Alberto Guiggiani para o desenvolvimento do sistema de controle em tempo real, Evelina Chieregatti e Hanako Tsushima para discussões criteriosas, Giacomo PRUZZO e Alessandro Parodi para o desenvolvimento de produtos eletrônicos personalizados e softwares, e Claudia Chiabrera e Marina Nanni para seu aconselhamento e assistência na preparação de cultura de células.

1. Setup Optical O sistema óptico inteiro foi anteriormente descrito 15. Resumidamente, o sistema de pinças ópticas baseia-se numa onda contínua itérbio (CW), fibra de laser que opera a 1064 nm (IPG Laser GmbH). Um modulador de luz espacial (SLM) (LCOS-GSP, modelo X10468-07 - Hamamatsu) varia a fase do feixe de laser de entrada de IR para controlar a posição do foco pontual aprisionamento no prato de cultura por hologramas gerados por computador. As livremente disponíveis Blue-pinças de software (link da web na mesa do equipamento) hologramas gerados projetada no modulador de luz espacial. O interferômetro para medidas de espectroscopia de força foi baseado em um fotodiodo de quatro quadrantes (QPD, S5980 com C5460SPL 6041 bordo - Hamamatsu) e um fotodiodo (PD, PDA100A-CE - Thorlabs). A fonte dissecção a laser pulsado foi um sub-nanossegundo UV Nd: YAG laser em 355 nm (PNV-001525-040, Powerchip nano-Pulse laser UV - Teem Photonics). Uma acusto-modulador óptico (MQ110-A3-UV, 355 nm de sílica fundida-AA-opto-electrónico), controlada a potência do laser UV entregue à amostra. O holográfico pinças ópticas e a laser de micro-dissecção foram integrados num microscópio vertical modificado (BX51 - Olympus), equipado com um 60X, 0,9 NA água mergulhando fase objective.The do microscópio é composto por um motor DC de 3 eixos de posicionamento linear de micro- sistema (M-126.CG1, Física-Instruments) carregando um piezoelétrico fase de posicionamento nano 3 eixos separado (P-733.3DD, Física-Instruments) para combinar o movimento grosseiro da amostra com a resolução sub-nanométrica da piezo- fase. O sistema de estrado de microscópio foi equipado com duas malhas de controle agindo sinergicamente para manter o foco pontual aprisionamento na posição direita, dependendo do modo de funcionamento seleccionado (ou posição de fixação força, estático ou dinâmico) 16. Em particular, um loop de feedback interno atua em um palco piezoelétrico, para manter a conta em um selected distancia do centro da armadilha. O outro loop externo, controla a posição da fase motorizada para explorar a região medido pela piezo actuador em uma área maior do que o seu curso disponível 17. Quando a fase de piezo atinge o limite do curso disponível numa direcção, o laço externo move a fase de micro no sentido oposto, pelo que o piezo recupera para a sua posição central, porque ele está seguindo o talão prendido aderiu à amostra. Quando a fase de piezo atinge a posição central da sua gama de curso, a fase de micro interrompida. Outros detalhes do sistema estão apresentados na Guiggiani et ai 16,17. Um dispositivo de Peltier (QE1 aquecimento resistivo de aquecimento com controlador de canal duplo TC-344B - Warner Instruments) controla a temperatura da cultura de células ao microscópio (37 ° C). Na cultura, pH e humidade foram mantidas em condições fisiológicas, gaseificar um polidimetil costume concebidosiloxano (PDMS), manga (integrando a objetiva do microscópio) com carbogen umidificado (95% O 2, 5% CO 2). 2. Cultura celular Preparação Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano. As culturas primárias foram obtidos a partir de hipocampo de ratinhos (C57Bl6J, Charles River) no dia embrionário 18 (E18). <ol><li> Os neurónios foram plaqueados a uma concentração de 25.000 células / ml em placas de Petri de vidro de fundo (P35G-0-14-C - matek Corporation). A baixa concentração de células de cultura é necessária para evitar a formação de uma rede densa já nos primeiros dias in vitro. Na concentração de células mencionado, a probabilidade de encontrar as células isoladas com um longo de neurites não ligado a outras células é muito maior. </li></ol> 3. Revestimento Bead <ol><li> Polymer microesferas (Ø 4 mm, COOH-terminado-Bangs Laboratories, código de produto PC05N/6700) foram revestidas com poli-D-lisina seguindo o procedimento descrito no polyLink Protein Coupling Kit (Polysciences, código de produto 19539). Os grânulos são revestidos com a mesma molécula usada para cobrir o suporte de cultura e as células favor aderência. </li></ol> 4. Escolha neurônio isolado. Retire uma gota da cultura do substrato, Trap e movê-lo próximo ao neurônio <ol><li> Coloque a cultura de Petri no palco microscópio. Depois de definir o foco na amostra pelo movimento palco, corrigir a posição do condensador objetivo esclarecedor para definir Kohler-iluminação. Alinhando a ótica de iluminação para definir a condição Kölher-iluminação é necessária para melhorar a qualidade de imagem brilhante campo. Utilizando essas condições de alinhamento, é também necessário para maximizar a eficiência de recolha do laser de IV (através do condensador objectivo), a partir da sonda presa espalhamento, para realizar o seu rastreamento interferométrico pelo QPD e DP. </li><li> Pipetar alguns mL da solução estoque em microesfera revestidapara o prato de cultura. Microesferas irá depositar e aderir ao substrato de cultura. O número de ul injectada na placa de cultura depende da concentração da solução de microesferas de estoque. A condição ideal é ter entre um e dois microesferas por campo de imagem de visão. Quando muitos microesferas são adicionados ao prato de cultura, eles podem já anexar aleatoriamente aos neurónios em cultura. </li><li> Movimente-se na placa de cultura, em busca de um neurônio isolado com uma neurite mais tempo (o axônio) e guardar a posição do palco microscópio. </li><li> Movimente-se e procurar um talão aderiu ao apoio da cultura. </li><li> Ligue o laser trapping IR. Nesta fase, os hologramas não são projectadas SLM, e a posição do ponto de laser IR coincide com a posição do feixe de laser de UV. Definir a posição axial do local IR 2-3 mM acima da superfície de suporte da cultura, pelo movimento platina do microscópio. </li><li> Definir a potência do laser UV entregue à amostra a menos de 1 μW. OLaser UV de dissecção foi previamente calibrado 14: 5-6 μW o apoio de vidro é ablated 4 μW uma ligação neuronal é completamente dissecados 2,5 μW um neurites está parcialmente lesionada &lt;1 μW uma onda de choque é produzida na placa de cultura. A onda de choque óptico é suficientemente forte para separar o talão do suporte de vidro. </li><li> Ligue o laser UV, deixando o laser IR, e mover o ponto UV acima do cordão aderido pelo movimento estágio do microscópio. Os destaca talão da superfície, e é preso pelo laser IR. Em seguida, desligue o laser UV. </li><li> Mova os presos talão vários micrômetros acima do suporte de vidro (20-30 mm). Levantando o talão para esta posição vai impedi-lo de entrar em contato com outras células, enquanto ele está sendo transferido para o neurônio previamente escolhido. Traga o talão para a posição palco salvo anteriormente. Ajuste a velocidade de fase para um valor baixo (10 mM / seg), de modo a força de arrasto do fluido não excede a armadilha ópticaforça ping. </li></ol> 5. Mova a posição Armadilha com relação ao ponto Dissector Laser e Axon Posição holograma gerado por computador, e calibrar a rigidez pinças ópticas <ol><li> Mova o talão para o suporte de vidro para visualizar o axônio. O talão é mantida acima da célula a fim de evitar o contacto com ela (cerca de 5 um por cima do suporte de vidro). </li><li> Mover a fase de microscópio para mover o foco pontual UV no centro da largura do axónio. Salvar a posição atual estágio. </li><li> Mova a posição do ponto de foco IR por holograma gerado por computador. Neste passo, a fase é interrompida na posição escolhida na etapa anterior. Quando o computador holograma gerado é projectada no SLM, o talão prendido é movido com respeito ao axónio. Nós mover o ponto de laser de infravermelho para ter o talão prendido alinhado no centro da neurite, com o ponto de laser UV centrado no mesmo neurites também. A mancha de IR e, assim, o talão prendido estão posicionados ao longo do neurites5-10 mM de distância do local UV. Passamos a posição do IR em relação ao local de UV dependendo da geometria de neurites. No caso das pinças ópticas não estão equipados com um sistema SLM, a posição pode ser variada por espelhos basculantes, ou deflectores acústicos óptica, no percurso óptico de IR. O ponto de laser de IV pode ser posicionada de 5-10 mM de distância a partir do ponto de UV para evitar a interacção do feixe óptico de dissecação com a sonda presa, o que poderia influenciar o seu movimento Browniano e alterar os vestígios de espectroscopia de força. </li><li> Depois de definir a nova posição IV local no que diz respeito à posição do ponto de UV e axónio, mover a etapa de posicionar o talão prendido longe do axónio e evitar a colisão com ele. Mover a posição axial do rebordo preso a cerca de 2 m acima do vidro de cobertura. </li><li> Alinhe o QPD ao centro das franjas de interferência sobre ele: sinais diferenciais y QPD x e são zeros quando o QPD está centrada. Adquirir 5 seg do movimento browniano de o talão prendido pela interferometro, a 50 kHz taxa de amostragem. Obter a rigidez (pN / nm) e a sensibilidade (V / nm) da armadilha óptica pelo método de espectro de potência 18. </li></ol> 6. Anexar o talão para o axônio. Realizar medição de força axotomia e simultânea <ol><li> Elevar a posição cordão preso cerca de 4 mm acima da tampa de vidro, e movê-lo para a posição palco salvo anteriormente (veja o passo 3.2). </li><li> Mova a pérola presa em direção ao axônio até tocar no neurite. A colisão entre o talão prendido e do axónio é controlada pelo sinal de detecção de deslocamento z QPD do rebordo preso na direcção axial. </li><li> Espere 10 segundos com o talão prendido empurrado contra o axónio para favorecer a adesão do material para a membrana de neurites. </li><li> Mover a fase de micro para deslocar o rebordo preso a partir do axónio, e, portanto, verificar a sua adesão à membrana celular. Se o cordão aderido, ele escapa da armadilha óptica. </li><li> Afaste-se da armadilha de laser sobre o cordão aderidoe ligar o circuito força-clamp com a condição força igual a zero. Em tal forma, as fases de piezo reposiciona o grânulo, ligados à célula, no centro da armadilha óptica. Se o sistema não tiver um ciclo de realimentação de controlo, a posição da armadilha de laser pode ser movido por platina do microscópio para centrá-la sobre a sonda aderido. O centro da armadilha é alcançada quando os sinais QPD são os mesmos que quando o rebordo está preso e não aderiram à célula (sinais QPD y igual a zero e x, e o sinal QPD Z dá o mesmo valor de voltagem dos quatro quadrantes como quando o cordão é presa longe de qualquer superfície). </li><li> Definir um estado de força de fixação sobre o eixo z, posicionando o laser aprisionamento ligeiramente ao longo do centro do cordão (cerca de 100 nm), para gerar uma pretensão na sonda presa aderido. No caso de o sistema não está equipado com um controlo de força da braçadeira, a posição armadilha óptica pode ser levantado em passos de 25 nm, por a fase de microscópio. O sinal QPD z permite o monitoramento. Portanto, use this um sinal para ajustar a posição da armadilha de laser em relação à sonda aderido. Tal pré-tensão é necessária para detectar a tensão sobre a membrana após a lesão axonal e a consequente diminuição do movimento browniano de sonda aderido. Uma abordagem semelhante tem sido proposto para medir a libertação da tensão na membrana através de um tirante de vídeo de imagem 19. </li><li> Switch-off o force feedback-clamp para medir a força na sonda aderido na condição posição-clamp (a fase piezo é bloqueado). </li><li> Iniciar a gravação simultânea das posições de sonda presos através do interferômetro (20 frequência de amostragem KHz), e as células durante axotomia lapso de tempo de imagem de campo claro do laser (20 Hz taxa de quadros). </li><li> Ligue o laser UV para entregar pulsos de laser até que uma lesão se torna visível na imagem do axônio (geralmente 200-400 pulsos ópticos são necessários energia por pulso: 25. NJ), em seguida, desligue o laser UV. </li><li> Continuar a gravação do interferômetro para cerca de 3 kmN, até que a x, y e z QPD vestígios atingir um patamar. </li></ol> 7. Quantificar a liberação total Tension <ol><li> Converter os vestígios QPD gravados (em volts) pela sensibilidade calibrada da armadilha óptica, para se obter os respectivos vestígios em nanómetros. </li><li> Filtrar a x, y, z e vestígios de deslocamento por um filtro passa alto com corte de 10 Hz. </li><li> Calcule a variância total dos traços filtrados representando o movimento browniano do cordão preso. Calcular a variância em 25 mseg passos para as janelas de tempo de 500 ms (10.000 pontos de dados) 20 sobrepostos. A filtragem passa-alto de vestígios exclui as variações de movimento Browniano, devido à flutuação ou movimento da membrana cortical actina. O movimento Browniano do cordão é reduzida pelas forças ópticas e as forças de aderência sobre a membrana celular. Quando a membrana é esticada devido à libertação de tensões a sua viscosidade aumenta, e, assim, o movimento browniano dos grânulo, detectado imediatamentediatamente após axotomia, começa a diminuir. </li><li> Definir t0: o início de diminuição da variação do movimento Browniano, depois do fornecimento de energia laser de UV. O instante de tempo t0 indica o início da deformação da membrana. </li><li> Definir t1: o fim da redução da variação do movimento Browniano (quando se atinge um planalto). O instante de tempo t1 indica o fim da estirpe membrana. </li><li> Realizar monitoramento de vídeo de detritos ou um arranhão com o apoio tampa de vidro, para medir qualquer desvio da amostra durante a medição de força. Para acompanhar a partícula com o apoio de vidro, nós aplicamos primeiro limiares para as imagens de campo claro, para obter uma pilha de imagens binárias com a partícula em branco sobre um fundo preto. Então, vamos acompanhar o centro de massa da partícula com precisão sub-pixel (utilizando o software ImageJ freeware). </li><li> Subtrair o desvio medido a partir de vestígios QPD deslocamento. Multiplique os traços QPD deriva corrigidos pela respectiva rigidez óptica calibrado (k x, k <sub&gt; y, z k) para obter os Fx, Fy, Fz traços em piconewtons. </li><li> Calcule o traço força total, como F tot = √ (Fx ​​2 + 2 + Fy Fz 2). </li><li> Calcule a liberação total da força entre T0 e T1 como F liberado = F tot (t1) - F tot (t0). A força medida em t0 tem que ser subtraídos, porque é devido ao deslocamento da sonda a partir o centro da armadilha, quando adere ao grânulo de neurites. </li><li> Calcule a área de contato entre a neurite cordão preso ea posição UV ponto de laser: na medida imagem de campo claro as longas (L) e curto eixos (D) da neurite entre o talão preso ea posição UV local laser. A área de contato do axônio é um axônio = L x D. </li><li> Normalizar o total liberado força F lançado pela área de contato do axônio A axônio. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Apresentamos neste trabalho um método quantitativo para comparar a adesão neurite ao substrato da cultura, através da realização de medidas de espectroscopia de força simultânea durante a laser lesão celular induzida. A libertação da tensão medida está relacionada com o grau de adesão das células ao substrato: as células com maior número de adesões focais devem libertar menos tensão. Medição da libertação da tensão em termos de piconewtons fornece uma grandeza física pelo qual se avalia a aderên...

A microscopia óptica é um dos sistema de imagiologia menos invasivas disponíveis para observar as células vivas. Com a exploração de efeitos, tais como pressão de radiação (como pinças ópticas 1), ou fluxo de fótons de alta energia (como a laser dissecador 2), esta tecnologia foi estendida para nano-manipulação. O sistema de imageamento óptico fornece um controle preciso para visualizar e manipular alvos celulares sub 3. Ao mesmo tempo, graças à calibração precisa da potência do laser emitido, instrumentos ópticos de realizar qualquer manipulação da amostra mole ou invasiva, com reprodutibilidade precedentes. Vários laboratórios integrados, na mesma configuração experimental, pinças ópticas e dissecador laser para ablação organelas 4, para se fundem células diferentes 5, ou para estimular as células de cargas opticamente impulsionado 6,7. Enquanto as pinças ópticas, depois da calibração da rigidez óptico, para permitiro controlo da força aplicada à célula numa escala piconewton, sistemas laser de dissecação pode modular manipulação óptica, que varia de membrana de formação de poros para foto-ablação de organelos individuais ou dissecação das estruturas sub-celulares. No entanto, a calibração de dissecção de laser baseia-se na avaliação qualitativa da entidade de manipulação óptica no que diz respeito à energia entregue à amostra, com base, principalmente, na análise de imagem que ilustra as alterações morfológicas causados ​​à amostra 8. No método apresentado, é mostrado como para executar a medição de espectroscopia de força durante a dissecção axonal de laser de um neurónio em desenvolvimento, para quantificar, na escala piconewton, a força produzida por uma alteração do equilíbrio da estrutura de citoesqueleto um compartimento subcelular 9. Neurónios cultivados aderir ao substrato e, durante o desenvolvimento polarizar. A fase de polarização ocorre durante os primeiros cinco dias in vitro. Na fase dois de polarização, um dos EXTRUDing neurites se torna mais longo, e que irá diferenciar para se tornar o axónio 10. Alongamento axonal em resposta a uma força de tracção no cone de crescimento tem sido modelada pelo modelo de Dennerl 11. Recentemente, este modelo tem sido alargado para 12 incluem o papel da adesão de neurites para os substratos de matriz extracelular. Este modelo biofísico, proposto após as observações experimentais 13, mostrou que as forças de puxar no cone de crescimento, propagação ao longo da neurite, são modulados por adesões focais ao substrato. Da mesma forma, a lesão axonal produz uma liberação local de tensão propagando em direção ao corpo celular. Assim, propôs que a medição tal tensão lançado em um local ao longo do axônio entre a lesão ea soma celular oferece a possibilidade de avaliar o resultado de amortecimento de adesões focais não afetadas. Nós calibrar a energia necessária fotões fluxo do dissector laser para controlar a extensão da DAMAG axonal infligidae, a partir de transecção completa a lesão parcial. Após a calibração, repetiu-se a lesão parcial dos axónios de vários neurónios diferenciados e o protocolo desenvolvido para quantificar a libertação da tensão, e assim obtido um parâmetro quantitativo para estimar a aderência do axónio para o substrato 14. No presente trabalho, nós descrevemos em pormenor o protocolo desenvolvido, o que representa um procedimento experimental preciso para avaliar e comparar com sensibilidade piconewton axonal a adesão ao substrato, em condições experimentais diferentes, tais como o tratamento de substâncias químicas 14, ou diferentes tipos de suporte de cultura celular.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer microspheres, &Oslash; 4 &mu;m, COOH coated</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>PC05N/6700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyLink Protein Coupling Kit</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>19539</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR laser</td>
			<td>IPG Laser GmbH</td>
			<td>YLM-5-SC-LP</td>
			<td>ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatial light modulator</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>LCOS-SLM 10468-07</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-tweezers software</td>
			<td>Optics group, University of Glasgow</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/" target="_blank">http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/ </a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPD</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S5980 with C5460SPL 6041 board</td>
			<td>Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD</td>
			<td>Teem Photonics</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Photodiode to measure z trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano-Pulse UV laser</td>
			<td>AA-optoelctronics</td>
			<td>PNV-001525-040</td>
			<td>Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acoustic Optic Modulator</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>V887ECSUVB EMCCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier device</td>
			<td>Physic Instruments</td>
			<td>QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage: micro+piezo stage</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NI PCI-6229</td>
			<td>Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of tension release during laser induced axon lesion to evaluate axonal adhesion to the substrate at piconewton and millisecond resolution

A formação de ligações funcionais em uma rede neuronal em desenvolvimento seja influenciado por sinais extrínsecos. O crescimento de neurite de neurônios em desenvolvimento está sujeita a sinais químicos e mecânicos, e os mecanismos pelos quais ele sente e responde a sinais mecânicos são mal compreendidos. A elucidação do papel das forças na maturação das células irá permitir a concepção de andaimes que pode promover a adesão celular e o acoplamento do citoesqueleto ao substrato, e, por conseguinte, melhorar a capacidade de diferentes tipos neuronais para regenerar após uma lesão. Aqui, nós descrevemos um método para aplicar medidas de espectroscopia de força simultâneos durante a laser lesão celular induzida. Medimos liberar a tensão no axônio parcialmente lesada por rastreamento interferométrico simultânea de uma sonda ótica preso aderido à membrana do axônio. Nosso protocolo experimental detecta a liberar a tensão com a sensibilidade piconewton, ea dinâmica da liberação de tensão noresolução de tempo de milissegundos. Por isso, oferece um método de alta resolução para estudar como o acoplamento mecânico entre as células e os substratos podem ser moduladas por tratamento farmacológico e / ou propriedades mecânicas distintas do substracto.

A célula gera forças de tração sobre o substrato por suas adesões focais. Força gerada pelos elementos do citoesqueleto estão em equilíbrio com a força contrária do substrato de cultura. Após a lesão do laser de neurites induzido, alguns dos cabos do citoesqueleto tensos são rompidas e sua tensão equilibrada é libertado porque a força contrária do substrato de adesão é eliminada. A tensão libertado é parcialmente distribuído nas adesões focais não afectadas, e o cordão ligado à membrana celular...

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Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Medimos a libertação da tensão num axónio que foi parcialmente lesionada com um dissecador de laser através da medição simultânea de espectroscopia de força realizado em uma sonda opticamente preso aderida à membrana do axónio. O protocolo experimental desenvolvido avalia a aderência do axónio para o substrato de cultura.

Medição da tensão Lançamento Durante Laser Induced Axon lesão axonal Avaliar Adesão ao substrato em piconewton e resolução de milissegundos

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

measurement-tension-release-during-laser-induced-axon-lesion-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K visualizações.  National Research Council of Italy. Medimos a libertação da tensão num axónio que foi parcialmente lesionada com um dissecador de laser através da medição simultânea de espectroscopia de força realizado em uma sonda opticamente preso aderida à membrana do axónio. O protocolo experimental desenvolvido avalia a aderência do axónio para o substrato de cultura.

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Bioengenharia

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

Construção de um baixo orçamento Laser Sistema axotomia para estudar a regeneração do axônio em C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

Aspiração micropipeta de Células-substrato anexados para Estimar Rigidez celular

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Usando impedância Cell-substrato e imagens de células vivas para medir as mudanças em tempo real no celular Adesão e De-adesão Induzidas por Matrix Modificação

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Detecção de Exosomal Biomarker por induzida pelo campo elétrico de lançamento e Mensuração (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and adverse effects1,2,3,4,5,6,7. However, several challenges remain before these treatments can be applied more widely. The development and validation of intraductal therapeutics in an appropriate animal model facilitate the development of intraductal therapeutic strategies for patients. While the mouse mammary gland has been widely used as a model system of mammary development and tumorigenesis, the anatomy is distinct from the human gland. A larger animal model, such as the rabbit, may serve as a better model for mammary gland structure and intraductal therapeutic development. In contrast to mice, in which ten ductal trees are spatially distributed along the body axis, each terminating in a separate teat, the rabbit mammary gland more closely resembles the human gland, with multiple overlapping ductal systems that exit through separate openings in one teat. Here, we present minimally invasive methods for the delivery of reagents directly into the rabbit mammary duct and for visualization of the delivery itself with high-resolution ultrasound imaging.

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

Entrega Intraductal ao Coelho glândula mamária

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Análise mecânica dinâmica ambiental para prever o comportamento de amaciamento de implantes neurais

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many cell functions and behaviors. To calibrate and image integrin tension with high force sensitivity and spatial resolution, we developed an integrative tension sensor (ITS), a DNA-based fluorescent tension sensor. The ITS is activated to fluoresce if sustaining a molecular tension, thus converting force to fluorescent signal at the molecular level. The tension threshold for ITS activation is tunable in the range of 10&#8211;60 pN that well covers the dynamic range of integrin tension in cells. On a substrate grafted with an ITS, the integrin tension of adherent cells is visualized by fluorescence and imaged at submicron resolution. The ITS is also compatible with cell structural imaging in both live cells and fixed cells. The ITS has been successfully applied to the study of platelet contraction and cell migration. This paper details the procedure for the synthesis and application of the ITS in the study of integrin-transmitted cellular force.

Integrin tension plays important roles in various cell functions. With an integrative tension sensor, integrin tension is calibrated with picoNewton (pN) sensitivity and imaged at submicron resolution.

Imagem latente integrina tensão e força celular com resolução de Submicron com um Sensor de tensão Integrativa

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

Sondas de Tensão de DNA para Mapear as Forças Transitórias do Receptor de Piconewton por Células Imunes

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...