우리는 IPSC 세대에 전문 지식과 프로토콜을 공유하기 위해, 각각 ChR2 및 Synapsin1-tdTomato 렌티 바이러스 구조에 대한 C. 차이를 K. Deisseroth 및 S. 이인제 감사, 와이오밍 레옹 기술 지원, 공유, 시약 및 전문 지식에 대한 총리 실험실의 구성원. 이 작품은 ELG에 경쟁력있는 연구 프로그램 (002-082 2008 NRF-CRP NRF)에 따라 연구 재단 싱가포르, 애보트 영양과 ELG에 우수 학술 센터 (ACE) 글락소 스미스 클라인 (GSK)에서 연구 수상에 의해 지원과 GJA, 교육, 과학, 한국의 기술 (교육 과학 기술부) 장관의 재원으로 한국 연구 재단의 세계 수준의 연구소 (WCI) 프로그램 (NRF)에 의해 (NRF 허가 번호 : 2009-003 WCI) GJA에

<ol>
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No conflicts of interest declared.

Optogenetics 뉴런 (13)의 정의 인구의 활성화를위한 시간과 공간 정밀도를 제공합니다. 실험에서, 현미경의 대물 필드는 전체 ChR2 표현 광 자극에만 피질 뉴런에 30 초 동안 조사 하였다. 이 시냅스 연결이 공동 문화 내에서 뉴런의 서로 다른 집단 사이에 형성되었는지를 우리가 결정하는 것을 허용했다. 우리의 결과는 photostimulation이 뉴런 ChR2을 표현하는 시냅스 대뇌 피질의 뉴런에서 시냅스 입력을받을 것을 증명하는 IPSC 파생 된 신경 세포 PSC 주파수를 증가시키는 것으로 나타났다. 이것은, 차례로, IPSC 유래 신경 성공적 피질 뉴런 회로에 통합하는 것이 확립. 본 공 배양 시스템의 생성을위한 몇몇 중요한 단계가있다. 그것은 도금을 진행하기 전에 마우스 NPC 파생 성상 세포 배양, 최소한의 세포 죽음으로 건강 있는지 확인하는 것이 중요하다다른 세포 유형. 대뇌 피질의 신경 세포와 인간의 NPC 건강 성상 세포에 잘 부착 및 전기 생리학 녹음 배양 조건에 크게 의존한다. 이 프로토콜의 다른 주요 단계는 성상 세포 배양 상에 전기와 대뇌 피질의 뉴런의 도금입니다. 다수의 셀이 전기 천공 후 다이로서, 적어도 6,000,000 피질 신경 세포를 24- 웰 플레이트에서 성상 세포 배양 물에 도금을위한 전기 천공되도록하는 것이 중요하다. 우리는보다 적은 세포 6,000,000 일렉트로 때, 뉴런의 생존 수를 전기 생리 학적 기록에 영향을 치밀 신경 네트워크를 형성하지 않은 것을 발견했다. 각 공동 배양 실험을 상이한 시험의 비교를 허용하기위한 전기 천공 피질 뉴런의 수는 일치한다. 소화 효소를 포함하는 모든 단계의 경우, 너무 오래는 세포 죽음으로 이어질 수 있으므로에 대한 소화 용액에서 세포를 남기지 않도록 필수적이다. 이방법은 다른 신경 세포와 시냅스 접촉을 형성하기 위해 환자 별 섬유 아세포 유래의 신경 세포의 기능을 스크리닝하는데 사용될 수있다. 신경 발달 장애 레트 증후군 (RTT)을 앓고있는 환자에서 섬유 아세포 유래의 신경 세포가 시냅스 전달 결함을 나타낸다 : RTT 뉴런 아마도 인해 덜 시냅스 연결 14 건강한 신경 세포에 비해 PSC 주파수 및 진폭의 상당한 감소를 나타낸다. 우리의 공동 문화 시스템은 발달 결함을 표시하는 신경 세포에 약물 효과를 검사 할 수 있습니다. 이 병에 걸린 사람의 NPC 시드 동안뿐만 아니라 신경 세포의 분화의 시간에 걸쳐 연속 화합물 노광 중에 관심 화합물의 첨가를 통해 수행 될 수있다. 본 공 배양 시스템은 또한 약물 테스트에 대한 모델로서 사용될 수 있지만,이 방법의 한계는 각 후보 화합물의 효과를 조사하는 과정이 길고 지루 수 있다는 것이다그것은 높은 처리량 스크리닝 방법이 아닙니다. 후보 화합물과 치료 후, I​​PSC 파생 뉴런은 개별적으로 PSC를 각 화합물의 효과를 결정하기 위해 패치해야합니다. 또한, 현재 환자의하지 사용할 수있는 많은 섬유 아세포 및 iPSCs있다. 따라서, 환자의 세포를 더 갖고 있으며 높은 처리량 스크리닝이 프​​로토콜을 적응 가까운 미래에 관심이있을 것이다. 예를 들어, 이온 또는 막 전위의 유전자 인코딩 센서 등의 작동 표시와 IPSC 유래의 신경 세포를 라벨링함으로써, 사이드 스테핑 시간이 소요되는 전기 생리 학적 절차에 의해 실질적으로 처리 속도를 높일 수있다. 전기 생리 학적 기록을 수행 아세포 재 프로그래밍에서,이 공존 배양 시스템을 생성하는 전체 프로세스로서, 90 일 이상, 그것은 각각 리 프로그래밍 및 신경 유도 단계 후에, 인간 iPSCs 나 NPC의 하나가 확장 될 것을 권장 필요동결 보존 및 미래 실험에 필요한 시간을 감소시킨다. 우리의 실험에서, 우리는 synapsin1 프로모터에서 대뇌 피질의 신경 세포에 ChR2을 표현했다. 이 프로모터는 팬의 연결이기 때문에, 우리는 아마 모두 억제와 흥분 대뇌 피질의 신경 세포를 photostimulating했다. 미래의 실험의 목적은 구체적으로 흥분성 또는 억제 회로 중 심문하는 경우,보다 특이 적 프로모터가 사용될 수있다. 또한, 대뇌 피질의 신경 세포는 유전자 변형 (또는 바이러스가 주입 된 쥐) ChR2 표현 특별히 신경 세포의 유전자 정의 주민들을 대상으로 얻을 수 있었다. 예를 들어, Cre 호텔 재조합 효소가 마우스에서 수확 대뇌 피질의 조직 ChR2을 표현하는 유일한 대뇌 피질의 신경 세포가 태양 광 발전의 interneurons 15됩니다 상황을 얻을 것입니다 floxed ChR2와 마우스로 교차 parvalbumin 함유의 interneurons (태양 광 발전의 interneurons)로 표현. 이러한 ChR2 발현 우리에서의 interneurons을 공동 CU의 사용lture 시스템 패치 IPSC 유래 뉴런의 PV의 interneurons와 회로에 통합 할 수 있는지 여부의 판단을 가능하게 할 것이다. 이전 연구 (9)을 바탕으로, 대뇌 피질의 신경 세포는 체외 14 일 후에 수상 돌기 겹치는 성숙. photostimulation 패치 된 IPSC 유래 신경 세포 반응을 유발하지 않는 경우 즉, 그것은 뉴런 피질 뉴런과 시냅스 연결을 할 수있는 능력을 갖고 있지 않음을 표시한다. IPSC 파생 된 신경 세포는 다른 IPSC 파생 된 신경 세포 또는 대뇌 피질의 신경 세포에서 하나의 시냅스 입력을 수신 할 수있다. 전통적인 패치 클램프 기록을 사용한 경우, 시냅스 입력이 어디에서 오는 구별 할 수 없을 것이다. 우리의 시스템의 장점은 피질 시냅스 입력에서 시냅스 반응은 선택적으로 유발하고 식별 할 수있다. 여기에 설명 된 절차를 통합하는 IPSC 유래 신경 세포의 능력을 평가하는 간단한 방법을 제공한다정의 된 신경 네트워크에.

최근 몇 년 동안, 신경 세포와 신경 회로 기능에 대한 우리의 이해는 신경 세포의 흥분을 제어하는​​ 여러 optogenetic 도구에 의해 혁명되었습니다. 이러한 도구 중 하나가 빛 활성화 양이온 채널입니다, channelrhodopsin-2 (ChR2) : 가벼운 자극 1-3 응답 ChR2 화재의 활동 전위를 표현하는 뉴런. 신경 세포는 빛에 일반적으로 구분하지 않습니다 때문에,이 놀라운 능력은 뉴런 4의 유전자 정의 인구의 활동의 정확한 시간적 및 공간적 제어를위한 새로운 길을 열어 크게 뇌 기능의 연구를 가속화하고있다. ChR2 신경망 (6)의 활동을 조절에 신경 개발 5 모니터링에서, 서로 다른 목적을위한 줄기 세포 연구에 적용되고있다. 여기서 우리는 신경 세포 공동 배양 시스템의 유용성을 높이기 위해 ChR2을 사용했다. 공동 문화 시스템은 서로 다른 종류의 세포 사이의 상호 작용에 대한 평가를 할 수 있습니다.신경원과 신경교의 공동 배양, 신경계의 주된 세포 유형은 일반적으로 서로 다른 세포 유형 간의 시그널링을 조사 할뿐만 아니라 생리적 반응이 시그널링의 중요성을 평가하기 위해, 손상 및 전파를 조사하는 데 사용 잠재적으로 7 시그널링에 관여하는 분자 메커니즘. 이전 연구는 인간의 iPSCs 쥐 대뇌 피질의 차 문화를 포함하는 신경 세포, 성상 세포, 희소 돌기 아교 세포 및 미세 아교 세포 (8)의 존재에 신경 세포에 매우 빠르게 분화 것으로 나타났다. 이 프로토콜에서 우리는 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)에서 파생 된 쥐의 대뇌 피질의 뉴런과 뉴런 사이의 시냅스 연결을 심문하기 위해 공동 배양 시스템에서 ChR2을 활용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 성상 세포로 해부하는 단계와 수확 뇌 조직 (9)뿐만 아니라 마우스 신경 전구 세포를 유지하고 차별화 (NPC들)을 설명하고 인간의 NPC 값 int오 신경 세포 공동 배양 시스템을 만들 수 있습니다. 본 공 배양 시스템을 구축하기 위해, 우리는 오키타 동부 등에 의해 설명 된 통합 무 리 프로그래밍 방법을 사용 하였다. 10 인간 iPSCs를 생성하기. 리 등에 의해 기술 된 바와 같이 선택된 iPSCs는 효율적 소분자 억제제를 사용하여 화학적으로 정의 된 조건에서의 NPC를 분화시켰다. 11 공동 문화에서 신경 세포의 다른 인구 토마토 (tdTomato) 이량 체 형광 단백질, 탠덤를 통해 IPSC 파생 된 신경 세포의 대뇌 피질의 뉴런에서 ChR2 표현의 감지 및 태그를 통해 확인할 수있다. 피질 뉴런의 optogenetic photostimulation와 IPSC 유래 뉴런으로부터 전기 생리 레코딩 결합 서로 회로를 형성하는 뉴런이 두 가지 유형의 능력을 평가할 수있다. 특히, 대뇌 피질의 뉴런 ChR2가 발현의 photostimulation는 시냅스 회로를 형성 IPSC 파생 된 신경 세포의 시냅스 반응을 불러 일으킨다광 여기 대뇌 피질의 신경 세포 네트워크와. 우리는 증가 된 시냅스 후 전류가 실제로 이러한 조건에서 IPSC 파생 된 신경 세포에서 발견되는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 병 환자로부터 유래의 섬유 아세포를 이용하여 iPSCs 다른 신경 학적 질병 모델의 재현부 포함한 실험 조건 하에서 다양한 시냅스 회로의 평가를 허용한다.

an optogenetic approach for assessing formation of neuronal connections in a co-culture system

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

여기서, 성상 세포로 구성된 공존 배양 생성에 관련된 여러 단계를 설명하는 프로토콜, 및 인간 대뇌 피질 뉴런 뉴런 도시된다. 인간 iPSCs 고밀도 (그림 1A)에서 유지되었다 NPC들 (11)을, 작은 분자 억제제의 칵테일 신경 계통에 에피 솜을 사용하여 섬유 아 세포를 재 프로그래밍하여 얻은 10 벡터 및 지정되었습니다. tdTomato (그림 1B) 태그 인간의 NPC의 성상 세포에 마우스의 NPC의 차별화, ChR2을 표현하는 쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 도금 및 시드 : 몇 가지 단계가 공동 문화를 생성해야합니다. 분화 일 2시, 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) + 성상 세포는 쉽게 우리의 문화 (그림 1C)에서 관찰 할 수있다. 마우스의 NPC는 성상 세포 단일 층 (그림 1D)에 ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포를 도금하기 전에 적어도 일주일 차별화시켰다. 3 후인간의 NPC 분화의 사주로, tdTomato + 뉴런은 문화 (그림 1E)에서 검출되었다. 이 공동 문화 시스템은 빛의 자극 (그림 2A)에 대응하여 개별 IPSC 파생 된 신경 세포의 시냅스 전류의 일관성을 검출 할 수있다. 빛에 의해 자극되면, 활동 전위는 ChR2 (그림 2B)를 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포에서 생성되었다. 전류 펄스를 탈분극의 진폭 증가 활동 전위 소성을 보여 뉴런도 (그림 2C) 고르기가 있습니다 IPSC 파생 (그림 2D)를 증가 하였다. 따라서, 이들 세포는 성숙한 신경 특성을 나타낸다. 광 부재에서 IPSC 유래 신경 자발 시냅스 입력 (도 2e)을 받았다. GABA 수용체를 통해 전류가 외부 것이기 때문에이 안쪽으로 시냅스 전류는 주로, AMPA 수용체에 의해 매개하고 NMDA 수용체는 전류를 운반하지 않습니다-70 MV의 유지 가능성을 t. 빛 자극이 크게 시냅스 후 전류 (그림 2E)의 주파수를 증가하기 때문에 적어도 이러한 입력의 일부는, ChR2 표현 시냅스 대뇌 피질의 뉴런에서 있었다. 시냅스 입력의 증가의 시간 과정은 그림 2 층에 표시됩니다 : 대뇌 피질의 뉴런의 photostimulation은 30 초 긴 빛 플래시에 걸쳐 지속되었다. ChR2 - 표현 대뇌 피질의 뉴런 (그림 2G) 광 여기 때 PSC를의 주파수가 상승하는 동안, 자신의 진폭 (그림 2H)의 영향을받지이었다. 요약하면, 이러한 결과는 IPSC 파생 된 신경 세포가 성숙한 신경 세포의 특성을 나타내과 연접 대뇌 피질의 뉴런과 시냅스 연결을 형성 할 수 있음을 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> 그림 1 : 공동 문화의 생성을위한 개략도iPSCs 및 NPC들에 신경 유도로 인간의 섬유 아 세포를 재 프로그래밍 시스템. (A) 타임 라인. 대뇌 피질의 신경 세포와 성상 세포 문화에 성숙한 신경 세포로 인간의 NPC의 터미널 차별화를위한 (B) 타임 라인. (C) 마우스의 NPC가 빠르게 GFAP로 분화 + 성상 세포 (2) 후 체외에서 일. (D) 일주 후, ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포가 GFAP + 성상 세포에 배양 하였다. (E) 4~5주에서 인간의 NPC의 분화 후, 전기 생리학 녹음은 tdTomato + 뉴런에서 수행되었다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> 그림 2 : 기능 시냅스 연결의 Optogenetic 분석. tdTomato (빨간색) 태그 (A) IPSC 유래 세포는 대뇌 피질의 신경 세포가 발현와 공동 배양 한 빛 활성화채널 ChR2 (녹색). IPSC 파생 된 신경 세포에서 녹음은 대뇌 피질의 신경 세포 또는 다른 IPSC 파생 된 신경 세포 하나에서 올 수 시냅스 전류 (PSC) 응답을 밝혔다. (B) 조명 (파란색 막대)는 ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포의 활동 전위의 시리즈를 유발. ( C) IPSC 유래 세포 ChR2 - 표현 대뇌 피질의 신경 세포 (E) Photostimulation (파란색 막대). IPSC 파생 된 세포의 전류 곡선 대 D) 발사 (. 전류 주입에 의해 유발 IPSC 파생 된 신경 세포에서 PSC를의 주파수를 증가 . photostimulation 의해 제조 PSC 주파수의 증가 (F) 경시. 블루 바는 photostimulation의 시간을 나타냅니다. PSC 주파수 photostimulation (G) 증가 동안 (G, H), PSC 진폭은 영향을받지 않습니다 (H)이었다. * P &lt;0.05는 학생의 t-test로 대조군에 비해 나타냅니다.

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An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.3K 조회수.  Duke-NUS Graduate Medical School. A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2. 

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Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

문화 공동 문화 마우스의 난소와 난소

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

연구

발생학

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Zebrafish 개발에 급성 신부전 모델링을위한 정확한 세포 제거 방법

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

연구 조직 이식에 세균성 부착을 병렬 플레이트 관류 시스템의 생체 외에서 모델

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to various organs and tissues. Tissue stiffness produces mechanical force, a physical cue that plays a critical role in NCC differentiation; however, the mechanism remains unclear. The method described here provides detailed information for the optimized generation of polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, the accurate measurement of such stiffness, and the evaluation of the impact of mechanical signals in O9-1 cells, a NCC line that mimics in vivo NCCs.
Hydrogel stiffness was measured using atomic force microscopy (AFM) and indicated different stiffness levels accordingly. O9-1 NCCs cultured on hydrogels of varying stiffness showed different cell morphology and gene expression of stress fibers, which indicated varying biological effects caused by mechanical signal changes. Moreover, this established that varying the hydrogel stiffness resulted in an efficient in vitro system to manipulate mechanical signaling by altering gel stiffness and analyzing the molecular and genetic regulation in NCCs. O9-1 NCCs can differentiate into a wide range of cell types under the influence of the corresponding differentiation media, and it is convenient to manipulate chemical signals in vitro. Therefore, this in vitro system is a powerful tool to study the role of mechanical signaling in NCCs and its interaction with chemical signals, which will help researchers better understand the molecular and genetic mechanisms of neural crest development and diseases.

Detailed step-by-step protocols are described here for studying mechanical signals in vitro using multipotent O9-1 neural crest cells and polyacrylamide hydrogels of varying stiffness.

신경 문장 세포에서 기계적 신호를 연구하기 위한 최적화된 O9-1/하이드로겔 시스템

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control over gene expression timing, location, and amplitude using light as the inducing agent. In this protocol, an optogenetic expression system is used to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos. This system relies on an engineered transcription factor called TAEL based on a naturally occurring light-activated transcription factor from the bacterium E. litoralis. When illuminated with blue light, TAEL dimerizes, binds to its cognate regulatory element called C120, and activates transcription. This protocol uses transgenic zebrafish embryos that express the TAEL transcription factor under the control of the ubiquitous ubb promoter. At the same time, the C120 regulatory element drives the expression of a fluorescent reporter gene (GFP). Using a simple LED panel to deliver activating blue light, induction of GFP expression can first be detected after 30 min of illumination and reaches a peak of more than 130-fold induction after 3 h of light treatment. Expression induction can be assessed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and by fluorescence microscopy. This method is a versatile and easy-to-use approach for optogenetic gene expression.

Optogenetics is a powerful tool with wide-ranging applications. This protocol demonstrates how to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos using the blue light-responsive TAEL/C120 system.

광유전학 적 TAEL/C120 시스템을 사용하여 제브라피시 배아에서 빛 유발 GFP 발현

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...