이 작품은 NIH NIDCD Y1-DC-8002-01에 의해 지원되었다. 이 작품은 계약 DE-AC52-07NA27344에서 로렌스 리버모어 국립 연구소에 의해 미국 에너지 국의 후원하에 실시 하였다.

1. 보강재에 프로브 어셈블리 프로토콜의이 섹션은 보강재에 실리콘 보강재의 제조 및 박막 중합체 프로브 조립체를 설명한다. 하나가 제안 보강재와 함께 전형적인 중합체 신경 프로브를 예시도. 보강재 디자인의 세부 사항은도 2에 나타낸다. 이 디자인의 새로운 기능은 채널을 조립하는 동안 액체 접착제를 배포하는 데 사용되는 그 길이를 따라 실행 &quot;발산&quot;얕은입니다. 보강재의 넓은 부분은 조립 및 외과 삽입하는 동안 처리 할 수​​있는 탭입니다. 탭에 저장 채널에 연결합니다. 구성 요소는 표준 미세 공정을 사용하여 실리콘으로부터 제조된다. <ol><li> 위킹 채널 실리콘 보강재는 보강재의 원하는 두께와 동일한 장치 층 두께로 실리콘 - 온 - 인슐레이터 (SOI) 웨이퍼 (로부터 제조 하였다 <stronG&gt; 그림 3A). 보강재 두께의 합리적인 범위는 20 ~ 100 μm의입니다. 이는 보강재의 폭이 프로브의 상부에 접착 계면에서 접착제의 오버 플로우를 방지하는 데 도움이 프로브 폭보다 20 ~ 30 ㎛의 작은 것이 권장된다. 먼저 심지 채널은 드라이 에칭 표준 보쉬 공정 (그림 3B)를 사용하고 있습니다. 다음에, 보강재 구조는 매립 산화물 층 (도 3c)에 정지 이상 에칭에 의해 정의된다. 마지막으로, 보강재는 49 % 불화 수소산 (그림 3D)의 습식 에칭 매립 산화물 층에 의해 방출된다. 철저하게 보강재를 세척 한 후, 15 분 동안 탈 이온수를 흡수. </li><li> 저수지에 분자량 10,000그램 / 몰의 폴리에틸렌 글리콜의 펠릿 (PEG) (그림 4)를 넣습니다. PEG가 녹아 모세관 작용에 의해 채널로 발산 있도록 65 ° C에 보강재를 가열한다. 그런 다음 응고 실온으로 냉각. </lI&gt; <li> 그림 5는 플립 칩 본더를 개략적으로는 설정을 보여줍니다. 다음 도구를 머리에 보강재를 집어 거꾸로 플립 칩 본더의 기본 단계에 보강재를 배치합니다. 거꾸로 기본 단계에 프로브를 놓습니다. 플립 칩 본더를 사용하여, 보강재와 프로브를 정렬하고 보강재를 낮추고 프로브 상에 배치. </li><li> 플립 칩 본더의 기본 단계는 기판에 열을 적용하는 가열 요소를 가져야한다. 보강재를 배치 한 후, 65 ° C.에 다시 한번 어셈블리를 열 PEG 1 분은 재 용융 및 프로브와 보강재 사이의 인터페이스를 입력하기 시작 할 수 있습니다. 응고 냉각. </li><li> 에 어셈블리를 켜고 상단에서 검사합니다. PEG는 완전히 프로브와 보강재 사이의 인터페이스를 채울 수 있도록 필요에 따라 재가열. 프로브가 투명하기 때문에이 시각적으로 평가 될 수있다. 어셈블리가 최고 (프로브)를 좌우 히터에 앉아있다으로, 수동으로 1-3 전자 배치탭 위에 고체 PEG의 엑스트라 알약이이 지역에서 추가로 보강 (그림 6)을 제공하는 프로브에 녹아 있도록. 마지막으로, 어셈블리가 PEG가 굳은 너무 냉각 할 수 있습니다. 이 시점에서, 조립은 수술 삽입을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 2. 삽입 및 추출 <ol><li> 탭 영역에서의 미세 조작기의 팔에 보강재의 뒷면을 부착하여도 7a에 도시 된 바와 같이 미세 조작기에 프로브 보강재 어셈블리를 장착합니다. 이 양면 테이프 나 시멘트로 수행하지만, 접착제로 프로브를 문의하지 않도록주의 할 수있다. 일시 쉽게 낮은 힘으로 제거 할 수 있도록 접착 퍼티의 작은 조각과 미세 조작기에 프로브의 커넥터 끝을 고정합니다. </li><li> 대상에 프로브 어셈블리를 배치하고 원하는 삽입의 속도로 프로브를 삽입합니다. 이 프로토콜을 개발할 때 0.13-0.5 mm / 초의 삽입 속도를 사용 하였다. &lt;/ 리&gt; <li> 즉시 부드럽게 미세 조작기로부터 프로브의 커넥터 끝을 제거하고 제 매니퓰레이터 아암 (도 7b)로, 주변 정보 표면에 나머지. PEG는 프로브를 생기죠 피하기 위해 용해 시작 전에 수행해야합니다. </li><li> PEG가 용해 될 때까지 기다리십시오. 이 시간은 PEG 분자량과 프로브와 보강재 사이의 접촉 면적에 의존 할 것이다. 예를 들어 10,000 G / 몰, 미세 프로브 약 6 ㎜, 폭 306 μm의입니다 일치하는 보강재의 PEG 분자량, 15 분 시간의 충분한 양의 것으로 밝혀졌다. 프로토콜의 제 3 필요한 용해 시간을 테스트 할 수있는 방법을 제시한다. 이 시간 동안, 대상 (그림 7C) 위의 임의의 PEG를 용해 탭 삽입 점을 중심으로 적기를 사용하여 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)를 적용한다. </li><li> 동력을 사용하여 마이크로 포지셔너의 변위를 적용하여 보강재의 추출을 시작5mm / 초의 속도로 100 μM. 이 초기의 빠른 움직임은 정적 마찰을 극복하고 프로브 변위를 최소화하는 데 도움이됩니다. 그런 다음, 약 0.1 mm / 초 (그림 7D)의 느린 속도로 보강재 추출을 완료합니다. </li><li> 실제 수술의 경우, 21에서와 같이, 프로브를 고정하고 보호하기위한 삽입 부위에서 겔, 실리콘, 및 / 또는 치과 아크릴을 적용하는 일반적인 절차를 계속한다. </li></ol> 3. 아가 로스 젤 테스트 프로토콜의이 섹션에서는 대량 기계적 특성, 산도, 그리고 뇌 조직 17,22의 염분 농도를 대략적으로 0.6 % 아가로 오스 겔에 보강재의 추출 검사 설정 및 절차에 대해 설명합니다. 젤이 짧은 거리를 거의 투명하기 때문에, 보강재의 분리 및 프로브 변위를 관찰 할 수있다. <ol><li> 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 0.6 % 아가로 오스의 솔루션을 준비합니다. ELE에 혼합완전 아가 분말을 용해 vated 온도. 얕은 아크릴 상자에 솔루션을 부어 젤 깊은 3/4- 1 있어야합니다. 시간 동안 실온에서 설정 겔 것을 허용한다. </li><li> 이 건조하지 않도록 경화 젤을 PBS로 포화되어 있는지 확인하고, 37 ℃에 젤을 가열 </li><li> 도 8에 도시 된 바와 같이 아가 로스 겔의 미세 조작기, 상자, 현미경 카메라 시스템을 설정한다. </li><li> 젤 박스의 측면 (그림 8) 사이에 밀어 젤의 상자에 유리 참조 기준점을 삽입합니다. 디지털 현미경의 시야에 참조 기준점의 기능을 사각형으로 치과 선택을 사용합니다. </li><li> 2.1 단계에 설명 된대로 미세 조작기에 프로브 어셈블리를 장착합니다. </li><li> 약 1mm 기준 기준점 뒤에 젤에 프로브 어셈블리를 놓습니다. </li><li> 시야에서 원하는 깊이로 안내하는 카메라를 사용하여, 겔로 프로브를 삽입한다. &lt;/ 리&gt; <li> 즉시 근처의 표면에 휴식을 프로브의 커넥터 끝을 이동합니다. </li><li> 프로브 (참조 기준점 기능이 약간 초점이 될 수있다)에 초점을 카메라 영상에 필요한 조정을합니다. 프로브 위치의 스냅 샷을 가져 가라. </li><li> PEG (이 시간이 다를 수 있으며, 실제로 테스트 할 수있는 매개 변수가 될 수있다) 용해 할 수 있습니다. 젤 위에 그 PEG를 용해 탭 근처에 PBS를 적용합니다. </li><li> 원하는 경우 비디오 캡처를 시작하고 2.5 단계에 설명 된대로 보강재의 추출을 시작합니다. 추출이 완료되면, 프로브 위치의 최종 스냅 샷을 촬영. </li><li> 보강재 추출 전후의 이미지를 비교하기 위해 이미지 처리 도구를 사용합니다. 이미지를 (정렬)를 등록 시야에서 볼 수 있습니다 참조 기준점의 기능을 사용합니다. 프로브에 공지 된 기능의 크기에 기초하여 화상의 배율을 보정. 프로브 변위의 거리를 측정한다. </li></ol>

<ol>
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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+realistic+brain+tissue+phantom+for+intraparenchymal+infusion+studies.">A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies.</a> Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).</li><li>Felix, S., Shah, K. G., George, D., Tolosa, V., Tooker, A., Sheth, H., Delima, T., Pannu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+silicon+insertion+stiffeners+for+neural+probes+using+polyethylene+glycol+as+a+biodissolvable+adhesive.">Removable silicon insertion stiffeners for neural probes using polyethylene glycol as a biodissolvable adhesive.</a> , 871-874 (2012).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

여기에서 설명하는 방법은 biodissolvable 접착제로 별도의 보강재로 박막 고분자 프로브를 장착 할 수있는 잘 제어 방법을 제공한다. 또한 이러한 착탈 보강재와 관련 프로브 보강재 구성 체외에서 절차의 유효성을 검사하는 기술을 구현하는 추천 수술 절차이다 선보였다. 보강재는 임의로 경질 이루어질 수 있기 때문에,이 방법은 비교적 긴 프로브 (&gt; 3mm)의 삽입을 용이하게 할 수있다. 이?...

미세 전극 배열은 신경 과학의 필수적인 도구뿐만 아니라 보철 등 신흥 임상 응용 프로그램입니다. 특히, 마이크로 관통 전극 프로브는 뇌, 척수 및 말초 신경 세포들과의 긴밀한 접촉을 통해 신경 세포의 활동을 자극하고 녹음을 가능하게한다. 이식 된 신경 프로브의 주요 과제는 자극과 녹음 기능의 안정성과 수명입니다. 미세 프로브 및 신경 조직 사이의 상호 작용의 모델링 및 실험 연구는 저하 하나의 메커니즘으로 인해 프로브와 조직 1-3 사이에 약간의 상대 운동에 신경 조직의 마이크로 찢는 것을 제안했습니다. 하나의 해결책은 더 가깝게 상대 미세 운동을 최소화하기 위해 신경 조직의 부피 강성 특성과 일치하는가요 성 프로브를 제조하는 것이다. 이와 같이, 폴리이 미드 및 파릴 렌 등의 생체 적합성 박막 중합체 microelec 유리한 기판으로서 채용되었다trode 4-8을 프로빙합니다. 가요 성 탐침의 절충들은 신경 조직에 삽입하기 어려운 점이다. 연구팀은 바람직한 기계적 특성을 유지하면서 유연한 프로브의 삽입을 용이하게하기 위해 다양한 방법을 촬영했습니다. 디자인의 하나의 클래스가 다른 부분에서 준수를 유지하면서 특정 섹션이나 축에 강성을 높이기 위해 고분자 프로브의 형상을 수정합니다. 이것은 갈비뼈 또는 기타 자료 9, 10 층을 통합하여 수행하고있다. 또 다른 방법은 생분해 성 재료 (11)로 채워진다 중합체 프로브 설계에 3-D 채널을 통합한다. 이 프로브는 일시적으로 경직 될 수 있고, 채널 해소 및 배수 아웃 삽입 재료 후. 그러나 영구적으로 최종 이식 장치의 형상을 변경 이와 같은 방법은 유연한 프로브의 바람직한 기능을 손상시킬 수. N을 수행하는 한 가지 방법최종 프로브 형상을 변경 하다며 일시적으로 장치 12-14 경화하는 생분해 성 물질로 고분자 장치를 캡슐화하는 것입니다. 그러나, 대표적인 생분해 성 물질은 실리콘보다 작은 크기의 영률 순서를 가지며, 결과적으로 동일한 강성을 달성하기 위해 큰 두께를 필요로한다. 적절하게 프로브가 삽입이 더 어렵게, 더 둥근 또는 뭉툭한 팁이 발생할 수 있습니다 코팅. 분해 할 수있는 코팅이 노출되어 있기 때문에 또한, 조직과 접촉시 즉시 용해 그들의 위험, 심지어 가까이가있다. 방법의 또 다른 클래스는 조직에 이식 된 후 강성 감소 소설 프로브 기판 재료를 사용합니다. 이러한 물질은 형상 기억 폴리머 (15)와 기계적으로 적응 나노 복합체 (16)를 포함한다. 이 자료는 삽입 후 크게 탄성 계수가 감소 할 수 있으며, 더 가깝게 성냥 프로브가 발생할 수 있습니다신경 조직의 H 기계적 성질. 그러나 강성의 달성 가능한 범위는 여전히 제한됩니다, 그래서 그들은 실리콘이나 텅스텐 와이어로 매우 높은 강성 상당을 제공하지 못할 수 있습니다. 따라서 매우 낮은 강성이 매우 긴 (예&gt; 3mm) 또는 그것은가요 프로브의 경우, 일시적으로 더 강성 보강재를 부착하는 방법이 여전히 요구 될 수있다. 보고 또 다른 유망한 방법은 코트에 셔틀과 유연한 프로브 (17) 사이의 표면 상호 작용을 사용자 정의 할 수있는 영구적 인 자기 조립 단분자막 (SAM)과 보강 셔틀입니다. 건조 할 경우, 프로브가 정전 기적으로 코팅 셔틀을 준수합니다. 삽입 후, 물을 셔틀이 추출 될 수 있도록 셔틀로부터 프로브를 분리, 친수성 ​​표면에 마이그레이션. 감소 프로브 변위 셔틀 추출 (85 ​​μm의) 입증되었다. 그러나, 정전 기적 상호 작용이 t에 프로브를 들고그는 셔틀, 삽입 전에 동안 셔틀 상대 프로브 불이행 될 위험이 있습니다. 우리는 유연한 프로브가 안전하게 삽입 중에 프로브를 보유 biodissolvable 임시 접착 재료와 보강재에 부착시키는 방법을 개발했다. 사용 된 프로브는 2-4 GPa의 정도의 탄성률을 가지고, 폴리이 미드로 제조 하였다. 보강재 ~ 200 GPa로의 탄성 계수와, 실리콘으로 제작되었다. 부착되면, 실리콘의 강성은 삽입을 용이하게 지배하고있다. 일단 조직에 삽입, 접착 물질은 용해 및 보강재는 초기에 유연성 탐침을 복원 추출된다. 우리는 biodissolvable 접착 재료로서 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 선택했다. PEG는 신경 프로브, 조직 공학, 약물 전달 11,18,19로 이식 된 응용 프로그램에서 사용되어왔다. 몇 가지 증거가 PEG는 뇌의 신경 염증성 반응을 약화 수 있다는 것을 제안했다조직 (18, 20). 수크로오스, 폴리 락트산 - 코 - 글리콜 산 (PLGA) 및 폴리 비닐 알코올 (PVA) 등의 다른 가능한 재료에 비해 PEG가의 주문에 (많은 임플란트 시술에 대한 적절한 치수이다 생체 액에서 용해 시간을 가지고 분자량에 따라 수십 분). 또, 온도 범위에서, 실온에서 고체와 액체 인 50-65 ° C.에서 이 속성은 우리의 정밀 조립 공정에 특히 적합합니다. 또한, SAM 유사한 17에서 설명한, 용해 PEG는 보강재의 추출을 용이 친수성이다. 이 유리한 접근 방식은 균일 한 접착제의 범위와 정확하고 반복적 인 정렬을 보장 새로운 보강재 디자인과 질서 조립 공정에 의해 사용할 수 있습니다. 조립 공정 이외에, 우리는 수술 중에 이동식 보강재를 구현하는 방법뿐만 아니라, STI의 추출을 평가하는 시험 관내 절차를 제시ffener. 본 명세서에서 프로토콜은 사용자가 유연한 고분자 미세 프로브를 가지고 있다고 가정한다. 보강재이 프로브의 보강재 및 조립체의 제조를 관련 프로토콜의 부분이 미세 가공 시설에서 발견 일반적인 도구에 대한 액세스를 가정한다. 삽입 및 추출과 관련된 프로토콜은 가능성 신경 지향 실험실에서 수행 될 것이다.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Polyethylene glycol, 10,000 g/mol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>309028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flexible Sub-micron Die Bonder</td>
			<td>Finetech</td>
			<td>Fineplacer lambda</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1760-61</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital Microscope</td>
			<td>Hirox</td>
			<td>KH-7700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dual Illumination Revolver Zoom Lens</td>
			<td>Hirox</td>
			<td>MXG-2500REZ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Precision Motorized Actuator</td>
			<td>Newport</td>
			<td>LTA-HS</td>
			<td>w/ CONEX-CC controller</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

insertion of flexible neural probes using rigid stiffeners attached with biodissolvable adhesive

가요 성 재료가 미세 운동으로 인한 악영향 조직 반응을 최소화 할 수 있기 때문에 생체 적합성 박막 폴리머로 만들어진 신경 인터페이스 디바이스를위한 미세 전극 배열은 기능적 수명을 연장 한 것으로 예상된다. 그러나, 유연성 정확하게 신경 조직에 삽입되는 것을 방지 할 수 있습니다. 본품은 일시적 프로브의 정확한 수술 삽입을 용이하게하기 위해 biodissolvable 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용하여 강성 보강재로 변경할 미세 프로브를 부착하는 방법을 보여준다. 보강재 독특한 디자인은 프로브의 길이를 따라 PEG 접착제의 균일 한 분포를 허용한다. 플립 칩 본딩, 마이크로 전자 패키징에 사용되는 일반적인 도구는 보강재에 대한 정확하고 반복적 인 정렬과 프로브를 부착 할 수 있습니다. 프로브 및 보강재는 수술 후 PEG는 보강재가 프로브를 떠나 추출 할 수 있도록 분해 할 수있다, 함께 이식장소. 마지막으로, 시험 관내 시험 법은 뇌 조직의 아가 로스 겔 모델 보강재 추출을 평가하는 데 사용된다. 주입이 방법은 (&gt; 3mm) 더 유연한 프로브에 특히 유리한 입증했다. 또한 양면가요 프로브를 이식하는 가능한 방법을 제공한다. 지금까지 기술은 래트 피질에서 다양한 생체 기록 데이터를 얻기 위해 사용되었다.

이러한 삽입 방법은 ISO 10993 생체 적합성 기준을 통과 만성 이식을 위해 의도된다 LLNL 박막 폴리이 프로브와 함께 사용 하였다. 전형적인 박막 폴리이 프로브는 좁은 영역에 긴 대략 10mm 인 실리콘 보강재와 함께도 1에 도시되어있다. 그림 2에서와 같이이 보강재는, 그 길이를 따라 실행 한 발산 채널을 가지고 있습니다. 3의 실리콘이 밖으로 보강재를 만드는 ?...

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Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

유연한 신경 미세 프로브의 삽입은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 강성 보강재에 프로브를 연결하여 사용할 수 있습니다. 고유의 조립 공정은 균일하고 반복적 인 첨부 파일을 확인합니다. 조직에 삽입 한 후, PEG가 용해 보강재가 추출된다. 시험 관내 시험 방법은 아가 로스 겔에서 기술을 평가한다.

Biodissolvable 접착제가 부착 된 강성 보강재를 사용하여 유연한 신경 프로브의 삽입

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

insertion-flexible-neural-probes-using-rigid-stiffeners-attached-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K 조회수.  Lawrence Livermore National Laboratory.  유연한 신경 미세 프로브의 삽입은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 강성 보강재에 프로브를 연결하여 사용할 수 있습니다. 고유의 조립 공정은 균일하고 반복적 인 첨부 파일을 확인합니다. 조직에 삽입 한 후, PEG가 용해 보강재가 추출된다. 시험 관내 시험 방법은 아가 로스 겔에서 기술을 평가한다. 

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Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

연구

생체공학

A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, 'SurgiLux': Preparation and Demonstration

Sutures are a 4,000 year old technology that remain the 'gold-standard' for wound closure by virtue of their repair strength (~100 KPa). However, sutures can act as a nidus for infection and in many procedures are unable to effect wound repair or interfere with functional tissue regeneration.1 Surgical glues and adhesives, such as those based on fibrin and cyanoacrylates, have been developed as alternatives to sutures for the repair of such wounds. However, current commercial adhesives also have significant disadvantages, ranging from viral and prion transfer and a lack of repair strength as with the fibrin glues, to tissue toxicity and a lack of biocompatibility for the cyanoacrylate based adhesives. Furthermore, currently available surgical adhesives tend to be gel-based and can have extended curing times which limit their application.2 Similarly, the use of UV lasers to facilitate cross-linking mechanisms in protein-based or albumin 'solders' can lead to DNA damage while laser tissue welding (LTW) predisposes thermal damage to tissues.3 Despite their disadvantages, adhesives and LTW have captured approximately 30% of the wound closure market reported to be in excess of US $5 billion per annum, a significant testament to the need for sutureless technology.4
In the pursuit of sutureless technology we have utilized chitosan as a biomaterial for the development of a flexible, thin film, laser-activated surgical adhesive termed 'SurgiLux'. This novel bioadhesive uses a unique combination of biomaterials and photonics that are FDA approved and successfully used in a variety of biomedical applications and products. SurgiLux overcomes all the disadvantages associated with sutures and current surgical adhesives (see Table 1).
In this presentation we report the relatively simple protocol for the fabrication of SurgiLux and demonstrate its laser activation and tissue weld strength. SurgiLux films adhere to collagenous tissue without chemical modification such as cross-linking and through irradiation using a comparatively low-powered (120 mW) infrared laser instead of UV light. Chitosan films have a natural but weak adhesive attraction to collagen (~3 KPa), laser activation of the chitosan based SurgiLux films emphasizes the strength of this adhesion through polymer chain interactions as a consequence of transient thermal expansion.5 Without this 'activation' process, SurgiLux films are readily removed.6-9 SurgiLux has been tested both in vitro and in vivo on a variety of tissues including nerve, intestine, dura mater and cornea. In all cases it demonstrated good biocompatibility and negligible thermal damage as a consequence of irradiation.6-10

The fabrication of a novel, flexible thin film surgical adhesive from FDA approved ingredients, chitosan and indocyanine green is described. Bonding of this adhesive to collagenous tissue through a simple activation process with a low-powered infra-red laser is demonstrated.

키토산 기반, 레이저 활성화 박막 외과 접착제, &#39;SurgiLux&#39;: 준비 및 데모

Sutures are a 4,000 year old technology that remain the 'gold-standard' for wound closure by virtue of their repair strength (~100 KPa). However, sutures ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

실란 커플링 에이전트를 사용하여 실리카 광 Biosensors에 생물 학적 프로브를 부착

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

측정을위한 소형 이중 요소 스트레인 게이지의 제조 및 주입<em&gt; 생체</em&gt; 설치류에서 위장 수축.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3D 종이 미세 유체 장치를 구축하기 위해 접착제 패터닝을 사용하여

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing the complicated multi-bracket appliances to a simple two-bracket system for the purpose of force system evaluation will be the first step in this direction. However, much of the orthodontic biomechanics in this regard is confined to 2D experimental studies, computer modeling/analysis or theoretical extrapolation of existing models. The objective of this protocol is to design, construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the forces and moments generated by an archwire with a V-bend placed between two brackets. Additional objectives are to compare the force system generated by different types of archwires among themselves and to previous models. For this purpose, a 2 x 4 appliance representing a molar and an incisor has been simulated. An orthodontic wire tester (OWT) is constructed consisting of two multi-axis force transducers or load cells (nanosensors) to which the orthodontic brackets are attached. The load cells are capable of measuring the force system in all the three planes of space. Two types of archwires, stainless-steel and beta-titanium of three different sizes (0.016 x 0.022 inch, 0.017 x 0.025 inch and 0.019 x 0.025 inch), are tested. Each wire receives a single vertical V-bend systematically placed at a specific position with a predefined angle. Similar V-bends are replicated on different archwires at 11 different locations between the molar and incisor attachments. This is the first time an attempt has been made in vitro to simulate an orthodontic appliance utilizing V-bends on different archwires.

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

The method presented here is designed to construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the force system generated by different archwires with V-bends placed between two brackets. Additional objectives are to compare this force system with different types of archwires and to previous models.

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

Rat Model of Adhesive Capsulitis of the Shoulder

This proposal aims to create an in vivo rat model of adhesive capsulitis for researching potential treatment options for this condition and other etiologies of comparable arthrofibrosis. The model includes extra-articular fixation of the shoulder in rats via scapular to humeral suturing, resulting in a secondary contracture without invading the intra-articular space and resulting in decreased rotational ROM and increased joint stiffness.
We used 10 Sprague-Dawley rats for the purpose of this study. Baseline ROM measurements were taken before glenohumeral immobilization. The rats were subjected to 8 weeks of immobilization before the fixation sutures were removed and changes in ROM and joint stiffness were evaluated. To evaluate whether immobilization resulted in a significant reduction in ROM, changes in kinematics were calculated. ROM was measured at each time point in the follow-up period and was compared to the baseline internal and external ROM measurements. In order to evaluate the stiffness, joint kinetics were calculated by determining the differences in torque (text and tint ) needed to reach the initial external rotation of 60&#176; and initial internal rotation of 80&#176;.
After the removal of the extra-articular suture fixation on follow-up day 0, we found a 63% decrease in total ROM compared to baseline. We observed continuous improvement until week 5 of follow-up, with the progress slowing down around a 19% restriction. On week 8 of follow-up, there was still an 18% restriction of ROM. Additionally, on follow-up day 0, we found the torque increased by 13.3 Nmm when compared to baseline. On week 8, the total torque was measured to be 1.4 &#177; 0.2 Nmm higher than initial measurements. This work introduces a rat model of shoulder adhesive capsulitis with lasting reduced ROM and increased stiffness.

This protocol presents an in vivo rat model of adhesive capsulitis. The model includes an internal fixation of the glenohumeral joint with extra-articular suture fixation for an extended time, resulting in a decreased rotational range of motion (ROM) and increased joint stiffness.

어깨의 접착성 Capsulitis의 쥐 모델

This proposal aims to create an in vivo rat model of adhesive capsulitis for researching potential treatment options for this condition and other ...

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high cell isolation and a controlled environment. However, the survival of hippocampal cells in vitro is compromised: most cells die during the first week of culture. It is therefore of great importance to identify ways to increase the durability of neural cells in culture.
Calcium carbonate in the form of crystalline aragonite derived from the skeleton of corals can be used as a superior, active matrix for neural cultures. By nurturing, protecting, and activating glial cells, the coral skeleton enhances the survival and growth of these cells in vitro better than other matrices.
This protocol describes a method for cultivating hippocampal cells on a coralline matrix. This matrix is generated by attaching grains of coral skeletons to culture dishes, flasks, and glass coverslips. The grains assist in improving the environment of the cells by introducing them to a fine three-dimensional (3D) environment to grow on and to form tissue-like structures. The 3D environment introduced by the coral skeleton can be optimized for the cells by grinding, which enables control over the size and density of the grains (i.e., the matrix roughness), a property that has been found to influence glial cells activity. Moreover, the use of grains makes the observation and analysis of the cultures easier, especially when using light microscopy. Hence, the protocol includes procedures for generation and optimization of the coralline matrix as a tool to improve the maintenance and functionality of neural cells in vitro.

Dissociated hippocampal cell culture is a pivotal experimental tool in neuroscience. Neural cell survival and function in culture is enhanced when coralline skeletons are used as matrices, due to their neuroprotective and neuromodulative roles. Hence, neural cells grown on coralline matrix show higher durability, and thereby are more adequate for culturing.

생물학적 활성 Coralline Matrix를 사용한 해리 된 신경 세포 배양의 내구성 향상

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...