실시간 제어 시스템, 통찰력 토론, 자코모 Pruzzo와 알레산드로 PARODI 사용자 정의 전자 제품과 소프트웨어의 개발, 그리고 클라우디아 Chiabrera과 전문가의 조언 및 세포 배양 준비에 도움 마리나 Nanni에 대한 에벨 리나 Chieregatti와 하나코 쓰시마 개발을위한 알베르토 Guiggiani.

1. 광 설치 전체 광학 시스템은 이전 15 설명했다. 간단히, 광 핀셋 시스템은 1064 nm의 (IPG 레이저 GmbH의)에서 이테르븀 연속파 (CW) 광섬유 레이저 운영을 기반으로합니다. 공간 광 변조기 (SLM) (LCOS-SLM 모델 X10468-07 - 하마 마츠) 컴퓨터 생성 홀로그램하여 배양 접시에 포획 초점 반점의 위치를​​ 제어하는​​ 수신 IR 레이저 빔의 위상을 다릅니다. 자유롭게 사용할 수있는 블루 핀셋 소프트웨어 (장비 테이블에 웹 링크)가 생성 홀로그램은 공간 광 변조기에 투사. 와 포토 다이오드 (PD, PDA100A-EC - THORLABS) - 힘 분광 측정을위한 간섭계는 4 사분면 다이오드 (하마 마츠 C5460SPL 6041 보드 QPD, S5980)에 근거했다. 355 nm의 (- 가득 찬다 포토닉스 PNV-001525-040, 파워 칩 나노 펄스 UV 레이저)에서 YAG 레이저 : 레이저 해부 소스 펄스 서브 나노초 UV 노스 다코타이었다. 음향광 변조기 (MQ110-A3-UV, 실리카-AA-옵토 - 전자 융합 355 nm의)는 시료에 전달 UV 레이저의 힘을 통제했다. 현미경의 objective.The 단계는 3 축 리니어 DC 모터의 마이크로 위치로 구성되어 찍기 60X, 0.9 NA 물 장착 - 홀로그램 광학 핀셋 및 레이저 마이크로 해부는 수정 직립 현미경 (올림푸스 BX51)에 통합되었다 의 서브 나노 미터 해상도로 샘플의 거친 움직임을 결합하는 별도의 3 축 압전 나노 포지셔닝 스테이지 (P-733.3DD, 물리학 악기​​) 운반 시스템 (M-126.CG1, 물리 악기) 압전 무대. 현미경 스테이지 시스템은 두 개의 컨트롤을 탑재 한 시너지 효과를 선택한 작동 모드 (정적 또는 동적 위치 또는 힘 클램프) 16에 따라 올바른 위치에 포획 초점 자리를 유지하기 위해 행동을 반복합니다. 특히, 내부 피드백 루프는 선택에 구슬을 유지하기 위해, 압전 단계에 작용트랩 센터 ED 거리. 다른 외부 루프는 스트로크 가능 17보다 큰 영역 압전 액츄에이터에 포함되는 지역을 악용하는 자동화 된 단계의 위치를 제어합니다. 이 샘플을 준수 갇혀 비드를 추적하기 때문에 압전 단계 한 방향에서 사용할 수있는 뇌졸중의 제한에 도달하면, 외부 루프는 반대 방향으로 마이크로 스테이지를 이동, 따라서 압전는 중심 위치를 향해 복구합니다. 압전 단계는 물론 범위의 중심 위치에 도달했을 때, 마이크로 단계는 중단. 시스템의 더 자세한 사항은 Guiggiani 등 16, 17에보고됩니다. 펠티어 장치 (TC-344B 듀얼 채널 히터 컨트롤러와 QE1 저항 가열 - 워너 인스트루먼트는) 현미경 (37 ° C)에 따라 세포 배양의 온도를 제어합니다. 문화, pH와 습도 맞춤 디자인 폴리 디메틸 레이팅에 의해 생리적 조건에서 유지되었다가습 carbogen (95 % O 2, 5 % CO 2)와 실록산 (PDMS) 소매 (현미경 목표를 통합). 2. 세포 배양 준비 모든 실험 프로토콜은 건강의 이탈리아 교육부에 의해 승인되었습니다. 차 문화는 배아 일 18 (E18)에서 생쥐의 해마 (C57BL6J, 찰스 강)에서 하였다. <ol><li> 신경 세포는 유리 바닥 배양 접시에 25,000 세포 / ㎖의 농도 (- MATEK 회사 P35G-0-14-C)에 도금 하였다. 배양 세포의 낮은 농도는 이미 체외에서 첫 번째 일 조밀 한 네트워크의 형성을 방지하기 위해 필요합니다. 언급 세포 농도에서 다른 셀에 연결되지 않은 긴 신경 돌기 격리 된 세포를 찾을 가능성이 훨씬 높다. </li></ol> 3. 비드 코팅 <ol><li> 폴리머 마이크로는 (Ø 4 μm의, COOH-종료-앞머리 연구소, 제품 코드 PC05N/6700) 폴리 코팅 하였다polyLink 단백질 커플 링 키트 (Polysciences, 제품 코드 19539)에 설명 된 절차에 따라-D-라이신. 구슬 문화 지원과 호의 세포 접착을 커버하는 데 사용 된 것과 동일한 분자로 코팅되어 있습니다. </li></ol> 4. 고립 된 신경 세포를 선택합니다. 문화 기판, 트랩에서 비드를 분리하고 신경 옆에 이동 <ol><li> 현미경 스테이지에 문화 페트리 접시를 넣어. 무대 동작하여 샘플에 포커스를 설정 한 후, 콜러 - 조명을 설정하는 조명 목적 콘덴서의 위치를​​ 수정합니다. Kolher - 조명 조건을 설정하는 조명 광학계를 정렬하면 시야 영상 품질을 개선 할 필요가있다. 이러한 정렬 조건을 사용하여, 그것은 QPD와 PD하여 간섭 추적을 수행하기 위해, 산란 갇혀 조사에서, 또한 IR 레이저 수집 효율 (목적 콘덴서를 통해) 극대화 할 필요가있다. </li><li> 에 코팅 된 microsphere의 주식 솔루션의 몇 가지 μl를 피펫배양 접시에. 마이크로는 예금과 문화를 기판에 부착됩니다. 배양 접시에 주입 μL의 수는 원액 microsphere의 농도에 따라 달라집니다. 이상적인 조건은 뷰의 영상 분야마다 미세 하나 사이에 두을 가지고있다. 너무 많은 마이크로는 배양 접시에 추가 될 때, 그들은 이미 배양 된 뉴런 무작위로 첨부 할 수 있습니다. </li><li> 긴 돌기 (축삭)와 격리 된 신경 세포를 검색, 문화 접시 주위에 이동하고, 현미경 스테이지의 위치를​​ 저장합니다. </li><li> 이동 및 문화 지원에 부착 비드를 검색합니다. </li><li> IR 트래핑 레이저를 켭니다. 이 단계에서, 아니 홀로그램은 SLM에 투영되지 않으며, IR 레이저 스폿의 위치는 UV 레이저 스폿의 위치와 일치한다. 현미경 스테이지 운동에 의해 2 ~ 3 μm의 문화 지지체 표면 위에 IR 현장의 축 위치를 설정합니다. </li><li> 미만 μW에 샘플 전달 UV 레이저 파워를 설정합니다.UV 레이저 해부학자는 이전에 14 보정되었습니다 5-6 μW는 유리 지원 소작됩니다 4 μW 신경 세포의 연결이 완전히 해부 신경 돌기가 부분적으로 lesioned되어 2.5 μW &lt;1 μW이 충격파는 배양 접시에서 생산된다. 광 충격파 유리 지원에서 비드를 분리 할 수​​있을만큼 강하다. </li><li> 에 IR 레이저를 유지하면서, UV 레이저를 켜고 현미경 스테이지 운동에 의해 준수 비드 위에 UV 자리를 이동합니다. 비드 표면에서 분리, 그리고 그것은 IR 레이저에 의해 갇혀있다. 그런 다음, UV 레이저를 끄십시오. </li><li> 유리 지원 (20 ~ 30 μm의) 위의 트랩 구슬 몇 마이크로 미터를 이동합니다. 이 위치에 구슬을 해제하면이 이전에 선택한 뉴런을 향해 이동하는 동안 다른 세포에서 그것을 방지 할 수 있습니다. 이전에 저장 한 무대 위치에 구슬을 가져옵니다. 드래그 유체 힘 광학 트랩을 초과하지 않도록 낮은 값 (10 ㎛ / 초)로 단계 속도 설정핑 힘. </li></ol> 5. 컴퓨터 생성 홀로그램에 의한 레이저 해부 스폿 및 축삭 위치에 따라 트랩의 위치를​​ 이동하고, 광학 핀셋 강성 보정 <ol><li> 축삭을 시각화하기 위해 유리 지원을 향해 구슬을 이동합니다. 비드합니다 (약 5 μm의 유리 지원 위)과의 접촉을 피하기 위해 셀 위에 개최됩니다. </li><li> 축삭의 폭의 중앙에 UV 초점 자리를 이동하는 현미경 스테이지를 이동합니다. 현재 단계 위치를 저장합니다. </li><li> 컴퓨터 생성 홀로그램에 의한 IR 초점 반점의 위치를​​ 이동합니다. 이 단계에서는 단계는 이전 단계에서 선택한 위치에 중단됩니다. 컴퓨터 생성 홀로그램 SLM에 투영 될 때, 트랩 비드 축삭에 대해 이동합니다. 우리는 너무 같은 돌기를 중심으로 UV 레이저 반점과 더불어 갇힌 구슬 돌기의 중앙에 정렬하도록 IR 레이저 자리를 이동합니다. IR 자리하고 따라서 트랩 비드 돌기를 따라 배치됩니다멀리 UV 반점 5-10 μm의. 우리는 신경 돌기 구조에 따라 UV 반점에 대하여 IR의 위치를​​ 이동합니다. 광 핀셋은 SLM 시스템이 장착되지 않은 경우에, 위치는 IR 광 경로의 기울기 거울, 또는 음향 광학 디플렉터에 의해 변경 될 수 있습니다. IR 레이저 스폿의 브라운 운동에 영향을하고 힘 분광 흔적을 변경할 수 갇혀 프로브와 해부 빔의 광학 상호 작용을 방지하기 위해 UV 지점에서 멀리 ~ 10 μm의를 배치 할 수 있습니다. </li><li> UV 반점 및 축삭의 위치와 관련하여 새로운 IR 현장의 위치를​​ 정의한 후, 멀리 축삭에서 갇혀 비드를 배치하고 충돌을 피하기 위해 무대를 이동합니다. 커버 유리 위에 약 2 μm의 덫 비드의 축 위치를 이동합니다. </li><li> 중앙 그것에 간섭 변두리에 QPD를 정렬 : QPD가 중앙에 때 x와 y QPD 차동 신호는 제로입니다. interfero에 의해 갇혀 비드의 브라운 운동의 5 초를 취득미터, 50 kHz 샘플링 속도. 파워 스펙트럼 방법 18에 의해 광 트랩의 강성 (PN / NM) 및 감도 (V / NM) 구하십시오. </li></ol> 6. 축삭에 비드를 부착합니다. Axotomy과 동시 힘 측정을 수행 <ol><li> 커버 유리 위 4 μm의 갇힌 구슬의 위치를​​ 올리고, (단계 3.2 참조) 이전에 저장된 단계의 위치로 이동합니다. </li><li> 축삭을 향해 갇혀 비드 아래로 이동이 접촉 돌기를 때까지. 갇혀 비드와 축삭 사이의 충돌은 축 방향 갇혀 비드의 변위를 감지 Z QPD 신호에 의해 모니터링됩니다. </li><li> 트랩 비드와 10 초를 기다립니다 돌기 막에의 부착을 선호하는 축삭에 밀어. </li><li> 축삭에서 갇혀 비드를 치환하는 마이크로 스테이지를 이동하고, 따라서 세포의 막에의 접착력을 확인합니다. 구슬 부착하면 광학 트랩에서 탈출. </li><li> 준수 비드에 레이저 트랩을 뒤로 이동0으로 똑같은 힘의 상태와 힘 클램프 루프 전환합니다. 같은 방법으로, 광학 트랩 중앙에, 세포에 부착 된 압전 단계 재배치 구슬,. 시스템이 피드백 루프 제어가없는 경우, 레이저 트랩 위치는 부착 프로브를 중심 그것에 현미경 스테이지로 이동할 수 있습니다. QPD 신호가 구슬 갇혀 셀 (x와 0이 Y QPD 신호와 Z QPD 신호 사분면의 동일한 전압 금액을 제공을 준수하지 않을 때와 같은 경우 트랩의 중심에 도달 로 비드)는 어떤 표면에서 멀리 갇혀됩니다. </li><li> 준수 갇혀 프로브 텐션을 생성하는 비드의 중심 (약 100 nm의)에 약간 트래핑 레이저의 위치를​​ z 축에 힘 클램프 상태를 설정합니다. 시스템이 강제 클램프 제어가 장착되어 있지 않은 경우, 광학 트랩 위치는 현미경 스테이지로 25 나노의 단계에서 제기 될 수있다. Z QPD 신호를 모니터링 할 수 있습니다. 따라서 생을 사용s는 부착 된 프로브에 대해 레이저 트랩의 위치를​​ 설정하는 신호. 이러한 사전 장력 축삭 병변 후 막에 긴장하고 준수 프로브의 브라운 운동의 필연적 인 감소를 감지하는 데 필요합니다. 유사한 접근 방식은 비디오 영상 19으로 막 밧줄에 긴장의 방출을 측정을 제안하고있다. </li><li> 스위치 - 오프 위치 클램프 조건 (피에조 스테이지 차단)에 부착 된 프로브의 힘을 측정하는 힘 - 클램프의 피드백. </li><li> 레이저 axotomy 시간 경과 시야 영상 (20 Hz의 프레임 속도) 동안 간섭계 (20 kHz 샘플링 주파수) 및 세포를 포획 프로브 위치의 동시 녹음을 시작합니다. </li><li> 병변은 축삭의 이미지 (. 보통 200-400 광 펄스가 펄스 당 에너지 필요합니다 : 25 NJ)에 표시 될 때까지 레이저 펄스를 전달하기 위해 UV 레이저를 켠 후 UV 레이저를 끄십시오. </li><li> 약 3 마일을 위해 간섭계 녹음을 계속N, X, Y 및 Z QPD 트레이스 고원에 도달 할 때까지. </li></ol> 7. 총 장력 릴리스를 정량화 <ol><li> 나노 미터 각각의 트레이스를 얻기 위해, 광학 트랩의 보정 감도가 기록 QPD 흔적 (볼트)로 변환합니다. </li><li> 10 Hz에서에서 잘라와 하이 패스 필터에 의해 X, Y 및 Z 변위 추적을 필터링합니다. </li><li> 갇혀 비드의 브라운 운동을 대표하는 필터링 흔적의 총 분산을 계산합니다. 500 밀리 초 (10,000 데이터 포인트) 20 시간 창을 겹치지 25 밀리 초 단계로 분산을 계산합니다. 추적 필터링 하이 패스 막 변동 또는 대뇌 피질 굴지의 움직임에 의한 브라운 운동의 변화를 제외합니다. 구슬의 브라운 운동은 세포막에 광학 힘과 접착 힘에 의해 감소​​된다. 막 때문에 점도가 증가 긴장의 방출, 따라서 구슬의 브라운 운동의 긴장 될 때, immedi 감지ately axotomy 후 감소하기 시작합니다. </li><li> T0를 정의 브라운 운동 분산의 감소의 시작을, UV 레이저 에너지의 전달 후. 시간 인스턴트 T0는 막 변형의 시작을 나타냅니다. </li><li> 브라운 운동 분산 (가 고원에 도달 할 때)의 감소의 끝 : T1을 정의합니다. 시간 인스턴트 T1은 막 긴장의 끝을 나타냅니다. </li><li> 힘 측정하는 동안 시료의 변위를 측정하기 위해, 커버 유리 지원에 이물질이나 스크래치 비디오 추적을 수행합니다. 유리 지원에 입자를 추적하기 위해 우리는 먼저 검정색 배경에 흰색 입자와 함께 바이너리 이미지의 스택을 얻기 위해, 시야 이미지에 임계 값을 적용합니다. 다음, 우리는 서브 픽셀 정밀도 (프리웨어 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여)와 질량 입자의 중심을 추적 할 수 있습니다. </li><li> 변위 QPD 흔적에서 측정 된 드리프트를 뺍니다. 각각의 보정 광학 강성 (k x, k 님 드리프트 보정 QPD 흔적을 곱 <suB&gt; Y, K Z)는 piconewtons에서 FX는, FY, FZ 흔적을 구하십시오. </li><li> 로 전체 힘 추적을 계산 F TOT = √ (FX 2 + 기 2 + FZ 2). </li><li> 로 T0와 T1 사이의 힘의 전체 버전을 계산 F 출시 = F TOT (T1) - F TOT (T0). 이 트랩 센터에서 프로브의 변위에 의한 것입니다 때문에 T0에서 측정 된 힘은, 차감되어야 할 때 신경 돌기의 구슬을 준수합니다. </li><li> 갇혀 비드와 UV 레이저 스팟 위치 사이의 신경 돌기의 접촉 면적을 계산 갇혀 비드와 UV 레이저 스팟 위치 사이의 신경 돌기의 밝은 필드 이미지 측정에 긴 (L) 및 단기 (D) 축. 축삭의 접촉 면적은 축삭입니다 = L X D. </li><li> 발표 한 총 출시 힘 F를 정상화 축삭 접촉 면적 축삭. </li></ol>

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Opt. 46, 421-427 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li><li>Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+strategies+for+control+of+neuronal+cell+adhesion:+A+review.">Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review.</a> Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는이 연구에서 레이저 유도 세포 병변 동안 동시 힘 분광 측정을 수행하여 문화 기판에 돌기 접착력을 비교하는 정량 방법을보고합니다. 긴장의 측정 자료는 기판 세포의 부착 정도와 관련되어 초점 유착의 높은 숫자를 가진 세포는 덜 긴장을 해제해야합니다. piconewtons의 측면에서 긴장의 방출을 측정하는 것은 서로 다른 실험 조건 14 문화 지원에 축삭 접착력을 평가하는 물리적 인 ?...

광학 현미경은 살아있는 세포를 관찰 할 수있는보다 적게 침략 이미징 시스템 중 하나입니다. 이러한 방사 압력 (광학 핀셋 1에서와 같이), 또는 고 에너지 광자 플럭스 (레이저 해부 2 등) 등의 효과의 착취,이 기술은 나노 조작으로 확장되었다. 광학 이미징 시스템은 3을 시각화하고 하위 표적 세포를 조작하는 정밀한 제어를 비치한다. 동시에, 전달 된 레이저 출력의 정확한 교정 덕분에, 광학 도구는 전례없는 재현성도 부드럽거나 침입 샘플 조작을 수행. 여러 실험실 다른 세포는 5 융합하거나, 광학적으로 구동화물 6,7에 의해 세포를 자극하는 세포 소기관 4, 브레이션하기 위해 동일한 실험 장치, 광학 핀셋 및 레이저 해부에 통합됩니다. 광 핀셋, 광 강도의 보정 후를 허용하면서piconewton 규모의 셀에 적용되는 힘의 제어, 레이저 박리 시스템은 막 사진 por​​ation에서 하위 세포 구조의 단일 세포 기관 또는 박리 절제 범위는 광학 조작, 조절 할 수 있습니다. 그러나 레이저 해부 교정은 주로 시편 8 인한 형태 학적 변화를 설명하는 이미지 분석을 기반으로 샘플 공급 에너지에 대하여 광학 조작의 실체의 질적 평가에 의존합니다. 제시된 방법으로, 우리는 piconewton 규모에, 정량화, 개발 신경 세포의 레이저 축삭 해부 동안 힘 분광 측정을 수행하는 방법을 보여줍니다, 하위 세포 구획 9 골격 구조에서 변경된 평형에 의해 생성되는 힘. 교양 뉴런은 기판에 부착하고, 개발 과정에서 극성. 편광 단계는 체외에서 처음 다섯 일 동안 발생합니다. 단계에서 편광의 두 extrud 중 하나ING의 신경 돌기는 오래되어, 축삭 10되기 위해 차별화됩니다. 성장 원뿔 견인 힘 님의 질문에 답변 축삭 신장은 이전 Dennerl의 모델 (11)에 의해 모델링되었습니다. 최근이 모델은 세포 외 기질 기판 돌기 접착의 역할을 포함하는 12 확장되었습니다. 실험 관찰 13 후 제안이 생물 물리학 모델은, 신경 돌기를 따라 전파, 성장 콘에 힘을 당기는 기판에 초점 유착에 의해 변조 것으로 나타났다. 마찬가지로, 축삭 병변은 세포체쪽으로 전파 긴장의 로컬 버전을 생성합니다. 따라서, 우리는 병변과 셀 소마 사이의 축삭을 따라 위치에 같은 발표 장력을 측정하는 것은 영향을받지 초점 유착 꺾는 결과를 평가할 수있는 가능성을 제공하는 제안했다. 우리는 잊어 버리고 축삭은 damag의 범위를 제어하는​​ 데 필요한 에너지 레이저 해부학자의 광자 플럭스 보정E, 완전 절개에서 부분적인 병변. 교정 후, 우리는 몇 가지 차별화 된 뉴런의 축색 돌기에 부분적으로 병변을 반복 장력 릴리스를 계량 프로토콜을 개발하고, 따라서 기판 (14)에 축삭의 접착력을 측정하는 정량적 매개 변수를 얻을. 본 연구에서, 우리는 세부에서 이러한 화학적 처리 14, 또는 세포 배양 지원의 다른 유형과 같은 다른 실험 조건에서 기판에 축삭 접착력을 평가하고 piconewton 감도와 비교하는 정확한 실험 절차를 나타냅니다 개발 된 프로토콜을 설명합니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer microspheres, &Oslash; 4 &mu;m, COOH coated</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>PC05N/6700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyLink Protein Coupling Kit</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>19539</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR laser</td>
			<td>IPG Laser GmbH</td>
			<td>YLM-5-SC-LP</td>
			<td>ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatial light modulator</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>LCOS-SLM 10468-07</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-tweezers software</td>
			<td>Optics group, University of Glasgow</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/" target="_blank">http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/ </a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPD</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S5980 with C5460SPL 6041 board</td>
			<td>Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD</td>
			<td>Teem Photonics</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Photodiode to measure z trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano-Pulse UV laser</td>
			<td>AA-optoelctronics</td>
			<td>PNV-001525-040</td>
			<td>Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acoustic Optic Modulator</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>V887ECSUVB EMCCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier device</td>
			<td>Physic Instruments</td>
			<td>QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage: micro+piezo stage</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NI PCI-6229</td>
			<td>Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of tension release during laser induced axon lesion to evaluate axonal adhesion to the substrate at piconewton and millisecond resolution

개발 신경 네트워크 기능 연결의 형성은 외부의 신호에 의해 영향을 받는다. 개발 신경 세포의 신경 돌기 성장은 화학적 및 기계적 신호에 따라, 그리고 메커니즘을하는 기계적인 신호는 감지 및 응답을 제대로 이해하고 있습니다. 세포의 성숙에 힘의 역할을 해명하는 것은 기판에 세포 부착 및 세포 구조 커플 링을 홍보 할 수있는 발판의 디자인을 활성화하고 따라서 부상 후 재생하는 다른 신경 세포 유형의 능력을 향상시킬 것입니다. 여기, 우리는 레이저에 의한 세포 병변 동안 동시 힘 분광 측정을 적용하는 방법을 설명합니다. 우리는 축삭의 세포막에 부착 광학적 포획 프로브의 동시 간섭 추적에 의해 부분적으로 lesioned 축삭의 긴장 방출을 측정합니다. 우리의 실험 프로토콜은 piconewton 감도와 긴장의 방출을 감지하고의 긴장 릴리스의 동적밀리 초 시간 해상도. 따라서 세포와 기질 사이의 기계적인 결합이 약물 치료 및 / 또는 기판의 독특한 기계적 특성에 의해 조절 될 수있는 방법을 연구하는 고해상도 방법을 제공합니다.

세포는 초점 유착에 의해 기판에 견인 힘을 생성합니다. 세포 골격 요소에 의해 생성 된 힘은 문화 기판의 반작용 힘 평형에 있습니다. 신경 돌기의 레이저 유도 병변 후, 긴장된 골격 케이블 중 일부는 중단되고 기판 접착의 반대 힘이 제거되기 때문에 해당 평형 장력이 해제됩니다. 출시 긴장 부분적으로 영향을받지 초점 유착에 배포하고, 광학 트랩에서 개최 세포막에 부착 구슬 (회로도 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution at JoVE.

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

우리는 부분적으로 축삭의 세포막에 부착 광학적 포획 프로브에서 수행 동시 힘 분광 측정으로 레이저 해부학자로 lesioned 된 축삭의 긴장 방출을 측정 하였다. 개발 된 실험 프로토콜은 문화 기판에 축삭 접착력을 평가합니다.

레이저 유도 축삭 병변 동안 긴장 릴리스의 측정 Piconewton 및 밀리 초 단위의 해상도로 기판에 축삭 접착을 평가하는

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

measurement-tension-release-during-laser-induced-axon-lesion-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K 조회수.  National Research Council of Italy. 우리는 부분적으로 축삭의 세포막에 부착 광학적 포획 프로브에서 수행 동시 힘 분광 측정으로 레이저 해부학자로 lesioned 된 축삭의 긴장 방출을 측정 하였다. 개발 된 실험 프로토콜은 문화 기판에 축삭 접착력을 평가합니다.

비디오: Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

연구

생체공학

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

에서 축삭 재생을 연구하는 저예산 레이저 Axotomy 시스템 구축 C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

전기장에 의한 해제 및 측정 (EFIRM)에 의해 Exosomal 바이오 마커의 검출

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and adverse effects1,2,3,4,5,6,7. However, several challenges remain before these treatments can be applied more widely. The development and validation of intraductal therapeutics in an appropriate animal model facilitate the development of intraductal therapeutic strategies for patients. While the mouse mammary gland has been widely used as a model system of mammary development and tumorigenesis, the anatomy is distinct from the human gland. A larger animal model, such as the rabbit, may serve as a better model for mammary gland structure and intraductal therapeutic development. In contrast to mice, in which ten ductal trees are spatially distributed along the body axis, each terminating in a separate teat, the rabbit mammary gland more closely resembles the human gland, with multiple overlapping ductal systems that exit through separate openings in one teat. Here, we present minimally invasive methods for the delivery of reagents directly into the rabbit mammary duct and for visualization of the delivery itself with high-resolution ultrasound imaging.

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

토끼 유선으로 관내 배달

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

신경 임 플 란 트의 연 화 행동을 예측 하기 위해 환경 동적 기계적인 분석

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many cell functions and behaviors. To calibrate and image integrin tension with high force sensitivity and spatial resolution, we developed an integrative tension sensor (ITS), a DNA-based fluorescent tension sensor. The ITS is activated to fluoresce if sustaining a molecular tension, thus converting force to fluorescent signal at the molecular level. The tension threshold for ITS activation is tunable in the range of 10&#8211;60 pN that well covers the dynamic range of integrin tension in cells. On a substrate grafted with an ITS, the integrin tension of adherent cells is visualized by fluorescence and imaged at submicron resolution. The ITS is also compatible with cell structural imaging in both live cells and fixed cells. The ITS has been successfully applied to the study of platelet contraction and cell migration. This paper details the procedure for the synthesis and application of the ITS in the study of integrin-transmitted cellular force.

Integrin tension plays important roles in various cell functions. With an integrative tension sensor, integrin tension is calibrated with picoNewton (pN) sensitivity and imaged at submicron resolution.

Integrin 긴장과 셀룰러 힘 통합 긴장 센서와 서브 마이크론 해상도 이미징

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

면역 세포에 의한 일시적인 피코네톤 수용체 힘을 매핑하는 DNA 장력 프로브

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...