이 작품은 주로 1-R21-ES019498 및 R44-ES021116에서 일부 지원 5-U01 ~-ES016045에 의해 지원되었다. DMW는 환경 독성 T32-ES007020의 NIEHS 교육 그랜트에 의해 지원되었다. 장비는 환경 건강 과학 P30-ES002109 센터에 의해 제공되었다.

칩의 1 준비 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 아래로 한 웰 직사각형 플레이트, 겔 필름 측에 패키지와 장소에서 칩 젤을 제거합니다. </li><li> 두 번 반복, 15 분 동안 PBS 1X 25 ㎖에 젤을 씻으십시오. </li><li> 유리 접시 이에 따라 겔의 라벨 방향에 설정 젤. </li><li> 부드럽게 젤 위에 거꾸로 바닥이 96 웰 플레이트를 누르십시오; 바닥이 아니라 판의 모든 우물이 젤의 영역 내에 있는지 확인하십시오. </li><li> 유리 클램프를 고정하는 플레이트의 각 측면에 1.5 &#39;&#39;바인더 클립을 사용합니다. </li><li> 과량의 PBS 대기음 각 웰에 버퍼. </li></ol> 2로드 셀 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 세포 현탁액을 준비합니다 : <ol><li> 현탁 세포주, / ㎖ 5 10 -10 6 세포의 최종 농도를 얻기 위해 용지로의 세포 현탁액을 희석한다. </li><li> 자기편 세포주를 들어, 일반 착탈 / 트립신 프로토콜 및 D를 수행5 10 -10 6 세포 / ml의 최종 농도로 매질에서 분리 된 세포를 ilute. 세포가 응집하면, 단일 세포 현탁액을 수득 셀 필터에 세포 현탁액을 통과한다. </li></ol></li><li> 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100 ㎕를 추가한다. </li><li> 겔 필름과 커버 플레이트는 매체의 증발을 방지 할 수있다. </li><li> 세포가 37 ° C 배양기에서 적어도 30 분 동안로드 할 수 있습니다. </li><li> 각 우물에서 보육 및 흡인 미디어에서 칩을 제거합니다. </li><li> 바인더 클립과 바닥이 96 웰 플레이트를 제거; 각도로 유리 접시와 칩을 잡고 조심스럽게 아가 로스에 여분의 세포를 제거하는 1X PBS로 씻어. </li><li> 4 배 대물 렌즈와 밝은 필드 현미경을 사용하여 셀 로딩을 확인합니다. 불충분 로딩이 관찰되면, 단계 2.1로부터 반복한다. </li><li> 심지어 표면 (실험실 벤치)에로드 된 칩을 놓습니다. 이다 1 % 저 융점 (LMP) 아가로 오스와 오버레이 칩 37 ° C에서 사전은 따뜻하게. 약 사용 2̵일] LMP 아가 3 ㎖를 각각의 칩에 대해 필요하다. </li><li> 오버레이가 3 분 동안 실온에서 첫번째 공고히하고 완전한 겔화 5 분 동안 4 ° C 냉장고로 이동 할 수 있습니다. </li></ol> 3 분배 및 복구 참고 : 기본 DNA 손상 레벨을 공부 4 단계로 건너 뜁니다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 조심스럽게 새로운 바닥이 96 웰 플레이트의 우물로 (이전 클램핑에서 생성) 칩의 우물을 맞 춥니 다. 다시 키를 누릅니다 바인더 클립 상단과 안전한 클램핑에 바닥이 96 웰 플레이트. </li><li> 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 원하는 양의 화학 물질 100 ㎕을 추가; 얼음에 또는 시간의 원하는 금액을 4 ° C 냉장고에 투약 / 치료를 수행합니다. </li><li> 물론 각에서, 흡인 화학 물질을 투여하고 1X PBS를 사용하여 잔류 화학 물질을 멀리 씻어 후. 직접 피해가 여기에 공부하는 경우, 4 단계로 진행합니다. </li><li> 에서 복구하는 칩에 세포를 수리 동역학을 연구 허용하려면37 ° C에서 미디어. 를 Lyse 특정 시점에서 (4 단계로 진행). NOTE : 수리 부착 밑 96 웰 플레이트와 함께 온칩 (on-chip)으로 수행 될 수 있거나, 칩 밑 96 - 웰 플레이트의 제거 후 별도의 조각으로 절단 될 수있다. </li></ol> (4) 용해 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 알칼리 혜성 분석을 수행하려면 : <ol><li> 1 % 트리톤 X-100 용해 스톡 용액 (2.5 M의 NaCl, 100 mM의 EDTA 2 나트륨, 10 mM 트리스, pH가 10)를 첨가하여 알칼리성 알칼리 용해 완충액을 작동 확인. 각 칩에 대한 용해 버퍼 작업의 약 25 ML을 준비합니다. </li><li> 4 ° C에서 알칼리 용해 버퍼 작업 사전 진정. </li><li> 멋진 작업 알칼리 용해 버퍼 칩 잠수함 및 용해가 4 ° C 냉장고에서 O / N을 수행 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 중립 혜성 분석을 수행하려면 : <ol><li> 중립 용해 스톡 용액 (2.5 M의 NaCl, 100 mM의 EDTA 2 나트륨, 1 % (10)에 트리톤 X-100 및 10 %의 DMSO을 첨가하여 중성 용해 완충액을 작동 확인mM 트리스, 1 % N -Lauroylsarcosine, 산도 9.5). 각 칩에 대한 용해 버퍼를하면 약 25 ML을 준비합니다. </li><li> 43 ° C에서 중립 용해 버퍼 작업 전 따뜻한. </li><li> 따뜻한 작업 중립 용해 버퍼 칩 잠수함 및 용해가 43 ° C 배양기에서 O / N을 수행 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> (5) 전기 영동 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 알칼리 혜성 분석을 수행하려면 : <ol><li> 1X PBS로 칩을 씻어 신속하게 용해 버퍼를 제거하고. </li><li> 겔 필름 측이 양면 테이프를 이용하여 아래로 향하게하여 전기 영동 챔버 내의 보안 칩. </li><li> 4 ° C 차가운 방에 챔버를 가져와. </li><li> 그냥 젤을 커버하는 수준으로 차가운 알칼리 전기 영동 버퍼 (0.3 M의 NaOH, 1 ㎜ 나 2 EDTA)와 챔버를 입력합니다. </li><li> 40 분 동안 알칼리 풀기 허용합니다. </li><li> 1 V / cm와 차가운 방에서 30 분 동안 300mA에서 전기를 실행합니다. 차에 전기 영동 버퍼의 볼륨을 조절합니다바람직한 실행을 달성하기 위해 현재 mber. </li></ol></li><li> 중립 혜성 분석을 수행하려면 : <ol><li> 용해 버퍼를 제거하고 2 × 15 분에서 4 ° C에서 중립 전기 영동 버퍼 (2 밀리미터 나 2 EDTA, 90 mM 트리스, 90 mM의 붕산, 산도 8.5)와 칩을 씻어. </li><li> 겔 필름 측이 양면 테이프를 이용하여 아래로 향하게하여 전기 영동 챔버 내의 보안 칩. </li><li> 4 ° C 차가운 방에 챔버를 가져와. </li><li> 그냥 젤을 커버하는 수준으로 차가운 중립 전기 영동 버퍼 챔버 (2 밀리미터 나 2 EDTA, 90 mM 트리스, 90 mM의 붕산, 산도 8.5)을 입력합니다. </li><li> 겔은 60 분 동안 차가운 방에 앉아 할 수 있습니다. </li><li> 0.6 V / cm에서 전기를 실행하고 차가운 방에서 60 분 동안 6mA. 원하는 주행 전류를 달성하기 위해 챔버 내에서 전기 영동 완충액의 볼륨을 조정한다. </li></ol></li></ol> 6 형광 이미징 <ol style="margin-left: 40px;"><li> COL에서 전기 챔버에서 칩을 제거D 룸. </li><li> 4 ° C 냉장고에서 2 × 15 분 동안 중화 버퍼 (0.4 M 트리스, 산도 7.5)에 젤을 중화. </li><li> 선택의 형광 DNA 얼룩 칩을 얼룩 (즉, SYBR 골드, 에티 디움 브로마이드) 공장에서이 절차를 권장합니다. 형광 현미경을 사용하여 이미지. </li></ol> 7 데이터 분석 같은 KOMET 5.5 표준 혜성 분석 소프트웨어에 의해 혜성 이미지를 분석합니다.

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+repair+capacity+in+human+populations.">A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations.</a> Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).</li><li>Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+individual+sensitivity+to+ionizing+radiation+and+DNA+repair+efficiency+in+a+healthy+population.">Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population.</a> Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).</li></ol>

The CometChip has been licensed to Trevigen, Inc. based upon a patent submission that includes Wood, Weingeist, Bhatia and Engelward.

환경과 같은 인간 세포 내에서 유비쿼터스 genotoxins 불가피 응력 세포 DNA에 손상을 가하지. 사실,이 정상 상태 (18)에서 인간의 세포에 존재하는 DNA 병변 1,000 개 존재하는 것이 추정되었다. 인간의 손상 감수성 및 수리 역학을 이해하는 것은뿐만 아니라 기초 연구에 대한 통찰력을 제공 할뿐만 아니라 신약 개발의 도움을받습니다. 아이러니하게도, 암을 촉진하는 DNA 손상의 능력에도 불구하고, DNA 손상 제는 암을 치료 DNA 손상에 관한 지식을 개인화 의학 관련 복구하기 위해 매우 높은 수준으로 사용된다. CometChip은 오랫동안 존재 DNA 손상 분석 혁명을 미세 가공 방법을 이용하여 신규 연구 장치이다. 기존의 혜성 분석의 동일한 원칙을 바탕으로,이 칩은 훨씬 더 높은 처리량과 더 나은 재현성을 제공합니다. 우리는 여기에서이 칩을 사용하는 방법을 설명합니다. 그 유틸리티와 견고성을 명확히하기 위해, 우리는 이리저리 결과를 보여m 칩은 여러 다른 DNA 손상 제에 의해 유도 된 손상을 평가하는 데 사용되었으며,이 DNA 복구를 평가하는 곳에 사용 된 여러 실험. 함께 여기에 제시된 결과는 칩 사용에 대한 유용한 정보를 제공하고, DNA 손상 및 수리에 대한 연구에 광범위한 적용 가능성을 보여줍니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 셀 로딩 효과를 달성하는 것이다. 많은 세포주는 서스펜션과 부착 세포를 모두 포함하여이 시스템에서 테스트되었습니다. 효율성을로드하면 휴대 타입, 셀 크기, 로딩 농도와 시간과 같은 많은 변수에 따라 달라집니다. 같은 림프 세포와 같은 서스펜션 세포주 작업하기 가장 쉬운입니다. 세포 현탁액의 농도는 96 - 웰 당 4월 10일에서 6월 10일까지 셀마다 다를 수 있고, 로딩은 대개 15-30 분에서 완료된다. 더 높은 세포 밀도는 로딩을 용이하게하고 마이크로 웰에 세포 정착에 필요한 시간을 단축. 부착 세포에 대한로드 매개 변수 서스펜션 세포 다를 수 있습니다. 중국어 햄스터 난소 (CHO) 세포와 같은 세포주는 현탁 세포와 유사한 적재 효율 (다음 트립신)을 가지며, 따라서 유사한 하중 조건을 사용하여 발견되었다. 이러한 쉽게 현탁 세포 집합체를 형성하는 종양 세포와 같은 다른 세포 유형은, 추가 처리를 필요로한다. 현탁액 매체 트립신 단세포 필터를 통해 세포 현탁액을 전달하고로드하는 동안 첨가하여 셀 클러스터의 형성을 억제 할 수있다. 마지막으로, 로딩 시간의 관점에서, 시간은 20 분에서 1 시간으로 변할 수 마이크로 웰에 부착 세포주 캡처 필요한. 그 결과, 사용자가 추가 조사를 진행하기 전에 최적의 적재 상태를 결정하기 위해 파일럿 실험을 수행하는 것이 권장된다. 로딩 효능 DAPI 또는 다른 DNA와 캡슐화 세포를 염색하여보다 정확하게 밝혀 시야 현미경 또는 가시화 될 수있다형광 현미경으로 평가 이전에 얼룩. 이 방법 및 칩의 하나의 주요 장점은 다양성이다. 먼저, 셀이 과잉 씻겨 때문에 연구자들은 특정 작업 세포 농도에 한정되지 않고, 균일 한 마이크로 어레이는 혜성 밀도를 보장한다. 둘째, 마이크로 웰은 크기가 다른 세포 유형을 수용하도록 크기를 가변으로 할 수있다. 복수의 셀이 하나의 마이크로 웰에서 캡처되는 경우에도, 다중 셀 혜성 자기 교정 수율 일관된 결과는 단일 세포 혜성 6,7 비교된다. 마이크로 어레이의 셀을 패터닝하는 또 다른 이점은 모든 혜성 혜성 인해 산만에 노이즈를 감소시키고 자동화 영상 분석을 용이하게하고, 고정 된 위치와 동일한 초점 평면에서 다음 점이다. CometChip에서 제공하는 처리량과 감도가 크게 향상은 대규모 연구 분석의 응용 프로그램을 수 있습니다. 이와 함께, 칩 제공연구원, 독성 학자, 임상 및 역학에 대한 DNA 손상 평가를위한 SA 유용한 도구. 혜성 분석법은 DNA 손상의 광범위한 검출에 우수한 감도 알려져 있지만,이 분석은 또한 낮은 특이성에서 겪고있다. 이 프로토콜을 사용하면 크게 분석의 재현성 및 처리량을 향상 시키지만, 특이도에서 발전을 보여주지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 다른 방법으로 분석이 더 높은 특이성을 달성하는데 효과적인 것으로보고되었다 다중화. 하나의 예는 정제 병변 특정 효소의 포함이다. 이 효소는 검출 가닥 나누기 및 abasic 사이트 1,19-21로, 그렇지 않으면 발견 할 수없는 기본 병변을 변환 할 수 있습니다. 널리 사용되는 예는 산화 DNA 수정 19, 22를 보여 수리 효소 formamidopyrimidine-DNA의 glycosylase (FPG)입니다. 효소 분해 단계는 세포 용해 후에 적용되기 때문에, 시스템은 동일한 방식으로 처리 될 수있다프로토콜 변경없이 사 전통 아가로 오스 슬라이드. 상세한 프로토콜은 여기에 설명되지는 않지만,이 방법은 과거 많은 전통적인 혜성 분석 사용자가 적응 한 내용 및 프로토콜을 용이하게 찾을 수있다. 이전 책에서, 우리는 형광등에 의한 손상 (22)를 식별하기 위해이 방법을 사용했다. 이 방법의 주요 이점은 이전에 사실상 불가능했던 연구의 문을 여는 것이 제공 처리량이다. 동일 플랫폼 (96)의 샘플을 처리 할 수​​있는 능력뿐만 아니라 노동력과 시간을 줄일뿐만 아니라, 소음을 감소 실험 크게 재현성을 향상시킨다. 간 샘플 변동이 칩 6,7 관찰 편차보다 2 배 더 높을 수있는 전통적인 슬라이드 대 슬라이드 편차,보다 상당히 낮다. 소음 감소는 샘플 간의 미묘한 차이를 검출 할 수 있도록, 향상된 민감도를 이끈다. 장치는 이동 단말기를 채용하므로ndard 96 - 웰 포맷으로, 그것은 일반적인 연구 장비와 호환 및 기술 HTS. 평균 연구원 ~ 수일에 걸쳐 유리 슬라이드 (30)를 처리 할 수​​ 있다고 가정하면, 샘플 (100)의 평가를 필요로하는 연구를 고려한다. 각 샘플은 세중 수행 할 필요가 있음을 감안할 때, 그것은 또한 필연적으로 변화를 샘플링 할 샘플에서 고통을 것 같은 연구를 완료하는 데 1 개월 정도 걸릴 것이다. 대조적으로,이 칩 (100)의 처리 조건, 삼중의 각각은 몇 판을 필요 사흘 수행 될 수있다. 처리량이 주요 개선은 이전에는 불가능했다 연구에 문을 엽니 다. 여기에 제시된 프로토콜은 표준 혜성 분석을 수행하기위한 기본 절차와 CometChip 플랫폼을 사용하는 데 필요한 단계를 모두 변경됨을 설명한다. 고유의 DNA 손상 수준 및 후속 보수 응답 모두를 측정 할 수있는 능력으로, 분석은 고도로 관련된생물학적, 임상 다양한 응용 프로그램. 게놈의 특정 화학 물질 노출의 영향에 대한 정보는 질병 예방과 치료를 용이하게한다. 또, DNA의 손상 감도 및 개인 23,24 중 수리 능력의 변화를 결정하는데 상당한 관심도있다. 이 기술은 이러한 대규모 연구에 필요한 처리량을 제공한다. 개인간 차이에 관한 지식 예민한 사람들을 식별 및 개별 치료법 또는 preventions 전략을 설계하는데 중요하다. 여기에 제시된 기술은 가까운 미래에 표준 방법론이 될 가능성을 가지고 높은 처리량, 객관적이고 정량적 DNA 손상 분석 플랫폼을 제공하고, 종합적.

단일 세포 겔 전기 영동 (혜성 분석 일명) (SCGE) 분석은 기본 병변, abasic 사이트, 한 가닥 나누기, 이중 가닥 나누기, 가교 민감한 알칼리를 포함하여 DNA 병변의 광범위한 스펙트럼의 정량 널리 사용되는 기술이다 사이트. 분석의 기본 원리는 손상된 DNA가 손상되지 않은 DNA 이상으로 인해 분열과 superhelical 구조의 손실을 더 쉽게 마이그레이션 것입니다. 이동의 범위는 DNA 손상의 양에 비례하고, 형광 현미경을 이용하여 가시화 할 수있다. 이미지 캡처 및 개별 혜성 형 DNA의 강도 프로파일 분석은 세포 1-4 내 DNA 손상의 레벨을 나타 내기 위해 꼬리 같은 꼬리 길이, 꼬리 모멘트와 % DNA와 같은 파라미터 측정을 제공한다. ) 알칼리 혜성 분석 및 b)는 중립 혜성 분석 : 현재 혜성 분석의 널리 사용되는 두 가지 버전이 있습니다. 알칼리 혜성 분석은 가장 널리이며따라서 전기 영동 전에 DNA를 긴장을 높은 pH 버퍼를 사용하고 사용 된 버전은, 스트랜드 나누기 및 알칼리 성 사이트의 모든 유형을 검출한다. 이 이중 나선을 유지하고 오직 이중 가닥 나누기 2,5 검출 중성 버퍼를 사용하고 있기 때문에 중성 혜성 분석은, 다른 한편으로는, 이하 실행된다. DSBs을 유도하는 화학 물질 및 물리적 인자의 경우, SSBs가 콘서트에서 생성되고, 훨씬 더 높은 수준에서 형성된다 (예를 들어, γIR 유도 SSBs은 DSBs보다 일반적인 크기 순서입니다). 대부분의 DNA 손상 노출의 경우, DSBs 훨씬 덜 자주 DNA 손상의 다른 클래스보다, 따라서 감지하기 어렵습니다. 우리는 이전의 공보에 두 버전의 검출 창을 증명하고있다. 6,7 혜성 분석 일상적 DNA 손상과 수리 및 유전 독성 시험 1,2,8-15에 대한 기초 연구를 위해 사용되었지만, 분석 인해 시료 대에 재현성이 나쁨을 갖는보고되었다샘플, 개인 대 개인 및 실험실 사이 변화. 이미지 수집 및 데이터 분석이 힘들고 때문에 또한, 분석은 낮은 처리량 부분이다. 함께, 이러한 제한은 대규모 연구에서 비교적 낮은 수용에 기여한다. 엔지니어링 기술과 원리의 통합을 통해 CometChip 전통적인 혜성 분석 6,7과 관련된 처리의 문제와 모순에 대한 해결책을 제공합니다. 요약하면, 칩을 만드는 데, 주형은 하나의 셀만큼 작은 직경 microposts을 만드는 포토 리소그래피를 이용한 마이크로 제조된다. 몰드이어서 겔 응고 후의 마이크로 웰 어레이 결과 용융 아가 로즈에 도장하는데 사용된다. 칩은 서로 다른 세포 유형과 호환 가변 크기의 우물 연구자를 제공하기 위해 개발되고있다. 칩을로드하려면, 미디어 세포가 중력에 의해 우물에 정착 할 수있다; 여분의 세포를 씻어됩니다. 포획 된 세포는 우리를 캡슐화저 융점 아가로 오스의 얇은 층을 보내고, 및 바닥이 96 웰 플레이트이어서 그 바닥 표면에 마이크로 웰 수백 96 macrowells 각을 만드는 겔 표면에 클램프한다. 이 프로토콜은 겔 준비, 셀 로딩, 투약 및 수리, 세포 용해, 전기, 형광 이미징을 포함이 칩 실험에 대한 일반적인 절차에 대해 설명합니다. 우리는 알칼리 각각 분석의 중립 버전을 사용하여, 공지 된 DNA 손상 제에 노출 lymphoblast 세포와 투여 량 반응 실험의 두 가지 예를 보여준다. 두 수리 실험은 또한 보수 반응 후 노광 시스템을 사용하여 평가 될 수있는 방법을 설명하기 위해 도시된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">UltraPure LMP Agarose (low melting point)</td>
			<td style="width:129px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16520</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td style="width:129px;">Gibco by life technologies</td>
			<td style="width:101px;">14190</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7581-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Na2EDTA</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">4931-04</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (base)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (acid)</td>
			<td style="width:129px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:101px;">4106</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline N-lauroylsarcosine</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L9150</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">X100</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D4540</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaOH</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7708-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">BDH3871</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline boric acid</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B6768</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Equipments</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">CometChip</td>
			<td style="width:129px;">Trevigen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1-well dish</td>
			<td style="width:129px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:101px;">73521-420</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bottomless 96-wel plate</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">655000-06</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5&#8243; binder clips</td>
			<td style="width:129px;">Staples</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass plate</td>
			<td style="width:129px;">Tag Hardware</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Customized to size of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Owl Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">27372-131</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:101px;">164-5050</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cometchip: a high-throughput 96-well platform for measuring dna damage in microarrayed human cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

이 첫 번째 예에서, 우리는 H 2 O 2를 사용하는 산화 적 손상에 노출 된 후 인간의 임파 세포에서 DNA 손상의 초기 레벨을 정량화하기위한 방법을 설명한다. H 2 O이 유도 된 기본 병변 및 단일 가닥 나누기를 평가하기 위해, 알칼리 혜성 조건이 사용됩니다. 로딩이 완료되고 세포가 아가 로스 오버레이로 캡슐화 한 후, 바닥이 96 - 웰 플레이트는 96 칩의 구획을 작성하는 표면 상에 가압된다. 웰 96는 각각 상이한 화학 물질의 종류 나 농도로 투여 될 수있다. 여기서 H 2 O (2)의 네 개의 다른 투여 량을 사용하고, 1X PBS가 음성 대조군으로 사용 하였다. 배열 혜성의 대표 이미지는 처리하지 않은 그림 1A, (위), 50 μM (가운데) 및 100 μM (아래) H 2 O 2 -exposed 샘플 혜성 꼬리의 서로 다른 수준의 입증에 표시됩니다. 혜성 이미지 분석 될 수 perfor일반적으로 각 혜성 꼬리 전체 형광 강도 및 이동 거리에 따라 손상 수준을 정량화하는 상용 소프트웨어를 사용 메드. 측정은 일반적으로 계산된다 50-100 조건 당 혜성 및 중간치 (하나 % 테일 DNA 또는 꼬리 길이)에서 수행된다.도 1b는 H의 네 개의 다른 농도에 노출 TK6 임파 세포 혜성에서 분석 백분율 테일 DNA 응답 곡선을 도시 2 O 2. 독립적 인 실험 간의 일관성은 세포에서 화학 처리의 다양한 수준에서 DNA 손상 반응을 평가하는데이 접근법의 효능을 보여준다. (macrowells 중 예를 들어,)와 같은 실험의 반복 사이의 샘플들 사이의 변화에 대한 자세한 내용은, 간 샘플 간 실험 변동성은 각각도 2a와 2b에 그려졌다. 96-w의 각 실험 내에서, 각 웰엘 칩은 다른 샘플에 해당하고, 따라서 잘 간 편차는 물론 장치의 샘플 간 편차를 보여준다. 여기서, 96 - 웰 칩의 12 웰에 넣은 TK6 세포를 H 2 O 2의 동일한 투여 량으로 처리하고, 처리 후 즉시 용해. 다른 모든 실험 단계를 병렬로 수행하고, 각 macrowell에서 최소 50 혜성의 중간 값은도 2a에 그려졌다. 표준 편차는 3.99 %로로 중간 값의 평균은 꼬리에 77.53 %의 DNA이다. 이 자료에서, 우리는 샘플 중 변동 계수는이 분석 6,16의 향상된 견고성을 보여주는 기존의 분석보다 배 낮은 여러 개의 5.2 %이라고 계산한다. 분석의 재현성에 대한 자세한 내용은, 우리는 75 μM의 H 2 O 2 칩에 TK6 세포를 노출과 DNA 손상의 직접적인 수준을 분석 할 수 있습니다. 이 실험은 각 실험의 여섯 배 데이터 F 플롯 하였다 반복 하였다igure 2B. 동일한 실험 조건에서, 우리는 그림의 회색 막대로 표시, 57.87 %로 41.76 %에 이르는 결과를 얻었다. 여섯 반복의 평균은 2.04 %의 평균의 표준 오차로, 49.57 %이다. 반복 중 낮은 변화는이 소설 장치에서 수행 혜성 분석은 재현성이 높은 것을 의미한다. 수리 역학을 평가하기 위해, 세포 치료 후 신선한 미디어에 자신의 DNA를 복구 할 수 있습니다. 다양한 시점에서 macrowells을 용균은 시간이 지남에 DNA 손상의 변화를 보여준다. 예는도 3에 도시된다.이 실험에서는 TK6 셀은 먼저 칩에 캡슐화 된 50 μM의 H 2 O 2 처리, 및 60 분간 노광 후까지 복구시켰다. 셀은 각각 0, 20, 45 및 60 분에서 용해시켰다. 상이한 시점에서 주제 혜성 이미지는도 3a에 도시되고, 시간이 지남에 따라 DNA 손상 수치의 변화도에 플롯(b). 이 데이터는 거의 모든 손상의 2 O 2 처리 45 분 후 H 내에서 수리 것으로 나타났습니다. 다양한 변수가 사용될 세포주 및 약제의 종류를 포함하여, 보수의 속도에 영향을 미칠 수있다. 따라서 연구자들은 프로토콜 (즉, 수리 시간을 연장하는 것은) 자신의 조사에서 추가 요구를 수용하기에 변경을 할 수 있습니다. 여기서 우리는 7 methylguanine 포함한베이스 병변을 유도하는 것으로 알려져 알킬화제를 TK6 세포를 다른 유전자 독성 제 N - 메틸 - N &#39;-Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG)와 도전 특징이 칩을 사용하여 수리 실험의 또 다른 예이다 제공 및 3 methyladenine. 이러한 병변은 자연 antibody에서는하거나 DNA의 glycosylases에 의해 효소를 제거하여 어느 사이트를 abasic로 변환됩니다. 얻어진 abasic 사이트는 알칼리성 조건 하에서 분해함으로써 칩에 검출 될 수있다. 초기 노출 긴로부터 명백 손상의 상당한 증가를 야기세포는 DNA 복구 동안 그대로 복원 같이 꼬리, 시간이 지남에 따라 이들과 꼬리가 감소된다. 알킬화 및 산화 적 손상은 주로 두 염기 절제 복구 경로에 의해 복구되지만, 생성 된 병변의 크기 및 복구에 관여하는 단백질은 다양하다. 이러한 변형은 위치뿐만 아니라, 얻어진 abasic 사이트 수리 상이한 요금을 abasic하는 변환 상이한 레이트로 이어질 수있다. 그림 4에서, TK6 세포의 수리 역학은 0.1, 1에 노출하고, MNNG의 3 ㎍ / ㎖의 표시됩니다. MNNG에 의한 손상이 더 이상 지속 나타나고 H 2 O 2 - 유도 손상에 비해 느린 속도로 삭제되기 때문에이 실험에서, 우리는 2 시간 후 - 노출 실험 시간을 연장했다. 중성 조건을 이용하여 분석 DSBs 알칼리 조건을 이용하여 단일 - 가닥 병변 분석 프로토콜과 매우 유사하다. 초기 손상 레벨을 표시하려면 TK6 세포 GIR의 변수에 노출되었다,<html> 얻어진 세포 용해 및 중성 pH (도 5a)에서 전기 영동 하였다. 그것은 혜성 꼬리의 형태가 알칼리 분석 조건 다르다는 것을 주목할 필요가있다. 이 분석을 이용하여 관찰 DNA 단편화를 달성하기 위해, 사용 된 IR 투여 량은 알칼리 조건을 사용하여 손상하는 데 필요한 용량보다 (0-100 Gy의) 상당히 높다. 또, 테일 길이가 중립 혜성 분석법 7 사용시 DNA 손상의 정도를 반영하는 가장 중요한 파라미터 인 것을 발견했다. 분석 된 투여 량 반응 곡선을도 5B에 도시되어있다. 세포에서 DNA 이중 가닥 나누기의 수리도 평가 될 수 있고, Weingeist 등으로 나타났다. 알. 7. 이와 함께, 중립 CometChip는 DNA DSBs의 높은 처리량 분석을위한 유용한 도구를 제공합니다. 1highres.jpg &quot;폭 =&quot;500 &quot;/&gt; 그림 1. H 2 O 2 량 알칼리 혜성 분석을 사용하여 TK6 세포의 반응. (A) 50 μM (가운데) 및 100 μM에 노출 치료 TK6의 lymphoblasts (위)와 TK6 세포 (아래) H 2 O 2에서 배열 된 마이크로 웰 혜성 4 ° C에서 20 분. 스케일 바는 100 μm의입니다. (B) H H 2 O (2)의 다양한 수준에 노출 TK6 셀 2 O 2 용량 반응. 각 데이터 포인트는 적어도 50 개인 혜성의 중앙값 백분율 테일 DNA는 각 실험에서 얻어진 3 개의 독립적 인 실험의 평균이다. 오차 막대는 3 개의 독립적 인 실험에서 평균의 표준 오차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 간 샘플 및 간 실험 가변성. (A) 샘플 간 차이. TK6 lymphoblast 인간 세포를 96 - 웰 칩의 웰 (12)에 로딩 하였다. 각 웰을 50 μM의 H 100 ㎕에 노출이 O이 4 ° C에서 20 분. 셀은 즉시 용해와 % 테일 DNA를 분석 하였다. 각 웰의 데이터는 여기에 표시됩니다. 각 상자에는 중간 각도에서 최소 50 개인 혜성을 나타냅니다. 12 웰의 평균 표준 편차는 3.99 %이며, 변동 계수는 5.2 %로 계산되고, 77.53 %이다. (B) 실험 대 실험 편차. TK6 인간의 lymphoblast 세포는 4 ° C에서 20 분 동안 75 μM의 H 2 O 2 100 ㎕에 노출, 96 - 웰 칩에로드. 셀은 즉시 용해와 % 테일 DNA를 분석 하였다.동일한 실험을 6 회 반복하고, 각각의 반복 된 데이터는 그레이 바대로 도시되어있다. 각 상자에는 각 반복에서 최소 100 개인 혜성의 중간 % 꼬리 DNA를 나타냅니다. 6 반복의 평균 여기서 다시 막대로서 도시, 49.57 %이다. 6 반복의 표준 편차는 4.99 %이며, 평균의 표준 오차는 도면 오차 막대로 표현, 2.04 %로 계산된다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" width="500" /> TK6의 lymphoblasts 그림 3. H의 수리 2 O 2 - 유도 손상. (A) 도식 대표 혜성과 수리 연구. TK6 세포는 손상을 에이전트로 처리하고 용해하기 전에 37 ° C에서 미디어에 복구 할 수 있습니다. (B) 네 &amp; #에서 20 분 동안 50 μM의 H 2 O 2 처리 후 TK6 세포의 수리 역학176, C. 각 데이터 포인트는 적어도 50 개인 혜성의 중앙값 백분율 테일 DNA는 각 실험에서 얻어진 3 개의 독립적 인 실험의 평균이다. 오차 막대는 반복 실험에서 평균의 표준 오차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig4highres.jpg" width="500" /> TK6의 lymphoblasts에서 MNNG에 의한 손상의 그림 4. 수리가. TK6 세포는 4 ° C에서 30 분 동안 0.1, 1, 3 μg / ml의 MNNG으로 처리하고, 120 분 후까지 37 ° C에서 미디어에 복구 할 수 있습니다 노출. 적어도 50 개인 혜성의 중앙값 백분율 테일 DNA는 세 개의 독립적 실험을 각각 얻었다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다3 개의 독립적 인 실험에서 평균의. <img alt="그림 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" width="300" /> 40 Gy를 (가운데)와 80 Gy를 (아래) 감마 방사선에 노출 치료 TK6의 lymphoblasts (위)와 TK6 세포로부터 그림 5. 중립 혜성 분석을 사용하여 TK6 세포의 IR의 용량 반응. (A) 배열 된 마이크로 웰 혜성. 스케일 바는 100 μm의입니다. 감마선의 다양한 수준에 노출 TK6 셀 (B)의 IR 투여 량 반응. 각 데이터 포인트는 칩에 6 macrowells에서 풀링 적어도 300 혜성의 중간 꼬리 길이 (μm의)를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

여기서 전례 처리량 DNA 손상 혜성 분석 검출 할 수있는 플랫폼을 설명한다. 장치 패턴 마이크로 어레이에 포유 동물 세포와는 96 샘플의 병렬 처리를 할 수 있습니다. 접근법은 기본 레벨 DNA 손상, 노출 유도 DNA 손상 및 DNA 수선의 동력학 분석을 용이하게한다.

CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K 조회수.  Massachusetts Institute of Technology.  여기서 전례 처리량 DNA 손상 혜성 분석 검출 할 수있는 플랫폼을 설명한다. 장치 패턴 마이크로 어레이에 포유 동물 세포와는 96 샘플의 병렬 처리를 할 수 있습니다. 접근법은 기본 레벨 DNA 손상, 노출 유도 DNA 손상 및 DNA 수선의 동력학 분석을 용이하게한다. 

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Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

연구

생체공학

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

액적 기반 RNA 시퀀싱을 통한 높은 처리량 효모 균주 현상태핑

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

미세 유체 플랫폼 내에서 3D 조직 된 인간 심장 조직 개발

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...