기계적 손상을 방지하기 위해 200 μl pipettor 함께 제공 HBSS의 스트림에서 메스 나 부드러운 압력을 사용하여 단계 3.7 및 3.8에서 만든 두 개의 절개로 테드. 그런 다음 개발 피질 (그림 1G, H)에서 측면 ganglionic 예하 분리의 경계를 따라 횡 방향 절개를합니다. 그런 다음, 측 방향 대뇌 피질의 표면이 interhemispheric 벽을 충족 네크로의 꼭대기에서 개발 해마와 내측 telencephalon의 대뇌 피질의 신발을 멀리 해부. </li><li> 개발 피질 (그림 1H)에서 측면 ganglionic 예하 분리의 경계를 따라 횡 방향 절개를합니다. </li><li> 해부하는 대뇌 피질의 explant에서 Sylgard 판에 여분의 해부 조직을 제거합니다. 하나는 여분의 해부 조직을 멀리 피펫에 신선한 HBSS 버퍼로 부드럽게 pipetting을 사용할 수 있습니다. 해부 피질 아래에 직면 수막 측 (그림 1I)와 지금입니다. </li></ol><ol><li> 유리 피펫에 연결된 백금 와이어 루프를 준비합니다. 유리 피펫의 끝 부분에 삽입 접힌 백금 와이어로 유리 피펫을 가열. 백금 와이어 루프의 끝을 비틀으로 루프의 크기는 증가 또는 감소, 그리고 루프는 원하는 explant의 크기에 맞게 형성 될 수있다 할 수 있습니다. (이것은 사전에 준비 재사용 할 수 있습니다.) </li><li> 루프를 소독하기 위해 백금 와이어의 끝을 가열. </li><li> 해부하는 대뇌 피질의 explant를 분리하고 와이어 루프와 함께 사용하기 위해 작은 금액을두고, 부드러운 pipetting하여 추가 HBSS 미디어를 제거합니다. </li><li> 4cm 직경 이미징 요리에 1cm 폴리 카보네이트 막를 놓습니다. </li><li> 수막 사이드가 직면 있도록 백금 와이어 루프의 측면을 사용하여 부드럽게 피질을 플립. </li><li> 루프의 중간에 explant를 삽입 할 수있는 고유 수압의 힘을 사용하여, 해부 접시에서 대뇌 피질의 explant을 들어평면 비행기에 explant을 들어. </li><li> 부드럽게 폴리 카보네이트 막에 explant을 배치하고, 멀리 explant은 심실 표면 막과 접촉을 시청할 수있는 평면 비행기에서 막에 남아 있도록 백금 와이어 루프를 올린다. </li><li> 부드럽게 멤브레인을 들고 막 아래 CSF 또는 다른 미디어의 50 μl를 피펫. </li><li> 이미징 요리를 표지, 지속적인 세포 증식 및 explant의 성장을 지원하기 위해 24 시간에 5 ​​% CO 2에서 humidified 차 컨테이너에 배치하고, 37 ° C에서 알을 품다. 그림 2는 최종 대뇌 피질의 explant 요리 준비의 개략도를 도시한다. </li></ol>

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	<li>Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+in+cerebrospinal+fluid+and+plasma+of+fetal+rats+during+development.">Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development.</a> Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).</li><li>Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cerebro-spinal+fluid+protein+composition+in+early+developmental+stages+in+chick+embryos.">Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).</li><li>Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival,+proliferation,+and+neurogenesis+in+chick+embryos.">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).</li><li>Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+chick+embryonic+cerebrospinal+fluid.">Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).</li><li>Parada, C., Gato, A., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+embryonic+cerebrospinal+fluid+proteome+has+greater+apolipoprotein+and+enzyme+pattern+complexity+than+the+avian+proteome.">Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome.</a> Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).</li><li>Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+proteomic+analysis+of+human+and+rat+embryonic+cerebrospinal+fluid.">A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid.</a> Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).</li><li>Desmond, M. E., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+brain+enlargement+requires+cerebrospinal+fluid+pressure.">Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure.</a> Developmental Biology. 57 (1), 188-198 (1977).</li><li>Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+at+the+brain-cerebrospinal+fluid+interface.">Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).</li><li>Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells.">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).</li><li>Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid.">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).</li><li>Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+plays+a+key+role+in+embryonic+cerebrospinal+fluid+trophic+properties+over+chick+embryo+neuroepithelial+stem+cells.">FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells.</a> Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).</li><li>Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid:+regulator+of+neurogenesis,+behavior,+and+beyond.">The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).</li></ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

심실 CSF 수집에 대한 설명 방법은 세포 assays 9 수의 안정적인 단백질 구성하고 일관된 활동과 배아 CSF의 비교적 순수한 샘플을 굴복했다. 좋은 수집 기술 개 E14.5 마우스 쓰레기의 크기로, 하나는 CSF의 10-15 μl를 수집하는 기대 수 있으며, E16 쥐의 쓰레기로부터, 하나는 CSF의 50-90 μl에 대해 수집 기대할 수 있습니다. 이 컬렉션 기술은주의 관찰, 원심 분리하고, 세포 파편 또는 혈액 가미의 ?...

CSF는 개발 neuroepithelium 1-6 bathes 및 개발 뇌 8-12에 대한 단서를 홍보하는 중요한 압력 7 성장을 제공하는 복잡한 유체입니다. 뇌 개발의 과정을 통해 CSF를 연구하기 위해, 우리는 개발 6,9의 다양한 단계에서 쥐 또는 마우스 배아를 개발에서 심실 CSF를 분리하는 기술을 개발했다. 고립 이전 방법은 유리 마이크로 바늘을 사용하고 마이크로 주사기 1,2을 사용하여 CSF를 분리 포함되어 있습니다. 우리의 방법 누구의 팁 향상된 조직 침투를위한 초 미립 지점을 만들 당겨 된 유리 마이크로 모세관 피펫을 이용하고 있습니다. 그 심실 CSF 모음 압력 부드러운 변화를 제어 할 수 있도록 유리 마이크로 모세관 피펫는 흡인기에 연결되어 있습니다. CSF 신호의 줄기 세포 영향을 조사하기 위해, 우리는 대뇌 피질의 explants를 해부 폴리 카보네이트 멤브레인에 넣어, 그리고 적절한 세제곱에 흘려 보내곤lture 매체 CSF 샘플을 9 보충. 이 기술을 통해 미디어의 감소 권 CSF 9 효율적으로 사용할 수 있도록, 문화, 조직을하기에 충분한 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Wiretrop II 모세관 바늘 </td><td> Drummond 과학 </td><td> # 5-000-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> 엘스 워드 접착제 </td><td> # 184 SIL ELAST 키트 </td><td></td></tr><tr><td> 흡인기 관 조립 </td><td> 시그마 </td><td> # A5177-5EA </td><td></td></tr><tr><td> 일회용 필터 </td><td> 벤 투리 관 또는 지방 약국 </td><td> 사용할 수 없습니다 </td><td> 표준 담배 필터 </td></tr><tr><td> Roundstock의 opthalmic의 칼 (15도 찔린 칼) </td><td> 세계 정밀 기기 주식회사 </td><td> # 500250 </td><td></td></tr><tr><td> 35mm 유리 바닥 문화 요리 </td><td> MatTek 주식회사 </td><td> # P35G - 1.5-14-C </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 백금 - 이리듐 와이어 </td><td> Tritech 연구 </td><td> # PT-9010-010-3FT </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore 트랙 - 에칭 막 </td><td> 워트 먼지 </td><td> # 09-300-57 </td><td></td></tr><tr><td> 행크스 균형 소금 솔루션 </td><td> 피셔 과학 </td><td> # SH30031.FS </td><td></td></tr><tr><td> Iridectomy의 가위 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> # 15000-02 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants

CSF 개발 전역과 성인에서 동적으로 변화 프로테옴과 복잡한 유체입니다. 배아 개발 과정 초기 CSF는 앞쪽 신경 튜브의 폐쇄시 양수에서 차별화합니다. CSF 볼륨는 심실과 맥락막 얼기 생성 CSF 릴 neuroepithelial 전구 세포 등의 후속 일 동안 증가합니다. 개발 뇌와 척수의 신경 줄기 세포의 배아 CSF 연락처는 꼭대기, 심실 표면. CSF는 개발 뇌의 확장을위한 중요한 유체 압력을 제공하며, 시간적 특정 방식으로 신경 전구 세포에 요소를 홍보하는 중요한 성장을 배포합니다. CSF의 기능을 조사하기 위해 피하거나 개발 telencephalic 조직에서 오염없이 배아 CSF의 순수한 샘플을 분리하는 것이 중요합니다. 여기, 우리는 사용할 수있는 심실 배아 CSF의 비교적 순수한 샘플을 분리 할 수​​있는 기술을 설명질량 분광법, 단백질 전기 영동, 그리고 세포와 기본 explant 문화 등의 실험 assays 다양한. 우리는 미디어 또는 CSF의 감소 볼륨과 개발 대뇌 피질의 조직을 성장하기 위해 다공성 폴리 카보네이트 멤브레인에 대뇌 피질의 explants를 해부과 문화하는 방법을 보여줍니다. 이 방법을 실험 대상 세포에 CSF 프로테옴의 생물학적 활동을 조사하기 위해 다양한 연령이나 조건에서 CSF를 사용하여 수행 할 수 있습니다.

CSF 컬렉션은 깨끗하고 투명한 액체를 얻을 수 있습니다. 기음과 Eppendorf 튜브에 빨간색이나 노란색 물들어 유체에 의해 증명으로 혈액의 오염의 증거가 없어야합니다. 또한 기음과 Eppendorf 튜브에 조직의 증거가 없어야합니다. CSF가 centrifuged 때, 하나는 오염이 없다는 것을 보장하기 위해 미세 CSF를 평가 할 수 있습니다. 오염의 징후가있는 경우, CSF는 폐기해야합니다. 한 E14.5 마우스 쓰레기에서 한...

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Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

심실 뇌척수 (CSF)는 배아의 초기 뇌 발달 동안 neuroepithelial과 대뇌 피질 전구 세포를 bathes. 여기에는 생물학적 기능을 조사하기 위해 다양한 연령대의 쥐 배아에서 심실 CSF를 분리하기 위해 개발 된 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 우리의 대뇌 피질 explant의 해부와 문화 매체 또는 CSF의 최소한의 볼륨으로 explant 성장을 허용 문화 기술을 보여줍니다.

해부하는 뇌 두피 Explants와 함께 사용하기위한 쥐 태아의 뇌척수의 절연

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.8K 조회수.  VA Greater Los Angeles Healthcare System. 심실 뇌척수 (CSF)는 배아의 초기 뇌 발달 동안 neuroepithelial과 대뇌 피질 전구 세포를 bathes. 여기에는 생물학적 기능을 조사하기 위해 다양한 연령대의 쥐 배아에서 심실 CSF를 분리하기 위해 개발 된 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 우리의 대뇌 피질 explant의 해부와 문화 매체 또는 CSF의 최소한의 볼륨으로 explant 성장을 허용 문화 기술을 보여줍니다.

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

연구

신경과학

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

병아리 배아에서 분리 및 해리 감각 뉴런의 문화

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed method based on molecular weight cut-off (MWCO) filtration and mass spectrometric analysis was combined with an offline high-pH reverse phase HPLC pre-fractionation step.
Secretion into CSF is the main pathway for removal of molecules shed by cells of the central nervous system. Thus, many processes in the central nervous system are reflected in the CSF, rendering it a valuable diagnostic fluid. CSF has a complex composition, containing proteins that span a concentration range of 8 - 9 orders of magnitude. Besides proteins, previous studies have also demonstrated the presence of a large number of endogenous peptides. While less extensively studied than proteins, these may also hold potential interest as biomarkers.
Endogenous peptides were separated from the CSF protein content through MWCO filtration. By removing a majority of the protein content from the sample, it is possible to increase the sample volume studied and thereby also the total amount of the endogenous peptides. The complexity of the filtrated peptide mixture was addressed by including a reverse phase (RP) HPLC pre-fractionation step at alkaline pH prior to LC-MS analysis. The fractionation was combined with a simple concatenation scheme where 60 fractions were pooled into 12, analysis time consumption could thereby be reduced while still largely avoiding co-elution.
Automated peptide identification was performed by using three different peptide/protein identification software programs and subsequently combining the results. The different programs were complementary rather than comparable with less than 15% of the identifications overlapped between the three.

A method for mass spectrometric analysis of endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF) is presented. By employing molecular weight cut-off filtration, chromatographic pre-fractionation, mass spectrometric analysis and a subsequent combination of peptide identification strategies, it was possible to expand the known CSF peptidome nearly ten-fold compared to previous studies.

인간의 중추 신 경계에서 Endopeptidomic 분석을 위한 시료 준비

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central nervous system and thus, can be used to analyze the diseased state of the brain or spinal cord without directly accessing these tissues. However, in mice it is difficult to obtain from the cisterna magna due to its closeness to blood vessels, which often contaminate samples. The area for CSF collection in mice is also difficult to dissect to and often only small samples are obtained (maximum of 5-7 &#181;L or less). This protocol describes in detail a technique that improves on current methods of collection to minimize contamination from blood and allow for the abundant collection of CSF (on average 10-15 &#181;L can be collected). This technique can be used with other dissection methods for tissue collection from mice, as it does not impact any tissues during CSF extraction. Thus, the brain and spinal cord are not affected with this technique and remain intact. With greater CSF sample collection and purity, more analyses can be used with this fluid to further aid neuroscience research and better understand diseases affecting the brain and spinal cord.

This protocol describes an improved technique for the abundant collection of cerebrospinal fluid (CSF) with no contamination from blood. With greater sample collection and purity, more analyses can be performed using CSF to further our understanding of diseases that affect the brain and spinal cord.

마 취 쥐에서 척수의 컬렉션에 대 한 개선된 방법

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관의 절연

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

프로 염증 성 사이토카인의 인트레이스렐 주입에 의해 유도된 광범위한 대뇌 피질 탈량의 쥐 모델

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

가압된 설치류에 폭발을 이용한 Neurotrauma의 효과 중간 대뇌 동맥

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

형광 매크로법을 사용하여 그대로 마우스 두개골을 통해 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

중국 마사지 기술 : 뇌성 마비 쥐의 운동 기능 향상

Abdominal Massage to Improve Motor Dysfunction in Rats with Cerebral Palsy

Cerebral palsy (CP) is a disease with a high disability rate and morbidity. The clinical symptoms of cerebral palsy are motor dysfunction and abnormal posture development, often accompanied by cognitive impairment. Massage, a traditional Chinese Medicine therapy, can coordinate Zang and Fu, regulate Qi and blood, make the viscera work more smoothly, and calm Yin and Yang. Furthermore, it has been an effective method for CP in clinical. This paper summarizes a set of simple and standardized manipulations of massage for young rats with CP, which is easy to follow. The procedure follows: first, massage of four limb acupoints, including Quchi (LI11) and Zusanli (ST36); second, massage of the abdomen acupoints Zhongwan (RN12), Tianshu (ST25), Guanyuan (CV4), and Qihai (CV6); and finally, massage of the abdomen of the rats. This set of massage methods considerably improved the motor function of young rats with CP and is simple, standardized, and easy to follow. We adapted this set of manipulation methods in animal models to promote the internationalization and standardization of massage.

저자 스포트라이트: 동물 모델을 사용하여 뇌성마비에서 마사지 요법의 잠재력 탐구 

Here, we present a set of massage manipulations in the rat model of cerebral palsy that can considerably improve the motor function of cerebral palsy rats.

뇌성마비가 있는 쥐의 운동 기능 장애를 개선하기 위한 복부 마사지

Cerebral palsy (CP) is a disease with a high disability rate and morbidity. The clinical symptoms of cerebral palsy are motor dysfunction and abnormal ...