우리는 쥐 자원​​ 연구 센터 감사, 미주리 대학, 컬럼비아, 미주리, GFP 쥐를 제공; 인간의 신경 줄기 세포를 제공하는 Neuralstem 사. 이 작품은 재향 군인회, NIH (NS09881), 캐나다의 척추 연구 기관, 크레이그 H. Neilsen 재단, 그리고 버나드와 앤 스피처 자선 신탁에 의해 지원되었다.

모든 동물 프로토콜은 VA-샌디에고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인됩니다. 실험실 동물 관리 및 안전에 대한 NIH의 지침을 엄격히 준수. 동물 연구를 통해 음식과 물에 자유롭게 접근이 적절하게 고통과 불편을 최소화하기 위해 처리됩니다. 1. 섬유소 구성 요소의 준비 성장 인자 칵테일을 함유 <ol><li> (자료 표 참조) 50 ㎎ / ㎖ 2 배 원액을 얻기 위해 0.5 ml의 PBS에 25 mg을 쥐 피브리노겐을 분해. 섬유소 용해하기 어렵고, 37 ° C의 보육 또는 수조에 넣고 1 ~ 2 시간마다 5 ~ 10 분을 흔들어해야합니다. </li><li> 50 U / ㎖의 2 배 원액을 얻기 위해 10 mM의 멸균 염화칼슘 2 ㎖에 100 UN 쥐 트롬빈을 녹인다. </li><li> 100 ㎕의 원액을 구하는 다음의 농도로 PBS에 성장 인자를 녹이고, 1 ㎎ / ㎖ : BDNF; 생체 내에서 척수강 내 주입으로 NT-3 (높은 주식 농도 <sup&gt; 19); 200 ㎍ / ㎖의 : GDNF; IGF; bFGF에; EGF; PDGF; aFGF; HGF (세포 배양에 사용되는 것보다 약 1,000 X 이상). </li><li> 50 mM의 DMSO 주식 솔루션을 얻기 위해 1.3 ㎖의 DMSO에 25 밀리그램의 MDL28170 (칼 페인 억제제)를 용해하고 1 ㎜ 주식 솔루션을 얻기 위해 PBS에 50 배 희석. </li><li> 1000 μL 성장 인자 칵테일 솔루션 (그림 1)를 생산하는 각각의 성장 인자 성분의 100 μL와 MDL28170 (1 ㎜의 원액) 100 μl를 섞는다. </li><li> -70 ℃에서 저장을위한 10 또는 20 μL에 성장 인자와 나누어지는를 포함하는 25 ㎎ / ㎖ 피브리노겐 작업 솔루션을 얻기 위해 500 μL 성장 인자 칵테일 500 μL 피브리노겐 배 원액을 혼합 이 솔루션은 -70 ° C에서 최대 12 개월 동안 안정 </li><li> 마찬가지로, 스토리지 유사 10 또는 20 ㎕의 부피로 성장 인자를 함유하는 분취 액과 25 U / ㎖ 트롬빈 작업 용액을 얻기 위해 500 ㎕의 성장 인자의 칵테일을 500 μL 트롬빈 2X 원액 혼합T -70 ° C에 대한 최대 12 개월까지. </li><li> 세포와 혼합 될 때까지 이식의 날, 얼음에 피브리노겐과 트롬빈 함유 성장 인자 칵테일을 배치합니다. </li></ol> 2. T3 척수 절개 <ol><li> 수용 가능한 방법을 사용하여 성인 여성의 피셔 344 쥐 또는 무 흉선 누드 쥐를 마취. 꼬리와 발 핀치에 응답이 완전히없는 경우 주제 깊이, 마취 있습니다. 참고 : 우리는 일반적으로 150-200g 피셔 쥐 또는 1백80~2백20그램 무 흉선 쥐와 마취제의 마취 칵테일 (2 ㎖ / ㎏) (25 ㎎ / ㎖), 자일 라진 (1.3 ㎎ / ㎖) 및 아세 프로 마진 (0.25 MG를 사용 / ㎖). </li><li> 동물이 마취 동안 건조 또는 눈의 손상을 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 상단 흉부 영역을 면도하고 베타 딘으로 피부를 청소합니다. </li><li> , # 15 블레이드를 사용하여 피부와 근육을 잘라 외과 견인기를 사용하여 T3 척추를 노출하고 rongeur을 사용하여 T3 / 4 척수를 노출 T3 척추에서 후궁 절제술을 수행합니다. </li><li> 경도를 확인# 11 블레이드를 사용하여 약 2mm 길이의 경질의 종 방향 중간 선 절개. </li><li> 오른쪽 측면 전체 척수를 절단하는 경막 아래에 홍채 절개 가위를 놓습니다. 1.5 mm 더 cadually 같은면에 또 다른 상처를 확인합니다. </li><li> 중간 강도의 진공에 연결 무딘 23 G 바늘 두 컷 세그먼트 사이 기음 척수 조직. 배쪽으로 횡 방향 완전 절개를 보장하기 위해 시각적 인 확인을 사용합니다. 이 측면 hemisection을 완료합니다. </li><li> , 전체 폭 척수 절개로 병변을 확장 왼쪽 hemicord에 거울 절개를 배치합니다. 2 주 후 이식 할 때 병변 사이트의 회사 이식 / 섬유소 매트릭스를 유지하기 위해, 첫 번째 컷이 아닌, 그대로 두라를 떠나 시도합니다. </li><li> 근육을 봉합 항생제 분말과 주식 스킨을 적용. </li><li> 락 테이트 링거액 (3 ㎖)을 주입, Bannamine (2.5-5 ㎎ / ㎏)과 암피실린 (80 ~ 100 ㎎ / ㎏) 즉시 수술 및 마이 후 (재료 표 참조)따뜻한 인큐베이터에서 ntain 쥐 체온이 다시 설정 될 때까지. </li><li> 방광을 비우고 (그림 1B)를 비우는 반사 방광의 설립 때까지 약 2 주 동안 하루에 두 번 링거 암피실린 솔루션을 주입. </li></ol> 3. 갓 해리 배아 일의 준비 (14) 척수 신경은 줄기 세포 <ol><li> inbreed 유전자 변형 GFP의 F344 쥐 쥐 자원​​에서 (F344-Tg는 (UBC-EGFP) F455Rrrc) 및 연구 센터, 미주리 대학교를 얻습니다. </li><li> 40 μg DES-의 Gly (10)를 주입, [D-알라 6] Leuteinizing 호르몬이 후 200의 농도 ㎍ / 성숙한 여성의 쥐 (8 주 이상) 당 (IP)을 복강 ml로 PBS에 희석 호르몬 에틸 아미드 (LHRH)을 해제 배아 컬렉션의 동기화를위한 -3의 시간 빛 유도. </li><li> 사일 주입 후 성숙한 GFP 동형 접합 또는 이형 남성 쥐의 하룻밤과 결합. </li><li> 일 13.5-14.5 postcoitus에서 배아를 수집또는 형광 현미경 - 차가운 HBSS 버퍼 (PC), &quot;NightSea&quot;손전등 및 필터 안경 (BlueStar는 손전등 모델 VG1 차단 필터 BLS1)에서 GFP 발현을 확인합니다. </li><li> 각 GFP 양성 태아에서 무균 중 척수를 해부 위에있는 수막 및 홍채 절제술 가위 및 미세 보석상의 집게와 연결된 척수 신경절을 제거합니다. </li><li> 15 ㎖의 cornical 관에 2 ㎖ 차가운 HBSS 버퍼로 해부 척수를 수집하고 얼음에 보관. </li><li> 해부 척수 해리 참조 번호 (20)를 따라 <ol><li> 간단히, (여러 코드 1 코드가 하나의 주제의 이식을위한 충분한 세포를 생성 할 수 있습니다, 함께 소화 할 수있다) 해부 척수를 포함하는 튜브에 0.25 % 트립신-EDTA 2 ㎖를 추가하고 10 ~ 12 분 동안 37 ° C에서 소화. </li><li> 튜브를 원심 분리 2 분 동안 2,500 rpm에서 조직을 10 % FBS 함유 DMEM 10 ㎖를 첨가함으로써 트립신의 반응을 정지. </li><li> 2 ㎖ NeuroBasal 매체 콜로라도에있는 조직을 재현 탁2 % B27를 ntaining하고, 점차적으로 작은 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 척수 조직을 씹다. </li><li> 원심 분리기 40 μm의 셀 필터 여과기와 2 분, B27를 함유 NeuroBasal 배지 2 ㎖에 재현 탁하고, 필터 셀에 대한 2,​​500 rpm에서 세포. </li></ol></li><li> 혈구와 세포를 세어 똑같이 두 에펜 도르프 튜브에 세포를 나눕니다. </li><li> 세포를 원심 분리기와 완전히 뜨는을 제거 (1 ~ 2 분은 저 진공 끝으로 모든 상층 액을 철회해야한다) 그래서 성장 인자 칵테일 세포 재 정지 후 남은 상층 액을 희석되지 않습니다. </li><li> (약 ⅓ 최종 볼륨의 세포 펠렛 카운트) 250,000 세포 / μL의 농도로 각각 성장 인자를 포함하는 피브리노겐 또는 트롬빈 작업 솔루션의 각 셀 절반을 재현 탁하고 (그림 1A) 얼음 전에 이식에 배치. 세포와 혼합 때 피브리노겐이 자발적으로 젤 수도 있습니다발 병변 / 그래프트 사이트 트롬빈과 결합하기 전에; 조기 겔화를 방지하기 위해, 바로 생체 내에서 세포 이식하기 전에 피브리노겐의 세포를 혼합한다. </li></ol> 4. 이식 <ol><li> 이주 척수 절개 한 후 병변을 T3 / 4 척수 Reexpose. </li><li> 5 μL 피브리노겐 세포 5 μL 트롬빈 세포는 직접 병변 사이트를 다시 열지 않고 밀봉 된 흉터 조직 그대로 두라를 통해 병변 사이트의 9 점에 주입 될 수있다. </li><li> 센터에서 3 (중간 지점에있는 하나 이음 두, 따로 따로 0.5 mm 간격)와 주동이 모두 3 : 반흔 조직 그대로 두라 1~2주 포스트 병변의 표면에 9 홀을 만들기 위해 27 G 바늘을 사용하여 와 꼬리 인터페이스 (병변의 중심에 약 0.5 mm 주동이 또는 꼬리) 3. </li><li> 그런 다음 주동이의 인터페이스와 수성의 3 점으로 병변 사이트와 분기 볼륨의 세 가지 핵심 포인트로 피브리노겐 세포 솔루션의 절반 볼륨을 주입꼬리 인터페이스의 3 점에 uarter 볼륨. </li><li> 그 후, 즉시 동일한 스팟에 throbmbin 세포를 주입. 피브리노겐 및 세포 병변 사이트 내부 트롬빈 세포의 혼합물을 병변 부위에 세포를 억제하는 피브린 겔을 형성하고 성장 인자의 칵테일은 세포의 생존을 지원할 것이다. 세포 PicoSpritzer (일반 밸브, 주식 회사)에 접속 뽑아 유리 피펫을 사용하여 주입된다. </li><li> 이식 교양 인간 NSCs의 상술 한 바와 같은 절차에 21 일 인간 시약 만든 섬유소 및 성장 인자 칵테일을 사용합니다. </li></ol>

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우리는 공개 아무것도 없어.

손상된 척수에있는 NSC 이식을위한 주요 장애물 중 하나는 병변 센터에서 생존율이다. 병변 사이트의 틈새 나 구멍은 잠재적으로 감소 시키거나 supraspinal 축삭 손상 아래 분리 된 척수 세그먼트 사이의 기능적 연결을 릴레이의 형성을 약화시킬 수 있습니다. 또한, 이식 NSCs의 가난한 생존 호스트 조직과의 통합에 영향을 미치고, 따라서 호스트 신경 세포와 이식 뉴런의 연결을 줄일 수 있습니다. 세...

척수 손상 (SCI)는 종종 손상뿐만 아니라의 interneurons 및 운동 신경의 분절 손실을 일으키는 원인이되는 뇌로부터 신호를 전달 백색질, 또한 중앙 회색 문제. SCI의 결과는 모터와 병변 아래 감각 기능 양자의 손실이다. 불행하게도, 성인 중추 신경계 (CNS)는 자발적으로 영구적 인 기능 적자 1의 결과로, 다시 생성되지 않습니다. 따라서, 부상 성인 척수 및 개선 모터, 감각 및 자율 신경 기능의 재건은 SCI 연구의 중요한 목표이다. 신경줄 기세포 (NSCs의)은 직접적으로 배아 또는 성인 CNS로부터 격리 여부 분실 뉴런 및 아교를 대체하는 강력한 후보 셀이다. 또한, 이러한 세포 병변 사이트 2,3 걸쳐 축삭 전도를 복원하는 신규 기능 릴레이를 형성 할 가능성이있다. 현재까지 해부학의 상세한 해설, electrophys은 없었다iological 심각한 SCI 후 이식 NSCs의로의 연결을 중계 형성의 행동 효과. 첫째, 이식 NSCs의 태아의 중추 신경계 조직을 큰 병변 구멍에 이식 할 때 제대로 생존이에 대한 몇 가지 이유가 있습니다. 이전 연구는 큰 빈 낭성 병변 충치에게 4,5를 떠나, 상당한 초기 세포 손실을 보여줍니다. 일부 연구에서는 이식 된 세포가 연속적으로 나누어 병변 캐비티에게 4,5를 작성하지만이 주 일의 지연 상황이 발생할 수 있습니다, 이후 병변 사이트의 충전이 완료 또는 일치하지 않을 것입니다. 둘째, 세포의 생존, 분화 / 성숙하고, 이식 NSCs의의 파생물에 사운드 데이터를 제공하는 효율적인 추적 시스템이 부족했다. 대부분의 초기 연구는 antegrade 및 이식 2,3에서 축삭 돌기를 추적하는 역행 라벨을 이용했다. 그러나 이러한 기술은 부분적으로 만 자주 unclearly 표시 축삭 이식 세포에서 발생하는 예측 및 추적 방법은 subjec 있습니다이식 된 세포 이상 염료 누출로 인한 유물에 t. 다른 그룹은 부상 쥐 척수 5,6에 인간 태아 NSCs의 이식 후 축삭 돌기에 라벨을 인간의 특정 신경 세포 마커를 사용했습니다. 그러나 이러한 연구에서, 이종 이식은 지속적으로 잘 생존하지 않았다. 최근 GFP 리포터 유전자의 바이러스 배달은 배양 NSCs의 7,8 레이블을 사용 하였다. 그러나, GFP의 표현은 종종 일치했고 7을 규제 할 수있다. 최근, 안정 리포터 유전자, GFP 또는 인간 태반 알칼리 포스 파타 아제를 발현하는 형질 전환 마우스 또는 공여 쥐의 사용이 극적 생체 9,11에서 이식 신경 줄기 세포 / 전구 세포의 추적을 개선했다. 셋째, 여러 연구는 손상이나 부상 성인 척추 오호의 환경에 이식 할 때 배아 또는 성인 하나 CNS에서 파생 된 체외에서 배양 한 쥐의 NSCs의 독점적 폐해 계통으로 분화을 나타냅니다이러한 신경줄 기세포는 로컬 환경은 줄기 세포의 운명을 지시 할 수 있다는 것을 나타내는, 뉴런 및 체외에서 신경교 모두로 분화 할 수 있다는 사실에도 불구하고 D 7,12,13. 또한, 배양 NSCs의, 성인 CNS에서 파생 특히이 생체 내 13 신경교 계통으로 분화하는 고유 defaulty에 속성을 가질 수있다. 때문에 위에서 언급 된 한계, 우리 그룹은 최근에 중상을 입은 성인 척수 배아 NSC 추적, 생존, 분화 / 성숙을 개선하기 위해 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 간단히 말해서, 우리는 생체 이식 14 후 GFP 발현을 지속 GFP 리포터 유전자를 발현하는 형질 전환 안정 피셔 344 쥐 inbreed 라인 시작했다. 다음에, 우리는 배아 일부터 14 피셔 344 척수 뉴런 및 아교 모두를 생성 할 수있는 잠재력을 유지 개발 단계를 갓 절연 NSCs의 사용. 마지막으로, 우리는 임베디드성장을 함유 피브린 매트릭스에 갓 NSCs의 분해는 세포를 유지하고 균등 그래프트 세포 생존, 분화 및 통합을 지원하는 것을 목표로, 큰 병변 공동 내에이를 분산 15-17 요인. 이식은 T3 완전 절개, 척수 손상 후 2 주간의 사이트에 배치했다. 이러한 이식 세포는 지속적으로 완전한 절개 사이트를 가득 긴 거리 18 세 이상 호스트 척수로 축삭 많은 수의 확장 풍부한 신경 세포로 분화. 유사한 결과 면역 결핍 쥐 18에 배양 된 신경 줄기 세포의 이식을 사용하여 수득 하였다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagents</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibrinogen(rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F6755-25MG</td>
 <td>2 hr at 37 &deg;C to dissovle 
 Stock Concentration: 50 mg/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thrombin (rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T5772-100UN</td>
 <td>Dissovle in 10 mM CaCl2 
 Stock Concentration: 50 U/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bFGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F0291 (25 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGF (murine)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>E1257 (0.1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BDNF(human)</td>
 <td>Peprotech</td>
 <td>452-02 (1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 1000 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 50 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT-3 (human)</td>
 <td>Peprotech</td>
 <td>452-03 (1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 1000 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 50 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GDNF (rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G1401 (10 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IGF-1(mouse)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>I8779 (50 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>aFGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F5542 (25 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PDGF-AA (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P3076 (10 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H9661 (5 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MDL28170</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M6690 (25 mg)</td>
 <td>Stock in DMSO 
 Stock Concentration: 1 mM 
 Final Concentration: 50 &mu;M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>BSS-1005-B</td>
 <td>Stock Concentration: 1X 
 Final Concentration: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketamine</td>
 <td>Putney</td>
 <td>26637-411-01</td>
 <td>40-80 mg/kg 
 Stock Concentration: 100 mg/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylazine</td>
 <td>Lloyd</td>
 <td>0410,</td>
 <td>2.5-8 mg/ml 
 Stock Concentration: 100 mg/ml 
 Final Concentration: 1.3 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acepromazine</td>
 <td>Butler</td>
 <td>003845</td>
 <td>0.5-4 mg/ml 
 Stock Concentration: 10 mg/ml 
 Final Concentration: 0.25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Betadine</td>
 <td>Healthpets</td>
 <td>BET16OZ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ringers</td>
 <td>Abbott</td>
 <td>04860-04-10</td>
 <td>2-3 ml/inj</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Banamine</td>
 <td>Schering-Plough</td>
 <td>0061-0851-03</td>
 <td>2.5 -5 mg/kg 
 Stock Concentration: 50 mg/ml 
 Final Concentration: 0.5 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin</td>
 <td>Sandoz</td>
 <td>0781-3404-85</td>
 <td>80-100 mg/kg 
 Final Concentration: 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LH-RH</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L4513</td>
 <td>200 &mu;g/kg 
 Final Concentration: 200 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14175-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25200056 </td>
 <td>Stock Concentration: 0.25 % 
 Final Concentration: 0.125 %</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11995073 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>16000044 </td>
 <td>Stock Concentration: 100 % 
 Final Concentration: 10 %</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal Medium</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21103049 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B27</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>17504044</td>
 <td>Stock Concentration: 100x 
 Final Concentration: 1x</td>
 </tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Note, use human reagents for grafts of human NSCs</td>
 </tbody>
</table>

promotion of survival and differentiation of neural stem cells with fibrin and growth factor cocktails after severe spinal cord injury

신경 줄기 세포 (NSCs의)는 자기 갱신과 뉴런과 교세포로 분화 할 수있다. NSCs의 이식은 척수 손상 (SCI) 후 손실 뉴런 및 아교를 대체 할 수 있고, 병변 위와 아래 척수 세그먼트를 재 연결하는 중계 기능을 형성 할 수있다. 신경 줄기 세포를 이식 이전 연구는 척수 병변 공동 내에 불완전 이식편 생존에 의해 제한되었다. 또한, 이식 세포의 생존, 분화, 및 프로세스 확장의 추적이 최적화되지 않았다. 마지막으로, 이전의 연구에서, 배양 된 쥐의 NSCs의는 일반적으로 운명이 특정 세포 형태로 구동되지 않는 한, 오히려 신경보다 부상 척수에 이식 할 때 교세포로 분화하는 것으로보고되었다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 심한 SCI의 사이트에 NSCs의 생존, 통합 및 차별화를 개선하기 위해 새로운 방법을 개발했다. NSCs의 갓 녹색 플로리다를 표현하는 안정적인 형질 전환 피셔 344 쥐 라인에서 배아 일 14 척수 (E14)에서 분리되었다uorescent 단백질 (GFP)과는 성장 인자를 함유 피브린 매트릭스에 삽입 하였다; 병변 캐비티 그라프 세포를 유지하고 세포 생존을 지원하는 것을 목표로 제형. 섬유소 / 성장 인자 칵테일 NSCs을함으로써 염증의 피크 기간을 피하고 2 주 흉부 레벨 3 (T3) 완전 척수 transections 후 이식되었다. 결과 이식은 완전히 병변 구멍을 채워 호스트 척추 현저하게 장거리 코드 및 아교로 축삭을 확장 모두 신경 세포로 분화. GFP를 표현하는 교양 인간 NSCs의의 이식은 유사한 연구 결과의 결과. 따라서, 방법은 신경 줄기 세포 이식, 생존과 생체 내 연구 결과의 분석을 향상시키기 위해 정의된다.

GFP 면역 조직 라벨이 접목 쥐 NSCs의는 병변 / 호스트 마진에 부착하고없는 빈 병변 사이트의 대부분을 떠나, T3의 절개 사이트에서 가난하게 살아 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) (섬유소 매트릭스와 성장 인자가 결여)에 재현 탁 것을 보여줍니다 이식 세포 (그림 2A). 단독 피브린 매트릭스와 공동 그래프트 NSCs의 경우의 생존을 향상하지만 그라프 완전히 큰 병변 캐비티 (데이터는 도시?...

Watch this Scientific Journal Video about Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury at JoVE.com

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

성장 인자를 함유하는 피브린 매트릭스는 완전한 척수 절개 부위로 그라프 신경 줄기 세포를 유지하기 위해 사용되었다. 이식 세포가 완전히 병변 캐비티를 채우고 장거리 호스트 척수로 축삭을 확장 신경 세포를 포함한 여러 신경 세포 유형으로 분화.

중증 척수 손상 후 섬유소 및 성장 인자 칵테일 신경 줄기 세포의 생존 및 분화 촉진

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

promotion-survival-differentiation-neural-stem-cells-with-fibrin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.3K 조회수.  Veterans Administration Medical Center, San Diego.  성장 인자를 함유하는 피브린 매트릭스는 완전한 척수 절개 부위로 그라프 신경 줄기 세포를 유지하기 위해 사용되었다. 이식 세포가 완전히 병변 캐비티를 채우고 장거리 호스트 척수로 축삭을 확장 신경 세포를 포함한 여러 신경 세포 유형으로 분화. 

비디오: Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

성인 Hippocampal 북극 그라운드 다람쥐 신경 줄기 세포의 성장과 분화

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the demyelinating disease Multiple Sclerosis (MS). We have shown that transplantation of NSCs into the spinal cords of sick mice results in a significant improvement in both remyelination and in clinical outcome. Cell replacement therapies for the treatment of chronic neurologic diseases are now a reality and in vivo models are vital in understanding the interactions between the engrafted cells and host tissue microenvironment. This presentation provides an adapted method for transplanting cells into the spinal cord of JHMV-infected mice. In brief, we provide a procedure for i) preparation of NSCs prior to transplant, ii) pre-operative care of mice, iii) exposure of the spinal cord via laminectomy, iv) stereotactic injection of NSCs, and iv) post-operative care.

The transplantation of mouse neural stem cells (NSCs) into the spinal cords of mice with established demyelination is detailed. The preparation of NSCs, the laminectomy of thoracic vertebra 9 (T9), and transplantation of NSCs is outlined along with the pre- and post-operative care of the mice.

Neurotropic 마우스 간염 바이러스에 감염된 마우스의 척수 코드에 마우스 신경 줄기 세포의 이식 외과

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

측면 유체 타악기 : 마우스의 외상성 뇌 손상 모델

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

이후 Wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜<em&gt; 제자리에서</em&gt; 애벌레 바다 장어의 하이브리드

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied in vitro using the neurosphere assay. This colony-forming assay is a powerful tool to study the response of NSCs to exogenous factors in a dish; however, this can also be used to study the effect of in vivo manipulations with the proper understanding of the strengths and limitations of the assay. One manipulation of the clinical interest is the effect of injury on endogenous NSC activation. Current models of spinal cord injury provide a challenge to study this as the severity of common contusion, compression, and transection models cause the destruction of the NSC niche at the site of the injury where the stem cells reside. Here, we describe a minimal injury model that causes localized damage at the superficial dorsolateral surface of the lower thoracic level (T7/8) of the adult mouse spinal cord. This injury model spares the central canal at the level of injury and permits analysis of the NSCs that reside at the level of the lesion at various time points following injury. Here, we show how the neurosphere assay can be utilized to study the activation of the two distinct, lineally-related, populations of NSCs that reside in the spinal cord periventricular region - primitive and definitive NSCs (pNSCs and dNSCs, respectively). We demonstrate how to isolate and culture these NSCs from the periventricular region at the level of injury and the white matter injury site. Our post-surgical spinal cord dissections show increased numbers of pNSC and dNSC-derived neurospheres from the periventricular region of injured cords compared to controls, speaking to their activation via injury. Furthermore, following injury, dNSC-derived neurospheres can be isolated from the injury site &#8212; demonstrating the ability of NSCs to migrate from their periventricular niche to sites of injury.

Here, we demonstrate the performance of a minimal spinal cord injury model in an adult mouse that spares the central canal niche housing endogenous neural stem cells (NSCs). We show how the neurosphere assay can be used to quantify activation and migration of definitive and primitive NSCs following injury.

최소한의 척수 상해의 마우스 모델에서 내 인 성 신경 줄기 세포 활성화 평가 Neurosphere 분석 결과

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Sialoglycan의 신진 대사 표지에 의하여 1 차적인 신경 줄기 및 전구 세포의 세포 표면 마커를 확인

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

척수와 디딜 방 아에 활동 기반 교육 부상 Wistar 쥐

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...