이 작품은 NINDS (NS066071)과 NIAAA의 보조금을 지원했다. (P50AA017823) ECO합니다. 저자는 박사 로버트 퀸과 동물 보호를위한 실험실 동물 자원학과에서 직원을 감사드립니다. 우리는 여름 학부 연구원 (서핑) 등 지원, 기술 지원 니콜 Belletier을 저드슨 벨몬트 감사드립니다. 우리는 또한 의견 박사 데이비드 카메론 감사하고 원고의 이전 버전에 수정할 수 있습니다.

플라스미드 녹색 형광 단백질 표현 1. 예를 자궁에 Electroporations <ol><li> 플라스미드 DNA 주입 솔루션은 ddH 2 O.에서 0.33 MG / ML의 최종 작업 농도로 희석 편대의 편대장-eGFP DNA 27와 함께 준비가되어 있습니다 Qiagen 엔도 - 무료 맥시 - 최상의 상태로 준비가 변형 박테리아의 플라스미드를 정화하는 데 사용됩니다. ~ 0.02 % (w / V 최종)에서 고속 녹색 염료는 주입 추적과 DNA 솔루션에 추가됩니다. </li><li> 외과 영역을 준비하려면 70 % 에탄올 솔루션으로 벤치 상단과 해부 현미경 단계를 스프레이 건조 닦으십시오. 이전 해부 70 %의 에탄올과 수술 가위와 집게를 뿌려서 건조 닦으십시오. </li><li> 모든 운동은 적어도 1 분 동안 중단 될 때까지 시간이 초과되었습니다 임산부 스위스 / 웹스터 댐은 가압 실린더에서 CO 2로 가득하고 댐이 모니터링되는 챔버 내로 송금 E13에 희생되어 있습니다. CO 2 흡입에 의해 희생 한 후에 태아는 자궁에서 제거하고에 배치10cm 페트리 접시가 포함 된 얼음 차가운 행크스 균형 잡힌 생리 식염수 (HBSS). </li><li> 조심스럽게 주변 extraembryonic 멤브레인의 각 배아를 해부하고 얼음처럼 차가운 HBSS에 유의하시기 바랍니다. </li><li> 차가운 HBSS를 포함하는 두 번째 10cm 페트리 접시에 각각 배아를 전송합니다. 향후 분석을 위해 대뇌 피질의 지역에서 spatially 별도의 대뇌 피질의 영역에 주입 관리하고, 왼쪽 대뇌 반구의 심실에 DNA 빠른 녹색 혼합물로부터 2-3 μl를 삽입하기 위해 해밀턴 주사기를 사용하십시오. </li><li> electroporate하려면, 포셉으로 부드럽게 배를 잡고 가볍게 머리의 등 중간 선에 트위터 전극의 긍정적 인 패들 넣고 가볍게 배아 턱 아래에있는 부정적인 패들 놓습니다. Electroporations는 950 밀리 초 간격으로 구분 된 50 밀리 초 기간 다섯 30 V 펄스를 제공하는 프로그램 BTX830 electroporator으로 달성된다. 이러한 설정은 BTX830 모델입니다. 다른 시스템은 제조업체의 instructio에 따라 사용할 수 있습니다NS. </li></ol> 2. 전체 반구의 Explant 준비 <ol><li> electroporation 후 배아는 얼음처럼 차가운 HBSS에 다시 배치됩니다. 뇌는 배아의 머리에서 피부와 연골 성의 두개골을 제거하는 두 # 5 보석의 집게를 사용하여 제거됩니다. forcep는 다음 두개골에서 그대로 뇌를 제거하는 뇌 아래에 하락하고 있습니다. electroporated 반구는 (왼쪽)가 뇌에서 떨어져 해부되고 첨부 된 중간 뇌 조직은 제거됩니다. 분해 절차 관리를 통해 왼쪽 대뇌 피질 반구를 놓인 meninges을 손상하지 않도록 이루어집니다. </li><li> 일단 각 배아는 절단 한 ML 피펫 팁과 pipettor를 사용하여 HBSS에 전송됩니다 해부 했어요. 반구는 부드럽게 콜라겐 코팅 문화 삽입에 퇴학하고 있습니다. 최대 6 개의 반구의 explants에 각 24mm 삽입에 안쪽면을 아래로 배열된다. 일단 배치, 초과 HBSS는 삽입에서 제거되고 삽입 나서 잘 6 잘 요리 중 하나가 35mm에 배치됩니다. 잘은 EXA가 포함되어 있습니다미디어 ctly 2.7 ML : DMEM-F12 미디어 Glutamax을 포함하고있는 2 % B-27, 1 % G5와 1% 페니실린 - 패 혈성 보충. 잘에서 미디어의 몇 방울은 각 explant의 상단에 pipetted 수 있지만 잘 따라 원래의 2.7 ML를 초과 미디어를 추가하지 않습니다. </li><li> explants가 콜라겐 필터에 배치 한 후 explants를 포함하는 6도 요리는 Billups 로텐 버그 (BR) 챔버 (또한 물을 증발 접시를 포함)에 배치됩니다. 95 % / 5 %의 산소 / CO 2 가스 혼합물은 챔버 시스템 종료를 밀폐하고 95 % / 5 % 산소 / CO 2 가스 공급 튜브를 분리하기 전에 적어도 1 분 동안 챔버 내로 주입된다. BR 챔버는 다음 문화 시대, 1-2 DIV의 나머지 부분에 대해 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에 배치됩니다. </li></ol> 3. 조직학에 대한 Explant 조직의 고정 <ol><li> 연기 후드에 preheated (~ 80 &amp; 드의 100 ML에 paraformaldehyde의 첫 solubilizing 8g하여 Pagano 고정 솔루션을 준비g, C) ddH 2 O. NaOH는 solubilization을 홍보하고 부드럽게 저어하는 집중 1-3 방울을 추가합니다. 일단 500 밀리미터 자당, 100 밀리미터 Hepes, 산도 7.4, 50 MM MgCl 2, 250 밀리미터 자당 50 밀리미터 Hepes의 4 % paraformaldehyde의 최종 농도 5 밀리미터 KCl이 그 솔루션을 8 % paraformaldehyde 솔루션 1:1 혼합 solubilized , 25 MM MgCl 2, 2.5 MM KCl, pH를 7.4. </li><li> explants이 37 ° C.에 Pagano 수정 솔루션을 따뜻하게 해결하려면 신속하게 잘 각 문화에서 DMEM/F12 미디어의 대부분을 제거하고 explants의 각 잘에 Pagano의 수정의 5 ML을 추가합니다. 수정에 완전히 각 explant를 커버해야합니다. RT에서 1 시간 수정. 이전 고정 1 시간에 필터에서 explants를 제거하지 마십시오. </li><li> 고정은 Pagano 수정 솔루션을 제거하고 수정없이 Pagano 솔루션 (250 밀리미터 자당 50 밀리미터 Hepes, 25 MM MgCl 2, 2.5 MM KCl, pH를 7.4)로 교체 한 후. 삽입 될 때까지 4에 10 %의 나트륨 azide 및 매장 ° C의 몇 방울을 추가합니다. </li></ol> 4. 삽입 및 S조직학에 대한 ectioning <ol><li> 따뜻한 물 (55-60 ° C)의 100 ML에 종아리 피부 젤라틴 10g을 solubilizing하여 10 % 송아지 가죽 젤라틴 솔루션을 준비합니다. solubilized까지 ° C와 소용돌이 정기적으로 60로 설정 핫 플레이트에 젤라틴 용액을 넣습니다. </li><li> 10cm 페트리 접시의 바닥에 10 % 젤라틴 용액의 약 10 ML을 넣어 30 분 더욱 강화 할 수 있습니다. 이 explants를 삽입하기위한 &quot;패드&quot;를 형성합니다. 이 패드는 사전에 준비 일이, 4 ° C.에 저장 할 수 있습니다 페트리 접시의 바닥에 격자를 이끌어 그리드의 각 상자에 개별 explants를 전송하는 통치자를 사용합니다. 잔여 Pagano 솔루션을 제거하고 pipettor를 사용하여, 따뜻한 10% 젤라틴 솔루션으로 각 explant를 커버하고 더욱 강화 할 수 있습니다. 각 explant이 완전히 너무 한 번에 젤라틴 따뜻하게을 추가로 패드를 용해하지 돌보는, 젤라틴으로 둘러싸여 될 때까지 젤라틴 솔루션의 느린 또한을 다시 시작합니다. ~ 1 시간에 굳어 젤라틴을 위해 수 있습니다. 일단 individ 찼어, 무슨 일을 explants는 젤라틴의 작은 단위로 잘라 수 있습니다. 블록이 다음 사전 vibratome으로 sectioning에 24-48 시간에 대한 해결 Pagano에 게시 - 해결됩니다. </li><li> 젤라틴 블록에서 Explants는 후각 망울을 위치 100 μm 두께의 코로나 비행기에서 sectioned 있습니다. 섹션 수집 및 저장됩니다 PBS 4시 + 0.1 % 나트륨 azide ° C immunohistochemical 처리까지. </li><li> Immunohistochemical 감지가 24 잘 플레이트 (물론 당 2 ~ 3 개의 섹션)로 섹션을 전송하여 수행됩니다. 첫 번째 블록이 아닌 특정 항체 0.5 ML PBST를 추가하여 바인딩 + B 완만 한 진동 각 잘 길러 1 시간에 (PBS + 0.5 % 트리톤 X 100 2퍼센트 BSA). 적절한 기본 항체 그런 다음 PBST + B에 희석되어 잘 당 0.4 ML은 RT에서 하룻밤 배양에 추가됩니다. 기본은 3 배 PBS은 적어도 10 분마다 씻어 함께 씻어 수 있습니다. 차 항체와 2 μg / ML Hoechst 33342 얼룩 핵 그 다음 PBST + B에 희석되고 샘플은 RT에서 2 시간에 incubated 아르부드러운 진동과. 세 PBS 세차 (10 분마다)가 수행 된 다음 섹션은 90% 글리세롤 50 ㎜ 트리스, pH7.4, 장착 미디어를 사용 슬라이드에 장착되어 있습니다. </li></ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

우리는 개선하고 실험 모델을 평가 한 - 전체 반구의 explants - 초기 대뇌 피질의 개발 연구를 (E13-E15). 모델은 대뇌 피질 25,37의 레이어 6 구성 흥분성의 신경 세포의 계보 (Lineage)의 이전과 차별화의 분석에 유용 입증되었습니다. 시스템의 주요 장점은 준비 간단하고, 뇌 발달의 초기, 중요한 기간 동안의 electroporation, 약리 조작 및 이미징을위한 뉴런 3) 실험 접속) 2) DIV에 대한 organotypic 성장, ...

연속 생성 뉴런의 공동 확산, 이전과 차별화를 통해 포유류의 대뇌 피질 양식. 각 신경 세포는 심실 구역 (VZ)에서 태어나 대뇌 피질 판 (CP) 1을 형성 중간 영역 (IZ)로 VZ에서 마이그레이션합니다.합니다 그들은 다른 대뇌 피질의 도메인을 통과으로, 마이그레이션 뉴런은 개발 조직 내의 세포 환경 및 기타 휴대 요소 (예 : 반경 glia)에 따라 마이그레이션 2,3의 여러 모드를 표시합니다. 대뇌 피질의 뉴런는 neuronal 마이그레이션 체포와 dendritogenesis (4)의 일치 과정에있는 성형 대뇌 피질 판의 상단에있는 마이그레이션을 체포. 대뇌 피질의 개발은 배아 일 원시 plexiform 계층 6 preplate (PP), 그 overlies VZ 선구자 뉴런의 층의 설립을 통해 11-13 (E11-13) 5 사이에 시작됩니다. 예기되는그런 다음 레이어 6 대뇌 피질의 뉴런 (VZ에서 태어난 즉, 첫 번째 대뇌 피질의 뉴런) 방향이 틀에 박힌 패턴의 somata와 PP 7 ~ 뚜렷한 층으로 뭉쳤다. 이러한 이벤트는 얕은 한계 (미래 대뇌 피질의 레이어 1)과 깊은 구역, subplate 세포 (과도 대뇌 피질의 레이어 7)로 구성 후자에 preplate를 나누었습니다. 이 과정은, preplate 분할이라고한다, 대뇌 피질 (8)의 미래 성장의 기초 행사입니다. 많은 유전자 변이는 대뇌 피질의 발달 9의 다양한 측면을 방해하는 확인되었습니다. 대뇌 피질의 개발은 또한 부정적인 등 코카인 10 술 11 등의 섭취 독소에 노출에 의해 영향을 수 있습니다. 개발하는 동안 발생하는 대뇌 피질의 기형은 신경 장애 (예 : 자폐증, 정신 분열증)에 가능성이 참여자 때문에, 대뇌 피질의 발달에 섭동의 경험적 조사는 고유 아르중요한 그겁니다. 그것은 유전이나 독소 효과의 빠른 assays을 허용뿐만 아니라 두뇌 개발 12이 초기 기간 동안 차별화 뉴런, 다른 세포 유형과 세포 외 기질 (ECM) 사이의 가능한 상호 작용을 보존 그 대뇌 피질의 개발을 공부하는 방법을 설정하는 데 상당한 중요성을 따라서입니다 . 슬라이스 explants 13 이러한 시스템을 제공하고 광범위하게 분석 대뇌 피질의 신경 세포 개발에 14-16로 사용되었습니다. 그러나, 슬라이스 assays는 neuronal 마이그레이션 및 적층이 가능 개발 뇌와 앵커 반경 glial 비계를 둘러싼 수막 세포에 손상으로 인해 17 이상이 될 수있는 단점으로 고생 할 수 있습니다. 레이디 얼 glial 섬유가 썰기하여 기저 얇은 판의 대뇌 피질의 신경 세포 이주 18 혼란의 중요한 기판 있으므로 로컬 반경 glial 아키텍처를 중단시키고 변경된 대뇌 피질의 마이그레이션 될 수 있습니다. 또한 SLI에게의explants의 ced 표면이 분야에서 ECM의 일반적인 구성을 변경할 수 있습니다 죽은 세포의 영역을 제공합니다. 최근 접근법은 적절한 건강 셀 유형 및 ECM으로 둘러싸여있는 통에 깊숙히 자리 세포에 자신의 분석을 집중하고 있습니다. 그러나 경우에 이러한 새로운 접근법은 슬라이스의 비교적 정상적인 내부는 분석 19-21에 사용할 수 있습니다 있도록 원래의 두꺼운 교양 슬라이스 고정 후 cryo-sectioned 또는 파라핀-sectioned 할 것을 요구 할 수 있습니다. 문화뿐만 아니라 분석을위한 고정 슬라이스의 후속 cryosectioning의 라이브 조각을 준비하는 sectioning 원래 vibratome 모두는 이러한 assays에 대한 관심과 노력이 작동해야합니다. 초기 대뇌 피질의 개발 연구 간단한 보완 접근 방식을 제공하기 위해, 우리는 초기 대뇌 피질의 개발 연구를 촉진하기 위해 기존 슬라이스 방식이 13으로 바뀌 었습니다. 우리는 대체를 개발65분 당 회전하고 16-18 시간 22,23에 대한 허용 organotypic 성장에 떨고 문화를 포함하여 기존 E14 전체 반구의 모델과 비슷한 OLE 반구의 explant 모델입니다. 우리의 접근 방식에 전체 반구의 explants은 48 시간에 organotypic 대뇌 피질의 성장을 확장하는 높은 산소 문화 분위기 21,24에서와 반 투과성 막 13에 표시됩니다. 이 방법은 또한 대뇌 피질의 뉴런을 개발 일관된 electroporation 할 수 있습니다. 태아는 자궁에서 제거 플라스미드 DNA를 소개 electroporated과 telencephalon 그 다음 해부되어 있습니다. 각 반구의 고립과 콜라겐 코팅 필터 안쪽면을 아래로 배치됩니다. explant 그런 다음 48 시간, preplate 분할 8 포함 기간 동안 배양하고 있습니다. 문화 기간 동안 L6 뉴런은 대뇌 피질 판에서 올바른 위치에 차별화 된 뉴런 25 일에 구체에서 개발할 수 있습니다. 이 기간 개발 전반에 걸쳐신경 세포는 생체의 해당 셀을 직면 것이다 적절한 ECM과 세포 유형으로 둘러싸여 있습니다. 이 시스템은 이미 에탄올 독성 26 층 6 형성과 preplate 분할 7,25를 기초 세포 사건을 해독에서 중요한 입증했다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

대뇌 피질의 개발은 뉴런과 전구체 세포, 혈관, meninges 및 관련 세포 외 기질 등의 비 neuronal 요소들 간의 복잡한 상호 작용을 포함한다. 그들은 적절한 organotypic 환경을 제공하기 때문에, 대뇌 피질의 슬라이스 explants는 종종 neuronal 차별화 및 개발을 제어 이러한 상호 작용을 조사하는 데 사용됩니다. 이익이지만, 슬라이스 explant 모델은 비정상 세포 적층 및 마이그레이션 등의 단점으로 고생 할 수 있습니다. 여기 대뇌 피질의 조각과 쇼 일관 organotypic 마이그레이션 및 적층보다 준비하는 것이 더 쉽습니다 초기 대뇌 피질의 개발 연구 전체 대뇌 반구의 explant 시스템을보고합니다. 이 모델 시스템에서 초기 적층 및 마이그레이션 패턴, preplate 분할의 기간을 포함하여, 체외에서 2 일 동안 일반적으로 미래의 대뇌 피질 층 중 여섯 양식을 진행합니다. 우리는 전 자궁의 electroporation (EUEP)를 개발등쪽 내측 피질에서 개발 뉴런에 GFP 표현을 타겟팅 ~ 80 %의 성공을 달성 접근. 전체 반구의 explant 모델은 electroporation, 약리 개입 및 라이브 영상 방식의 접근이 초기 대뇌 피질의 개발을합니다. 이 방법은 transfection 및 면적 타겟 일관성을 모두 개선하면서 자궁 electroporation (IUEP) 접근 방식에서 요구 생존 수술을 방지합니다. 이 방법은 neuronal 확산, 이전과 차별화의 실험 연구를 촉진합니다.

배아 쥐 대뇌 피질의 발달 기간에 걸쳐 가로 neurogenetic 기울기를 전시 등 그 옆 네크로는 등쪽 내측 네크로 28 약 1 하루가 발전되어 있습니다. 레이어 6 뉴런의 일괄 따라서 측면 피질에 E12에 (또한 필드 40 5이라고도 함)과 E13의 등쪽 내측 피질 (또한 필드 1 5이라고도 함)에 (S-단계의 마지막을 전시 IE) 생성됩니다. Preplate 분류 레이어 6 신경 세포 생성 후 약 1 일 시작하...

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

이 프로토콜은 관련 개선 explant 절차를 설명합니다<em&gt; 예 자궁</em&gt; 배아 마우스에서 전체 대뇌의 electroporation, 해부 및 문화. 준비 초기 대뇌 피질의 개발 기간 동안 유전자 기능의 약리 연구와 assays을 용이하게한다.

예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

12.8K 조회수.  SUNY Upstate Medical University. 이 프로토콜은 관련 개선 explant 절차를 설명합니다 예 자궁 배아 마우스에서 전체 대뇌의 electroporation, 해부 및 문화. 준비 초기 대뇌 피질의 개발 기간 동안 유전자 기능의 약리 연구와 assays을 용이하게한다.

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

연구

신경과학

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

몸에 붙이기 형질 전환 쥐의 발생에 의해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 생물 발광 상영

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

해부하는 뇌 두피 Explants와 함께 사용하기위한 쥐 태아의 뇌척수의 절연

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 영상: 영상, 3 차원 재구성 및 Transcytosis의 정량화

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...