제 이름은 Shankari Nair 박사이며, 저는 NRF, iThemba LABS의 핵의학과 방사선 생물물리학과의 박사 후 펠로우입니다. 이 비디오에서는 일괄 대칭 응용 프로그램에서 사용하기 위해 인간 말초 혈액 림프구에 대한 자동 감마 H2AX 포시 분석의 사용을 시연할 것입니다. 직원에 대한 방사선 위험은 엄격하게 제어됩니다.
이온화 방사선은 DNA 중단을 유도하여 DNA의 구조에 직접적인 영향을 미칩니다. 특히 이중 가닥 휴식. DNA 이중 가닥 파손 인식 과정의 초기 단계 중 하나는 히스톤 변이체, H2AX 의 인포호리제이시화 및 수리 단백질 모집이다.
이 비디오는 형광 현미경을 통합하는 자동화 된 슬라이드 스캐닝 시스템 및 분석 플랫폼을 사용하여 감마-H2AX 포시 렌 핵의 수를 득점하는 현미경의 사용을 설명합니다. 림프구는 전체 혈액에서 분리됩니다. PBS로 전혈을 1대 1 비율로 희석한 다음 희석된 혈액을 한 부피의 밀도 그라데이션 배지에 부드럽게 놓습니다.
45도에서 기울어진 튜브를 잡고 서서히 혈액을 겹쳐냅니다. 서스펜션을 원심분리기로 옮기고 실온에서 20분 동안 900G.After 중화 4층이 형성된다. 림프구를 함유한 흐린 층을 새로운 멸균 원문 튜브로 조심스럽게 옮킨다.
PBS로 림프구를 씻고 혈종계를 사용하여 계산합니다. 림프구의 총 수가 결정되면, 완전한 RPMI의 1 밀리리터에 약 800, 000 림프구의 농도로 림프구 및 현탁액을 희석. 시료와 우리의 방사선에 대한 준비가되어 있습니다.
림프구는 코발트 60 소스에서 감마선으로 조사되며, 그 후 가습 된 5 % 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양됩니다. 모든 조사 조건이나 튜브에 대해 3 개의 슬라이드가 준비됩니다. 슬라이드를 클립 홀더에 넣고 필터 카드와 마지막으로 깔때기를 배치합니다.
슬라이드 클립을 고정하고 사이토 원심분리기에 넣습니다. 각 깔때기에 셀 서스펜션 250 마이크로리터를 넣고 5분 동안 30G로 회전합니다. 시토 원심분리기의 사용은 슬라이드 자동화에서 표준화된 조건을 얻는 데 필수적입니다.
회전하면 클립에서 슬라이드를 제거한 다음 소수성 펜을 사용하여 셀이 있는 지점 주위에 원을 그립니다. 이제 슬라이드가 만들어졌으니, 면역형염색이 발생할 수 있도록 세포를 슬라이드에 고정해야 합니다. 세포는 3% 파라포름알데히드 또는 PFA, 및 PBS 용액을 20분 동안 사용하여 고정된다.
고정 세척 후 5 분 동안 PBS와 코플린 항아리에 슬라이드. 그런 다음 트리톤 X로 세포를 덮어 투과화를 허용합니다. 투과단계는 항체가 세포 핵 내부에 들어갈 수 있도록 더 많은 세포막 지질을 제거합니다.
여기에서, 우리는 PBS에서 1 % BSA로 만든 차단 솔루션을 사용하여 잠재적 인 비특이적 결합을 줄이기 위해 슬라이드를 세척합니다. 1%BSA 및 PBS로 10분의 3개의 세척 단계 후, 슬라이드는 가습 챔버에서 1~500개의 1차 항감마 H2AX 항체를 실온에서 배양하고, 직사각형 슬라이드 저장 상자의 베이스에 습식 티슈 페이퍼를 추가하여 쉽게 수행할 수 있다. 1차 항체로 배양 한 후 액체를 팁과 1 % BSA 용액으로 슬라이드를 다시 세척하십시오.
가습 챔버에서 1 시간 동안 1-1 천 희석 된 이차 당나귀 항 마우스 TRITC 항체를 가진 인큐베이트 슬라이드. PBS에서 3분, 10분 세 가지 세차재를 수행하기 전에 항체를 제거한다. 코플린 항아리를 알루미늄 호일로 덮어 세척 단계 동안 빛에 노출되는 것을 방지합니다.
슬라이드를 제거하고 먼지가없는 티슈 페이퍼로 소수성 원 밖에서 과도한 PBS를 닦아냅니다. 마지막으로, DAPI 1~2방울을 추가하면 마운팅 미디엄을 묵인하고 커버 슬립으로 슬라이드를 부드럽게 덮습니다. 갇힌 기포가 없는지 확인하고 밤새 섭씨 4도의 어두운 곳에 샘플을 저장하십시오.
70%에탄올로 슬라이드를 부드럽게 닦고 자동 스캐닝 플랫폼 또는 슬라이드 스테이지에 슬라이드를 배치하여 zite 축 이미지 ZED-2 현미경에 부착합니다. 메타사이클 탭 아래에서 분류 설정을 선택하여 분류기를 편집합니다. 선택한 분류기는 시스템에서 슬라이드를 스캔하고 점수를 매기는 데 사용되며, 미리 정의된 매개 변수 집합을 기반으로 하며, 이는 시스템이 셀과 점수 foci를 선택하는 방법을 결정합니다.
분류기는 사전 분류된 여러 이미지 필드에 따라 최적화하고 학습할 수 있습니다. 현미경 배율에 따라 염색에 사용되는 항체의 종류와 항체의 종류는 다른 분류기를 최적화할 수 있다. 따라서 분류자는 일반적으로 실험실마다 다르지만 분류자 설정을 조정해야 할 때 고려해야 할 가장 기본적인 단계에 대한 개요를 제공합니다.
Capture'탭에서 최대 통합 시간 인 1.04 초의 DAPI 및 TRITC에서 사용할 필터를 찾을 수 있습니다. 후자는 회사에 의해 제공된 원래 분류자를 기반으로 하고 나중에 항체 강도 및 배경 감마 H2AX, 또는 TRITC 신호에 대해 조정된 이 특정 세포 유형, 즉 림프구를 기반으로 한다. 노출 탭에서 최소 통합 시간이 정의됩니다.
분류자는 항상 최소 및 최대 통합 시간 내에 유지되어 슬라이드의 오버 또는 노출을 방지합니다. 셀 선택 탭에서 분석되는 셀의 크기와 모양을 기반으로 최소 개체 영역과 최대 개체 영역이 정의되었습니다. 예를 들어, 미리 결정된 축하 값및 종횡비는 일반적으로 둥근 모양이 있는 림프구에 대해 구체적입니다.
기능 탭에서 갤러리와 히스토그램 뷰를 변경하고 현미경이 점수를 매는 데 필요한 것을 결정할 수 있습니다. 사용자가 선택한 기능에 따라 시스템은 수많은 항목을 점수매기를 할 수 있습니다. 예를 들어 소프트웨어가 개별 개체의 점수를 기록하는 방법의 임계값입니다.
적절한 분류기가 확인되면 사이드바에서 설정을 선택하고 각 슬라이드에 고유한 이름을 지정한 다음 적절한 분류자 선택을 선택합니다. 최대 셀 카운트를 선택하고 스캔하는 데 필요한 최대 셀 수를 추가합니다. 최대 셀 수에 도달하는 즉시 선택한 검색 창이 아직 완전히 검색되지 않은 경우에도 검색이 종료됩니다.
바이오 비대칭 응용 의 경우, 혈액 샘플 당 3 개의 슬라이드가 준비되어 있다는 점을 고려하여 슬라이드 당 1000 세포의 자동 채점만으로도 충분합니다. 확인을 클릭하여 설정을 확인합니다. 슬라이드를 스캔하려면 사이드바에서 Search'를 선택합니다.
슬라이드 설정에서 수동 검색 창 설정이 선택된 경우 대화 상자가 검색 영역을 결정하기 위한 줄을 엽니다. 10배의 목표를 이용하여 슬라이드의 직사각형 검색 영역은 마우스의 왼쪽 클릭으로 검색 필드의 두 모서리를 고정하여 상호식으로 선택된다. 이 확인'버튼을 통해 확인할 수 있습니다.
포커스 시작 위치를 조정합니다. 이 소프트웨어는 포커스를 프롬프트하고 각 슬라이드에 대한 40 배 목표를 사용하여 참조 핵을 중심과 OK와 설정을 확인합니다. 시스템은 자동으로 모든 면으로 순차적으로 이동합니다. 필요한 경우 이 단계에 대해 라이브 이미지 설정 및 통합 시간을 조정합니다.
모든 현미경 설정을 확인합니다. 현미경 관의 레버가 모든 빛을 카메라로 전환하고 확인으로 시스템 프롬프트를 확인하는 위치에 있는지 확인하십시오. 시스템은 참조 필드에 가장 가까운 그리드 위치에서 그리드 자동 초점을 시작합니다. 일반 그리드에 필드에 계속 초점을 맞추고 검색 창의 앞면과 뒤쪽을 향해 구불 구불 한 방향으로 이동합니다.
그리드 자동 초점이 완료되면 스캐닝이 시작됩니다. 스테이지는 데이터를 캡처하기 위해 필드 후 구불 구불 한 패턴 필드로 이동됩니다. 셀이 감지되면 위치가 지정되고 갤러리 이미지가 화면에 저장되고 표시되고 셀 수가 업데이트됩니다.
전체 검색을 검색한 경우, 최대 셀 수에 도달한 경우 또는 검색이 취소된 경우 검색이 종료됩니다. 스캔이 완료되면 하단의 막대를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 샘플을 엽니다. 검출된 셀의 작은 이미지로 구성된 갤러리를 검토합니다.
이 창에서 드롭다운 메뉴에서 선택할 기준을 통해 갤러리에 저장된 셀을 지정할 수 있습니다. 세포는 일반적으로 검출된 순서로 표시됩니다. 품질 히스토그램'또는 기능 값 다이어그램을 클릭하여 검출된 셀의 분포와 수단 및 득점된 포시의 표준 편차를 제공합니다.
여기서는 0 회색과 1.5 개의 회색 샘플을 비교합니다. 이것은 일반적으로 셀이 조사되지 않은 셀 당 0.124 foci의 평균 값을 가진 제어 슬라이드입니다. 생체 비대칭 맥락에서, 이것은 사람이 고용량 방사선에 노출되지 않았다는 것을 나타낼 것입니다.
그래프에서, 우리는 세포의 대다수가 셀 당 거의 제로 foci를 가지고 있음을 알 수 있으며, 정상적인 분포의 측면이 없다. 우리가 이것을 1.5 회색의 복용량과 비교할 때, 이것은 조사 된 샘플임을 분명히 볼 수 있습니다. 생체 비대칭 컨텍스트에서, 이 일반적인 분포는 견본이 방사선에 드러낸 명확한 표시입니다.
자동 스캐닝은 낮은 용량으로 포시 유도를 감지할 수 있을 만큼 민감합니다. 결과는 복용량을 가진 세포 당 foci의 수의 명확한 선형 증가를 보여줍니다. DNA 이중 가닥 브레이크 검출의 자동화된 방법은 빠르고 높은 처리량 생물학적 비대칭 응용 분야에 유용합니다.
시청해 주셔서 감사합니다.
