실시간 제어 시스템, 통찰력 토론, 자코모 Pruzzo와 알레산드로 PARODI 사용자 정의 전자 제품과 소프트웨어의 개발, 그리고 클라우디아 Chiabrera과 전문가의 조언 및 세포 배양 준비에 도움 마리나 Nanni에 대한 에벨 리나 Chieregatti와 하나코 쓰시마 개발을위한 알베르토 Guiggiani.

1. 광 설치 전체 광학 시스템은 이전 15 설명했다. 간단히, 광 핀셋 시스템은 1064 nm의 (IPG 레이저 GmbH의)에서 이테르븀 연속파 (CW) 광섬유 레이저 운영을 기반으로합니다. 공간 광 변조기 (SLM) (LCOS-SLM 모델 X10468-07 - 하마 마츠) 컴퓨터 생성 홀로그램하여 배양 접시에 포획 초점 반점의 위치를​​ 제어하는​​ 수신 IR 레이저 빔의 위상을 다릅니다. 자유롭게 사용할 수있는 블루 핀셋 소프트웨어 (장비 테이블에 웹 링크)가 생성 홀로그램은 공간 광 변조기에 투사. 와 포토 다이오드 (PD, PDA100A-EC - THORLABS) - 힘 분광 측정을위한 간섭계는 4 사분면 다이오드 (하마 마츠 C5460SPL 6041 보드 QPD, S5980)에 근거했다. 355 nm의 (- 가득 찬다 포토닉스 PNV-001525-040, 파워 칩 나노 펄스 UV 레이저)에서 YAG 레이저 : 레이저 해부 소스 펄스 서브 나노초 UV 노스 다코타이었다. 음향광 변조기 (MQ110-A3-UV, 실리카-AA-옵토 - 전자 융합 355 nm의)는 시료에 전달 UV 레이저의 힘을 통제했다. 현미경의 objective.The 단계는 3 축 리니어 DC 모터의 마이크로 위치로 구성되어 찍기 60X, 0.9 NA 물 장착 - 홀로그램 광학 핀셋 및 레이저 마이크로 해부는 수정 직립 현미경 (올림푸스 BX51)에 통합되었다 의 서브 나노 미터 해상도로 샘플의 거친 움직임을 결합하는 별도의 3 축 압전 나노 포지셔닝 스테이지 (P-733.3DD, 물리학 악기​​) 운반 시스템 (M-126.CG1, 물리 악기) 압전 무대. 현미경 스테이지 시스템은 두 개의 컨트롤을 탑재 한 시너지 효과를 선택한 작동 모드 (정적 또는 동적 위치 또는 힘 클램프) 16에 따라 올바른 위치에 포획 초점 자리를 유지하기 위해 행동을 반복합니다. 특히, 내부 피드백 루프는 선택에 구슬을 유지하기 위해, 압전 단계에 작용트랩 센터 ED 거리. 다른 외부 루프는 스트로크 가능 17보다 큰 영역 압전 액츄에이터에 포함되는 지역을 악용하는 자동화 된 단계의 위치를 제어합니다. 이 샘플을 준수 갇혀 비드를 추적하기 때문에 압전 단계 한 방향에서 사용할 수있는 뇌졸중의 제한에 도달하면, 외부 루프는 반대 방향으로 마이크로 스테이지를 이동, 따라서 압전는 중심 위치를 향해 복구합니다. 압전 단계는 물론 범위의 중심 위치에 도달했을 때, 마이크로 단계는 중단. 시스템의 더 자세한 사항은 Guiggiani 등 16, 17에보고됩니다. 펠티어 장치 (TC-344B 듀얼 채널 히터 컨트롤러와 QE1 저항 가열 - 워너 인스트루먼트는) 현미경 (37 ° C)에 따라 세포 배양의 온도를 제어합니다. 문화, pH와 습도 맞춤 디자인 폴리 디메틸 레이팅에 의해 생리적 조건에서 유지되었다가습 carbogen (95 % O 2, 5 % CO 2)와 실록산 (PDMS) 소매 (현미경 목표를 통합). 2. 세포 배양 준비 모든 실험 프로토콜은 건강의 이탈리아 교육부에 의해 승인되었습니다. 차 문화는 배아 일 18 (E18)에서 생쥐의 해마 (C57BL6J, 찰스 강)에서 하였다. <ol><li> 신경 세포는 유리 바닥 배양 접시에 25,000 세포 / ㎖의 농도 (- MATEK 회사 P35G-0-14-C)에 도금 하였다. 배양 세포의 낮은 농도는 이미 체외에서 첫 번째 일 조밀 한 네트워크의 형성을 방지하기 위해 필요합니다. 언급 세포 농도에서 다른 셀에 연결되지 않은 긴 신경 돌기 격리 된 세포를 찾을 가능성이 훨씬 높다. </li></ol> 3. 비드 코팅 <ol><li> 폴리머 마이크로는 (Ø 4 μm의, COOH-종료-앞머리 연구소, 제품 코드 PC05N/6700) 폴리 코팅 하였다polyLink 단백질 커플 링 키트 (Polysciences, 제품 코드 19539)에 설명 된 절차에 따라-D-라이신. 구슬 문화 지원과 호의 세포 접착을 커버하는 데 사용 된 것과 동일한 분자로 코팅되어 있습니다. </li></ol> 4. 고립 된 신경 세포를 선택합니다. 문화 기판, 트랩에서 비드를 분리하고 신경 옆에 이동 <ol><li> 현미경 스테이지에 문화 페트리 접시를 넣어. 무대 동작하여 샘플에 포커스를 설정 한 후, 콜러 - 조명을 설정하는 조명 목적 콘덴서의 위치를​​ 수정합니다. Kolher - 조명 조건을 설정하는 조명 광학계를 정렬하면 시야 영상 품질을 개선 할 필요가있다. 이러한 정렬 조건을 사용하여, 그것은 QPD와 PD하여 간섭 추적을 수행하기 위해, 산란 갇혀 조사에서, 또한 IR 레이저 수집 효율 (목적 콘덴서를 통해) 극대화 할 필요가있다. </li><li> 에 코팅 된 microsphere의 주식 솔루션의 몇 가지 μl를 피펫배양 접시에. 마이크로는 예금과 문화를 기판에 부착됩니다. 배양 접시에 주입 μL의 수는 원액 microsphere의 농도에 따라 달라집니다. 이상적인 조건은 뷰의 영상 분야마다 미세 하나 사이에 두을 가지고있다. 너무 많은 마이크로는 배양 접시에 추가 될 때, 그들은 이미 배양 된 뉴런 무작위로 첨부 할 수 있습니다. </li><li> 긴 돌기 (축삭)와 격리 된 신경 세포를 검색, 문화 접시 주위에 이동하고, 현미경 스테이지의 위치를​​ 저장합니다. </li><li> 이동 및 문화 지원에 부착 비드를 검색합니다. </li><li> IR 트래핑 레이저를 켭니다. 이 단계에서, 아니 홀로그램은 SLM에 투영되지 않으며, IR 레이저 스폿의 위치는 UV 레이저 스폿의 위치와 일치한다. 현미경 스테이지 운동에 의해 2 ~ 3 μm의 문화 지지체 표면 위에 IR 현장의 축 위치를 설정합니다. </li><li> 미만 μW에 샘플 전달 UV 레이저 파워를 설정합니다.UV 레이저 해부학자는 이전에 14 보정되었습니다 5-6 μW는 유리 지원 소작됩니다 4 μW 신경 세포의 연결이 완전히 해부 신경 돌기가 부분적으로 lesioned되어 2.5 μW &lt;1 μW이 충격파는 배양 접시에서 생산된다. 광 충격파 유리 지원에서 비드를 분리 할 수​​있을만큼 강하다. </li><li> 에 IR 레이저를 유지하면서, UV 레이저를 켜고 현미경 스테이지 운동에 의해 준수 비드 위에 UV 자리를 이동합니다. 비드 표면에서 분리, 그리고 그것은 IR 레이저에 의해 갇혀있다. 그런 다음, UV 레이저를 끄십시오. </li><li> 유리 지원 (20 ~ 30 μm의) 위의 트랩 구슬 몇 마이크로 미터를 이동합니다. 이 위치에 구슬을 해제하면이 이전에 선택한 뉴런을 향해 이동하는 동안 다른 세포에서 그것을 방지 할 수 있습니다. 이전에 저장 한 무대 위치에 구슬을 가져옵니다. 드래그 유체 힘 광학 트랩을 초과하지 않도록 낮은 값 (10 ㎛ / 초)로 단계 속도 설정핑 힘. </li></ol> 5. 컴퓨터 생성 홀로그램에 의한 레이저 해부 스폿 및 축삭 위치에 따라 트랩의 위치를​​ 이동하고, 광학 핀셋 강성 보정 <ol><li> 축삭을 시각화하기 위해 유리 지원을 향해 구슬을 이동합니다. 비드합니다 (약 5 μm의 유리 지원 위)과의 접촉을 피하기 위해 셀 위에 개최됩니다. </li><li> 축삭의 폭의 중앙에 UV 초점 자리를 이동하는 현미경 스테이지를 이동합니다. 현재 단계 위치를 저장합니다. </li><li> 컴퓨터 생성 홀로그램에 의한 IR 초점 반점의 위치를​​ 이동합니다. 이 단계에서는 단계는 이전 단계에서 선택한 위치에 중단됩니다. 컴퓨터 생성 홀로그램 SLM에 투영 될 때, 트랩 비드 축삭에 대해 이동합니다. 우리는 너무 같은 돌기를 중심으로 UV 레이저 반점과 더불어 갇힌 구슬 돌기의 중앙에 정렬하도록 IR 레이저 자리를 이동합니다. IR 자리하고 따라서 트랩 비드 돌기를 따라 배치됩니다멀리 UV 반점 5-10 μm의. 우리는 신경 돌기 구조에 따라 UV 반점에 대하여 IR의 위치를​​ 이동합니다. 광 핀셋은 SLM 시스템이 장착되지 않은 경우에, 위치는 IR 광 경로의 기울기 거울, 또는 음향 광학 디플렉터에 의해 변경 될 수 있습니다. IR 레이저 스폿의 브라운 운동에 영향을하고 힘 분광 흔적을 변경할 수 갇혀 프로브와 해부 빔의 광학 상호 작용을 방지하기 위해 UV 지점에서 멀리 ~ 10 μm의를 배치 할 수 있습니다. </li><li> UV 반점 및 축삭의 위치와 관련하여 새로운 IR 현장의 위치를​​ 정의한 후, 멀리 축삭에서 갇혀 비드를 배치하고 충돌을 피하기 위해 무대를 이동합니다. 커버 유리 위에 약 2 μm의 덫 비드의 축 위치를 이동합니다. </li><li> 중앙 그것에 간섭 변두리에 QPD를 정렬 : QPD가 중앙에 때 x와 y QPD 차동 신호는 제로입니다. interfero에 의해 갇혀 비드의 브라운 운동의 5 초를 취득미터, 50 kHz 샘플링 속도. 파워 스펙트럼 방법 18에 의해 광 트랩의 강성 (PN / NM) 및 감도 (V / NM) 구하십시오. </li></ol> 6. 축삭에 비드를 부착합니다. Axotomy과 동시 힘 측정을 수행 <ol><li> 커버 유리 위 4 μm의 갇힌 구슬의 위치를​​ 올리고, (단계 3.2 참조) 이전에 저장된 단계의 위치로 이동합니다. </li><li> 축삭을 향해 갇혀 비드 아래로 이동이 접촉 돌기를 때까지. 갇혀 비드와 축삭 사이의 충돌은 축 방향 갇혀 비드의 변위를 감지 Z QPD 신호에 의해 모니터링됩니다. </li><li> 트랩 비드와 10 초를 기다립니다 돌기 막에의 부착을 선호하는 축삭에 밀어. </li><li> 축삭에서 갇혀 비드를 치환하는 마이크로 스테이지를 이동하고, 따라서 세포의 막에의 접착력을 확인합니다. 구슬 부착하면 광학 트랩에서 탈출. </li><li> 준수 비드에 레이저 트랩을 뒤로 이동0으로 똑같은 힘의 상태와 힘 클램프 루프 전환합니다. 같은 방법으로, 광학 트랩 중앙에, 세포에 부착 된 압전 단계 재배치 구슬,. 시스템이 피드백 루프 제어가없는 경우, 레이저 트랩 위치는 부착 프로브를 중심 그것에 현미경 스테이지로 이동할 수 있습니다. QPD 신호가 구슬 갇혀 셀 (x와 0이 Y QPD 신호와 Z QPD 신호 사분면의 동일한 전압 금액을 제공을 준수하지 않을 때와 같은 경우 트랩의 중심에 도달 로 비드)는 어떤 표면에서 멀리 갇혀됩니다. </li><li> 준수 갇혀 프로브 텐션을 생성하는 비드의 중심 (약 100 nm의)에 약간 트래핑 레이저의 위치를​​ z 축에 힘 클램프 상태를 설정합니다. 시스템이 강제 클램프 제어가 장착되어 있지 않은 경우, 광학 트랩 위치는 현미경 스테이지로 25 나노의 단계에서 제기 될 수있다. Z QPD 신호를 모니터링 할 수 있습니다. 따라서 생을 사용s는 부착 된 프로브에 대해 레이저 트랩의 위치를​​ 설정하는 신호. 이러한 사전 장력 축삭 병변 후 막에 긴장하고 준수 프로브의 브라운 운동의 필연적 인 감소를 감지하는 데 필요합니다. 유사한 접근 방식은 비디오 영상 19으로 막 밧줄에 긴장의 방출을 측정을 제안하고있다. </li><li> 스위치 - 오프 위치 클램프 조건 (피에조 스테이지 차단)에 부착 된 프로브의 힘을 측정하는 힘 - 클램프의 피드백. </li><li> 레이저 axotomy 시간 경과 시야 영상 (20 Hz의 프레임 속도) 동안 간섭계 (20 kHz 샘플링 주파수) 및 세포를 포획 프로브 위치의 동시 녹음을 시작합니다. </li><li> 병변은 축삭의 이미지 (. 보통 200-400 광 펄스가 펄스 당 에너지 필요합니다 : 25 NJ)에 표시 될 때까지 레이저 펄스를 전달하기 위해 UV 레이저를 켠 후 UV 레이저를 끄십시오. </li><li> 약 3 마일을 위해 간섭계 녹음을 계속N, X, Y 및 Z QPD 트레이스 고원에 도달 할 때까지. </li></ol> 7. 총 장력 릴리스를 정량화 <ol><li> 나노 미터 각각의 트레이스를 얻기 위해, 광학 트랩의 보정 감도가 기록 QPD 흔적 (볼트)로 변환합니다. </li><li> 10 Hz에서에서 잘라와 하이 패스 필터에 의해 X, Y 및 Z 변위 추적을 필터링합니다. </li><li> 갇혀 비드의 브라운 운동을 대표하는 필터링 흔적의 총 분산을 계산합니다. 500 밀리 초 (10,000 데이터 포인트) 20 시간 창을 겹치지 25 밀리 초 단계로 분산을 계산합니다. 추적 필터링 하이 패스 막 변동 또는 대뇌 피질 굴지의 움직임에 의한 브라운 운동의 변화를 제외합니다. 구슬의 브라운 운동은 세포막에 광학 힘과 접착 힘에 의해 감소​​된다. 막 때문에 점도가 증가 긴장의 방출, 따라서 구슬의 브라운 운동의 긴장 될 때, immedi 감지ately axotomy 후 감소하기 시작합니다. </li><li> T0를 정의 브라운 운동 분산의 감소의 시작을, UV 레이저 에너지의 전달 후. 시간 인스턴트 T0는 막 변형의 시작을 나타냅니다. </li><li> 브라운 운동 분산 (가 고원에 도달 할 때)의 감소의 끝 : T1을 정의합니다. 시간 인스턴트 T1은 막 긴장의 끝을 나타냅니다. </li><li> 힘 측정하는 동안 시료의 변위를 측정하기 위해, 커버 유리 지원에 이물질이나 스크래치 비디오 추적을 수행합니다. 유리 지원에 입자를 추적하기 위해 우리는 먼저 검정색 배경에 흰색 입자와 함께 바이너리 이미지의 스택을 얻기 위해, 시야 이미지에 임계 값을 적용합니다. 다음, 우리는 서브 픽셀 정밀도 (프리웨어 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여)와 질량 입자의 중심을 추적 할 수 있습니다. </li><li> 변위 QPD 흔적에서 측정 된 드리프트를 뺍니다. 각각의 보정 광학 강성 (k x, k 님 드리프트 보정 QPD 흔적을 곱 <suB&gt; Y, K Z)는 piconewtons에서 FX는, FY, FZ 흔적을 구하십시오. </li><li> 로 전체 힘 추적을 계산 F TOT = √ (FX 2 + 기 2 + FZ 2). </li><li> 로 T0와 T1 사이의 힘의 전체 버전을 계산 F 출시 = F TOT (T1) - F TOT (T0). 이 트랩 센터에서 프로브의 변위에 의한 것입니다 때문에 T0에서 측정 된 힘은, 차감되어야 할 때 신경 돌기의 구슬을 준수합니다. </li><li> 갇혀 비드와 UV 레이저 스팟 위치 사이의 신경 돌기의 접촉 면적을 계산 갇혀 비드와 UV 레이저 스팟 위치 사이의 신경 돌기의 밝은 필드 이미지 측정에 긴 (L) 및 단기 (D) 축. 축삭의 접촉 면적은 축삭입니다 = L X D. </li><li> 발표 한 총 출시 힘 F를 정상화 축삭 접촉 면적 축삭. </li></ol>

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	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Trapping+and+Manipulation+of+Viruses+and+Bacteria.">Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria.</a> Science. 235, 1517-1520 (1987).</li><li>Berns, M. W., Aist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+cell+and+developmental+biology.">Laser microsurgery in cell and developmental biology.</a> Science. 213, 505-513 (1981).</li><li>Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+with+molecular+fluorescence+imaging+using+activatable+cell-penetrating+peptides+decreases+residual+cancer+and+improves+survival.">Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).</li><li>Stiess, M., Maghelli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+extension+occurs+independently+of+centrosomal+microtubule+nucleation.">Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation.</a> Science. 327, 704-707 (2010).</li><li>Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+induced+cell+fusion+in+combination+with+optical+tweezers:+the+laser+cell+fusion+trap.">Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap.</a> Cytometry. 12, 505-510 (1991).</li><li>Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+delivery+of+liposome+encapsulated+chemical+stimuli+to+neuronal+cells.">Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells.</a> J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).</li><li>Kress, H., Park, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+stimulation+with+optically+manipulated+microsources.">Cell stimulation with optically manipulated microsources.</a> Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).</li><li>Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+history+of+laser+scissors+(microbeams).">A history of laser scissors (microbeams).</a> Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).</li><li>Difato, F., Dal, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+optical+tweezers+and+laser+dissector+for+controlled+ablation+of+functional+connections+in+neural+networks.">Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks.</a> Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).</li><li>Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+observations+on+the+development+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).</li><li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction.">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li><li>O'Toole, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+stretching+in+slow+axonal+transport.">The role of stretching in slow axonal transport.</a> Biophys. J. 100, 351-360 (2011).</li><li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+model+of+axonal+elongation:+force,+viscosity,+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth.">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).</li><li>Difato, F., Tsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+actin+waves+during+regeneration+after+axonal+lesion+is+enhanced+by+BDNF.">The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF.</a> Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).</li><li>Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+optical+manipulation+and+electrophysiological+tools+to+modulate+and+record+activity+in+neural+networks.">Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks.</a> International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).</li><li>Guiggiani, A., Torre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+and+long-term+interferometric+tracking+by+static+and+dynamic+force-clamp+optical+tweezers.">Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers.</a> Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).</li><li>Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RealTime+Suite:+a+step-by-step+introduction+to+the+world+of+real-time+signal+acquisition+and+conditioning.">RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning.</a> 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decrease+in+membrane+tension+precedes+successful+cell-membrane+repair.">A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair.</a> Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).</li><li>Kress, H., Stelzer, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+act+as+phagocytic+tentacles+and+pull+with+discrete+steps+and+a+load-dependent+velocity.">Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).</li><li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site.">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li><li>Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+mechanotransduction:+pathways,+probes,+and+physiology.">Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).</li><li>Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+surgery+and+optical+trapping+in+a+laser+scanning+microscope.">Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope.</a> Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).</li><li>Carter, A. R., King, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+an+optical+microscope+to+0.1+nm+in+three+dimensions.">Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions.</a> Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li><li>Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+strategies+for+control+of+neuronal+cell+adhesion:+A+review.">Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review.</a> Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는이 연구에서 레이저 유도 세포 병변 동안 동시 힘 분광 측정을 수행하여 문화 기판에 돌기 접착력을 비교하는 정량 방법을보고합니다. 긴장의 측정 자료는 기판 세포의 부착 정도와 관련되어 초점 유착의 높은 숫자를 가진 세포는 덜 긴장을 해제해야합니다. piconewtons의 측면에서 긴장의 방출을 측정하는 것은 서로 다른 실험 조건 14 문화 지원에 축삭 접착력을 평가하는 물리적 인 ?...

광학 현미경은 살아있는 세포를 관찰 할 수있는보다 적게 침략 이미징 시스템 중 하나입니다. 이러한 방사 압력 (광학 핀셋 1에서와 같이), 또는 고 에너지 광자 플럭스 (레이저 해부 2 등) 등의 효과의 착취,이 기술은 나노 조작으로 확장되었다. 광학 이미징 시스템은 3을 시각화하고 하위 표적 세포를 조작하는 정밀한 제어를 비치한다. 동시에, 전달 된 레이저 출력의 정확한 교정 덕분에, 광학 도구는 전례없는 재현성도 부드럽거나 침입 샘플 조작을 수행. 여러 실험실 다른 세포는 5 융합하거나, 광학적으로 구동화물 6,7에 의해 세포를 자극하는 세포 소기관 4, 브레이션하기 위해 동일한 실험 장치, 광학 핀셋 및 레이저 해부에 통합됩니다. 광 핀셋, 광 강도의 보정 후를 허용하면서piconewton 규모의 셀에 적용되는 힘의 제어, 레이저 박리 시스템은 막 사진 por​​ation에서 하위 세포 구조의 단일 세포 기관 또는 박리 절제 범위는 광학 조작, 조절 할 수 있습니다. 그러나 레이저 해부 교정은 주로 시편 8 인한 형태 학적 변화를 설명하는 이미지 분석을 기반으로 샘플 공급 에너지에 대하여 광학 조작의 실체의 질적 평가에 의존합니다. 제시된 방법으로, 우리는 piconewton 규모에, 정량화, 개발 신경 세포의 레이저 축삭 해부 동안 힘 분광 측정을 수행하는 방법을 보여줍니다, 하위 세포 구획 9 골격 구조에서 변경된 평형에 의해 생성되는 힘. 교양 뉴런은 기판에 부착하고, 개발 과정에서 극성. 편광 단계는 체외에서 처음 다섯 일 동안 발생합니다. 단계에서 편광의 두 extrud 중 하나ING의 신경 돌기는 오래되어, 축삭 10되기 위해 차별화됩니다. 성장 원뿔 견인 힘 님의 질문에 답변 축삭 신장은 이전 Dennerl의 모델 (11)에 의해 모델링되었습니다. 최근이 모델은 세포 외 기질 기판 돌기 접착의 역할을 포함하는 12 확장되었습니다. 실험 관찰 13 후 제안이 생물 물리학 모델은, 신경 돌기를 따라 전파, 성장 콘에 힘을 당기는 기판에 초점 유착에 의해 변조 것으로 나타났다. 마찬가지로, 축삭 병변은 세포체쪽으로 전파 긴장의 로컬 버전을 생성합니다. 따라서, 우리는 병변과 셀 소마 사이의 축삭을 따라 위치에 같은 발표 장력을 측정하는 것은 영향을받지 초점 유착 꺾는 결과를 평가할 수있는 가능성을 제공하는 제안했다. 우리는 잊어 버리고 축삭은 damag의 범위를 제어하는​​ 데 필요한 에너지 레이저 해부학자의 광자 플럭스 보정E, 완전 절개에서 부분적인 병변. 교정 후, 우리는 몇 가지 차별화 된 뉴런의 축색 돌기에 부분적으로 병변을 반복 장력 릴리스를 계량 프로토콜을 개발하고, 따라서 기판 (14)에 축삭의 접착력을 측정하는 정량적 매개 변수를 얻을. 본 연구에서, 우리는 세부에서 이러한 화학적 처리 14, 또는 세포 배양 지원의 다른 유형과 같은 다른 실험 조건에서 기판에 축삭 접착력을 평가하고 piconewton 감도와 비교하는 정확한 실험 절차를 나타냅니다 개발 된 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Polymer microspheres, 4 &amp;mu;m, COOH coated</td><td>Bangs laboratories</td><td>PC05N/6700</td><td></td></tr><tr><td>PolyLink Protein Coupling Kit</td><td>Polyscience</td><td>19539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>IR laser</td><td>IPG Laser GmbH</td><td>YLM-5-SC-LP</td><td>ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization</td></tr><tr><td>Spatial light modulator</td><td>Hamamatsu</td><td>LCOS-SLM 10468-07</td><td></td></tr><tr><td>Blue-tweezers software</td><td>Optics group, University of Glasgow</td><td>Free downloadable software</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Hamamatsu</td><td>Free downloadable software</td><td>&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://rsbweb.nih.gov/ij/ &lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>QPD</td><td>Thorlabs</td><td>S5980 with C5460SPL 6041 board</td><td>Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement</td></tr><tr><td>PD</td><td>Teem Photonics</td><td>PDA100A-EC</td><td>Photodiode to measure z trapped probe displacement</td></tr><tr><td>nano-Pulse UV laser</td><td>AA-optoelctronics</td><td>PNV-001525-040</td><td>Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps</td></tr><tr><td>Acoustic Optic Modulator</td><td>Olympus</td><td>MQ110-A3-UV, 355nm fused silica</td><td></td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Andor</td><td>BX51</td><td>Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Warner Instruments</td><td>V887ECSUVB EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Peltier device</td><td>Physic Instruments</td><td>QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stage: micro+piezo stage</td><td>National Instruments</td><td>Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD</td><td></td></tr><tr><td>Daq</td><td></td><td>NI PCI-6229</td><td>Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage</td></tr><tr><td>Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine</td><td></td><td></td><td>Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop</td></tr></tbody></table>

measurement of tension release during laser induced axon lesion to evaluate axonal adhesion to the substrate at piconewton and millisecond resolution

개발 신경 네트워크 기능 연결의 형성은 외부의 신호에 의해 영향을 받는다. 개발 신경 세포의 신경 돌기 성장은 화학적 및 기계적 신호에 따라, 그리고 메커니즘을하는 기계적인 신호는 감지 및 응답을 제대로 이해하고 있습니다. 세포의 성숙에 힘의 역할을 해명하는 것은 기판에 세포 부착 및 세포 구조 커플 링을 홍보 할 수있는 발판의 디자인을 활성화하고 따라서 부상 후 재생하는 다른 신경 세포 유형의 능력을 향상시킬 것입니다. 여기, 우리는 레이저에 의한 세포 병변 동안 동시 힘 분광 측정을 적용하는 방법을 설명합니다. 우리는 축삭의 세포막에 부착 광학적 포획 프로브의 동시 간섭 추적에 의해 부분적으로 lesioned 축삭의 긴장 방출을 측정합니다. 우리의 실험 프로토콜은 piconewton 감도와 긴장의 방출을 감지하고의 긴장 릴리스의 동적밀리 초 시간 해상도. 따라서 세포와 기질 사이의 기계적인 결합이 약물 치료 및 / 또는 기판의 독특한 기계적 특성에 의해 조절 될 수있는 방법을 연구하는 고해상도 방법을 제공합니다.

세포는 초점 유착에 의해 기판에 견인 힘을 생성합니다. 세포 골격 요소에 의해 생성 된 힘은 문화 기판의 반작용 힘 평형에 있습니다. 신경 돌기의 레이저 유도 병변 후, 긴장된 골격 케이블 중 일부는 중단되고 기판 접착의 반대 힘이 제거되기 때문에 해당 평형 장력이 해제됩니다. 출시 긴장 부분적으로 영향을받지 초점 유착에 배포하고, 광학 트랩에서 개최 세포막에 부착 구슬 (회로도 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution at JoVE.

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

우리는 부분적으로 축삭의 세포막에 부착 광학적 포획 프로브에서 수행 동시 힘 분광 측정으로 레이저 해부학자로 lesioned 된 축삭의 긴장 방출을 측정 하였다. 개발 된 실험 프로토콜은 문화 기판에 축삭 접착력을 평가합니다.

레이저 유도 축삭 병변 동안 긴장 릴리스의 측정 Piconewton 및 밀리 초 단위의 해상도로 기판에 축삭 접착을 평가하는

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

measurement-tension-release-during-laser-induced-axon-lesion-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K 조회수.  National Research Council of Italy. 우리는 부분적으로 축삭의 세포막에 부착 광학적 포획 프로브에서 수행 동시 힘 분광 측정으로 레이저 해부학자로 lesioned 된 축삭의 긴장 방출을 측정 하였다. 개발 된 실험 프로토콜은 문화 기판에 축삭 접착력을 평가합니다.

비디오: Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

에서 축삭 재생을 연구하는 저예산 레이저 Axotomy 시스템 구축 C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

연구

생체공학

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the 10-1000 &mu;dyne range1,2. Force measurements are obtained through observation of the Hookean bending of the glass needles, which are calibrated by a direct and empirical method3. Equipment requirements and procedures for fabricating, calibrating, treating, and using the needles on cells are fully described. The force regimes previously used and different cell types to which these techniques have been applied demonstrate the flexibility of the methodology and are given as examples for future investigation4-6. The technical advantages are the continuous 'visualization' of the forces produced by the manipulations and the ability to directly intervene in a variety of cellular events. These include direct stimulation and regulation of axonal growth and retraction7; as well as detachment and mechanical measurements on any type of cultured cell8.

Application and direct measurements of forces on neurons in the 2-1000 microdyne range are achieved with high precision using calibrated glass needles. This methodology can be used to control and measure several aspects of axonal development, including axonal initiation, axonal tension, velocity of axonal elongation, and force vectors.

Axonal 개발 제어하기 위해 뉴런의 기계 조작

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

신경과학

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

소뇌 축삭의 레이저 Nanosurgery<em&gt; 생체</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

장어 Reticulospinal 축삭의 급성 해리는 개별 기능 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴 막에서 녹음을 활성화하는

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

발생학

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

생화학

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

면역 세포에 의한 일시적인 피코네톤 수용체 힘을 매핑하는 DNA 장력 프로브

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

절제된 마우스 티비알 신경에 있는 신경필라멘트 수송의 화상 진찰 그리고 분석

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

레이저 유도 축삭 병변 동안 긴장 릴리스의 측정 Piconewton 및 밀리 초 단위의 해상도로 기판에 축삭 접착을 평가하는

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에서 축삭 재생을 연구하는 저예산 레이저 Axotomy 시스템 구축 C. elegans