우리는 이미지 처리 및 분석 조언 데니스 워드 컨트리의 .. 감사합니다, 데이비드 W. Silversides 그의 실험실에서 Gata4p [5킬로바이트-GFP 마우스 라인이 생성되었습니다. 필론 실험실에서 연구를 CIHR, NSERC, FRQS 및 FRQNT에 의해 투자된다.

윤리 문 마우스를 포함하는 실험은 의학 연구에 사용 된 동물의 관리 및 조작을위한 동물 보호 지침의 캐나다 협의회 다음을 수행 하였다. 동물의 조작을 포함하는 프로토콜은 몬트리올 퀘벡 대학의 기관 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (위원회 (CCT) Institutionnel 드 보호 데 Animaux, 참조 번호 0512-R3-650-0513). 1. 콜라겐 젤의 제조 조직 문화 후드에서 멸균 방식으로 작업 할 수 있습니다. <ol><li> 표준 항생제 등을 포함한 5 배 DMEM (이글의 수정 필수 매체)를 준비합니다. 20 ㎖의 물에 DMEM 분말과 탄산 수소 나트륨의 0.925 g의 3.37 g을 녹인다. 0.22 μm의 필터를 통해 전달하여 소독. 무균 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 멸균 열 불 활성화 된 소 태아 혈청 25 ㎖의 2.5 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 보관 </li><li> 얼음에서 800 μl를 혼합완전한 배 DMEM 600 ㎕의 1 N NaOH를 17 ㎕의 콜라겐 I 용액 (0.02 N 아세트산, 필터 소독에 3.77 ㎎ / ㎖). 3 ㎖의 최종 부피로 멸균 수로 희석. 믹스 관련 성장 인자를 포함합니다. 우리는 일반적으로 장내 NCC 마이그레이션을 자극하는 10 NG / ㎖에서 GDNF를 사용합니다. </li><li> 24 - 웰 플레이트의 단일 행의 각 웰 예금 480 μL. 거품을 피하십시오. 나머지 행은 세포 이동의 다른 성장 인자의 효과를 테스트하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 콜라겐은 37 ℃에서 멸균 배양기에서 1 시간 이상을 중합하자 </li></ol> 2. 동물 (16)의 해부 <ol><li> 교배를 설정하고 다음 날 아침에 질 플러그를 확인합니다. 일 E0.5는 질 플러그가 발견되는 일 정오되는 여성을 격리하며 E12.5 12 시까 지 일을 기다려야. </li><li> 이소 플루 란으로 임신 한 쥐를 마취 및 CO 2 흡입에 의해 안락사. </li><li> 70 % 에탄올로 마우스 스프레이. 복부의 리프트친척 및 해부 가위로 복부에 구멍을 엽니 다. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS (인산염 완충 식염수)로 채워진 유리 페트리 접시에 자궁을 제거합니다. 각각의 배아 주입 사이트를 분리하기 위해 가로 방향으로 개별 deciduum의 부종과 자궁을 잘라. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS로 가득 다른 유리 페트리 접시에 따로 따로 각 주입 사이트에서 작동합니다. 해부 현미경 하에서 자궁 근육층을 제거하는 미세 집게를 사용한다. </li><li> 배아를 나타 내기 위해 내장 난황과 양막을 엽니 다. 그들이 개발 창자 고리로 연결되었다는로, 태반 / 내장 난황에 배아를 결합하는 혈관을 절단하는 경우주의하십시오. </li><li> 목에서 배아의 머리를 절단. </li><li> 그냥 어두운 붉은 색, 간 이상, 태아의 복강에 닫힌 집게를 삽입하고 복부 구멍에 횡단 구멍을 만들기 위해 (압력을 적용 중지) 자체의 집게가 열려하자. 향해 열린 집게를 아래로 당겨완전히 복부를 열 수있는 배아의 뒤쪽 끝. </li><li> 간 뒤에 결합 조직을 잡고 (콜론 항문에 부착) 내장을 파괴하지 않도록주의하고, 복부 밖으로 내장을 빼냅니다. </li><li> 배아의 나머지 부분에서 용기를 무료로 결장을 잘라. 컷 콜론의 임의의 위치에서 할 수있다. 이후의 꼬리 부분을 예약. </li><li> 맹장의 결합 조직, 내장의 다음 나머지를 애타게. 그렇게하는 동안 장내 상처하지 않도록주의하십시오. </li><li> 약간의 위험이있는 경우에는 간, 위 (소장의 주동이의 끝)뿐만 아니라 mesonephros 성기 능선을 버려야. </li><li> 소장을 분리합니다. 또, 대장을 잘라 내지 않도록주의하십시오. 지금부터, 창자 조직의 rosrrocaudal 방향은 주동이의 끝에 존재하는 날카로운 곡선을 사용하여 추적 할 수 있습니다. EM 전에 가능한 한 짧은 시간 동안 실온에서 PBS에 소장 남기기침구 (단계 3.3 참조). </li><li> 마지막으로, 정확하게 배아 발달의 단계를 결정하기 위해 각각의 배아에 대한 꼬리 somites의 수를 기록한다. </li></ol> 3. 배아 창자의 단면 <ol><li> 배아 해부 진행하기 전에 100 ㎖의 PBS (인산염 완충 식염수)에 1.5 g 아가로 오스를 녹여 50 ℃로 유지 </li><li> 부어 삽입 금형에 용융 아가로 오스 (예를 들어, 약 1 / 4 튜브 벽의 절제하는 길이 절단 된 2 ML의 microcentrifuge 관을 폐쇄). 아가로 오스는 약 42 ~ 45 ° C의 열을 식히, 그것은 터치에 약간 따뜻해야한다. </li><li> 다만 아가로 오스 응고하기 전에 배아 소장을 포함 (이것은 집게 팁으로 평가 될 수 있으며, 주변에 36 ~ 38 ° C 발생)을. 접힌 주동이의 말에 집게로 장을 들고, 금형의 길이를 따라 아가로 오스를 통해 매우 천천히 잡아 당깁니다. 이것은 바로 아가 세트 동안 창자를 유지하는 데 도움이됩니다. T 릴리스즉시 이동하고 저항하기 시작 실행합니다. 창자의 주동이의 - 꼬리 방향을 확인합니다. </li><li> 아가로 오스가 완전히 설정 한 보장하기 위해, 냉장고 2-3분에 금형을 넣어. </li><li> (열린 에펜 도르프 튜브 밖으로 밀어) 금형에서 아가로 오스를 꺼내. 블레이드, 소장에 수직 커트를하고, 양쪽 끝에서 초과 아가로 오스를 꺼내. </li><li> 진동 블레이드와 마이크로톰의 금속 무대에서 아래로 차단 아가 소장 /의 주동이의 끝을 붙입니다. 소장 / 아가로 오스 블록의 측면에 여분의 아가로 오스를 낸다. </li><li> 진동 마이크로톰 챔버의 금속 단계를 탑재합니다. 필요에 따라서는 소장 (따라서 블레이드에 수직) 가능한 한 수직 스테이지의 각도를 조정한다. 얼음처럼 차가운 PBS로 표본을 커버. 버퍼 표면에서 몇 mm까지 마이크로톰 블레이드를 가져옵니다. </li><li> 해당 전자를 보장 꼬리 가장 소장의 200 ㎛ vibratome 가로 컷을 만드는ACH 아가로 오스 조각은 전체 장 섹션이 포함되어 있습니다. </li></ol> 4. 장내 외​​식 문화 <ol><li> 부드럽게 잘 각각의 중앙을 향해 한 조각을 배치, 집게로 콜라겐 젤에 갓 잘라 소장 / 아가로 오스 조각 평면을 예금. </li><li> 이식편 중 NCC의 마이그레이션을 할 수 있도록, 습도 5 % CO 2 분위기에서, 37 ° C 3 일간 배양한다. </li><li> 집게 매우 부드럽게 콜라겐 겔 떨어져 소장 / 아가로 오스의 조각을 가져 가라. 아래의 젤이 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> 세포의 이동 패턴이 교란되지 않도록하기 위해 후속 배양 및 세척 단계에서 직접 콜라겐 겔을 만지지 마십시오. 실온에서 잘 1 시간 당 (PBS에서) 4 % PFA (파라 포름 알데히드)의 500 μL로 수정합니다. </li><li> 물론 당 DAPI 500 μL (4 &#39;, 6 - diamidino -2 - 페닐 인돌) 솔루션 (PBS에서 5 ㎍ / ml)로 정착을 교체하고 실온에서 10 분 알을 품다. </li><li> 잘 배 각각의 세척5 분 동안 PBS 500 μL와. </li><li> 각 웰 내의 콜라겐 겔에 포함 된 형광 세포 (GFP 및 DAPI 채널)의 사진. </li></ol> 5. 이미지 분석 우리는 이식편 배양 한 후 생성 된 이미지를 처리하고 정량화 ImageJ에 17를 광범위하게 사용했다. <ol><li> 형광 세포 사진과 같은 배율에서 마이크로 미터 슬라이드 이미징에 의해 시작합니다. (직선 도구를 사용하여) 픽셀 1 미크론의 길이를 측정한다. </li><li> (/ 설정 규모를 분석, 픽셀 / 마이크론의 입력 번호) 규모를 설정합니다. </li><li> 각 GFP의 형광 사진을 위해, 8 비트 그레이 스케일 (Image/Type/8-bit)로 이미지 형식을 변경합니다. </li><li> 신호 (이미지 / 조정 / 밝기 / 명암 ​​대비)의 강도를 조정합니다. </li><li> 필요 (프로세스 / 배경 빼기, 롤링 볼 반경을 조정)하면 배경 잡음을 뺍니다. </li><li> 세포와 세포 덩어리 (이미지 / / 임계 값을 조정), 강조하기 위해 임계 값을 설정합니다N 덩어리 (공정 / 진 / 유역을) 분할하는 분수령을 적용합니다. </li><li> 관심 영역 (ROI)을 지정하고 세포 수의 통계를 생성하는 입자를 분석 (입자 분석 / 분석, 설정 크기 최소 남아있는 픽셀을 제외). </li><li> 의 Feret의 직경 (설정 / 측정 분석)를 포함하는 측정 옵션을 설정합니다. </li><li> 그룹의 ROI와의 Feret의 직경을 결정하기 위해 전체로 측정, 세포의 확산의 표시 (/ 도구 / ROI 관리자 / 더 / 또는 다음 ROI 관리자 추가 / ROI 관리자 / 측정 분석). </li></ol>

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우리는 우리의 생체 이식편 배양 기술은 정확하게 GDNF의 존재에 장내 NCC 이주 가능성을 정량화하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 이러한 정확한 정량이 크게 11,12,15 이전에 설명 된대로, 200 ㎛ 두께의 vibratome 창자 부분을 사용하는 대신 대략적인 크기의 큰 조각에 의해 촉진된다. 사실, 이것은 우리가 재현성이 높은 환경에서 세포의 적절한 수와 함께 작업 할 수 있?...

신경 능선 세포 (NCC)의 배아를 개발하는 동안 많은 유도체를 형성하는 척추 동물에 고유 한 과도 세포 유형입니다. 이 세포 집단이 아닌 신경 외배엽 1에 인접한 신경 판의 경계에서 발생한다. neurulation 동안, 성형 신경관의 등쪽 가장자리를 따라 신경 판의 장소 NCC의 굽힘. NCC는 분리하는 멀리 신경 튜브에서 마이그레이션, 상피 - 간엽 전환을 받고있다. NCC들은 전체 장용 신경계 (ENS)를 형성 소화관 장벽에 내장 신경 신경절의 상호 연결된 네트워크를 포함하는 다양한 배아 구조를 정착. 최근 2,3 리뷰, 많은 유전자는이 복잡한 구조의 개발에 참여하고있다. ENS의 대부분은 (즉, 미래의 후뇌 / 척수 경계 정도) 미주 신경 튜브에서 NCC의 원래의 작은 수영장에서 파생 4.이 신경 전구 세포는 쥐의 배아 일 (E) 9.0 주위에 foregut에 도달 약 e15.0 전체 배아 창자를 식민지 때까지 용기의 중간 엽에서 꼬리 쪽 마이그레이션 할 수 있습니다. 대장의 신경 전구 세포의 작은 부분 집합은 최대 맹장 4 반대 방향으로 후방 창자 침입 성례 NCC에 의해 제공됩니다. 미주와 성례의 두 NCC가 필요 여러 마이그레이션, 핵 확산, ENS의 완전한 형성을 보장하기 위해 생존과 분화 촉진 단서.을 이와 관련, 동물 모델 - 특히 유전자 변형 생쥐는 - 여러 가지 중요한 세포 외 리간드의 식별 수단이되었습니다 GDNF (아교 세포 유래 신경 영양 인자), 엔도 텔린-3, 뉴로-3, BMP에 (뼈 형태 형성 단백질), 네트 린에게 뿐만 아니라, 음과 인도의 고슴도치 (쉬와 IHH) ~ 10. 이들 중, (형질 전환시 재 배열) 티로신 키나제 횡단 수용체 RET을 통해 신호 GDNF는 번째로 인식되고배아 창자 및 내 매력과 NCC의 지침에 대한 전자의 가장 중요한 통로. GDNF는 창자의 중간 엽에서 분비 및 RET (11, 12)을 표현 장내 NCC, 직접 chemoattractive 인 시공간으로 제어 rosrrocaudal 구배를 형성한다. 다른 기능 사이에, ENS는 장 벽에 부드러운 근육과의 상호 작용을 통해 소화 기관 내에서의 움직임을 조절한다. Hirschsprung의 질병에있는 장 결과의 말단 부위에있는 신경 중추의 부재 : 영향을받는 부분의 토닉 수축 막힘, 소화 물질의 상류 축적과 창자와 복부의 거대한 팽창에 이르게한다. Hirschsprung 병은 약 5,000 정상 출산을 발생합니다. 장내 NCC의 rostro - 꼬리 이주 패턴은 Hirschsprung의 질병의 원인에 대한 주요 기여 요인이 될 것으로 생각됩니다. NCC와 B의 마지막 부분을 마이그레이션하는 소스의 결장, 먼정착 할 owel는 ENS 형성의 결함에 가장 민감하다. 장내 NCC 마이그레이션에서의 중요한 역할에 따라, GDNF / RET 신호의 중단 Hirschsprung의 질병 (13)의 주요 알려진 유전 적 원인이다. [5킬로바이트-GFP 14 Gata4p 이름 - - 철새 NCC는 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시되는 더 나은 NCC와 ENS 개발을 연구하기 위해, 우리는 유전자 변형 마우스 라인을 생성합니다. 우리는 다음에 지금과 같은 GDNF 등의 다양한 성장 인자의 존재에 장내 NCC 마이그레이션 가능성의 정확한 정량화 할 수 있습니다 다른 그룹 11,12,15에서 출판 작업에서 적응 생체 세포 이동 분석을, 완성.

<table><tbody><tr><td>DMEM powder</td><td>Wisent</td><td>219-010-XK</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td>Biotechnology grade</td></tr><tr><td>Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin solution, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Wisent</td><td>095-150</td><td>High quality grade</td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>BD biosciences</td><td>354236</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Bioshop</td><td>SHY700</td><td>Diluted from 10 N stock then sterile-filtered</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Cedarlane</td><td>CLCYT305</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 24-well Plate</td><td>BD biosciences</td><td>353047</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>089515</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass Petri dish</td><td>VWR</td><td>89000-306</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>Cell culture grade</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td>Biotechnology grade</td></tr><tr><td>Surgical blade</td><td>Feather</td><td>21</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>All Purpose Instant Krazy Glue Pen</td><td>Krazy Glue</td><td>KG824</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HM 650V Vibrating-Blade Microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>920110</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;Table of specific reagents and equipment.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

a quantitative cell migration assay for murine enteric neural progenitors

신경 능선 세포 (NCC)는 등의 신경관에서 유래 및 개발 척추 동물의 배아에 걸쳐 광범위하게 마이그레이션 과도 다 능성 세포 집단이다. 말초 뉴런 및 아교를 제공 할뿐만 아니라, NCC는 멜라닌 세포뿐만 아니라 부교감 얼굴 골격의 대부분을 생성한다. NCC 마이그레이션 및 차별화 신경 튜브 및 지역에 별개의 세포 외 신호에 대한 노출을 따라 자신의 축 원점의 조합에 의해 제어된다. 세포 외 리간드의 이러한 기여는 장용 신경계 (ENS), 복잡한 상호 연결 (다른 것들 사이에) 로컬로 제어하는​​ 신경 중추의 네트워크 창자 근육 운동과 장 운동의 형성시에 특히 분명하다. 꼬리 패션에 주동이의 - - 미래의 창자의 전체 길이를 ENS의 대부분은 정착하기 위해 긴 여행을 수행 NCC의 작은 초기 수영장에서 파생됩니다. 로 알려진 몇 가지 신호 전달 경로 중장내 NCC의 식민지에 영향을 미치는, GDNF / RET 신호가 가장 중요한 것으로 인식되고 있습니다. 사실, 창자의 중간 엽으로 RET 리간드 GDNF의 시공간으로 제어 분비 배아 창자 및 내 매력과 RET - 표현 장내 NCC의 안내를 주로 담당하고 있습니다. 여기, 우리는 GDNF 등 다양한 성장 인자의 존재에 장내 NCC 마이그레이션 가능성 정확한 정량화 할 수 찬란 NCC를 가진 유전자 변형 마우스 라인을 사용하고, 생체 세포 이동 분석에 대해 설명합니다.

다음과 같은 결과 (그림 1) 여기에 설명 된 기술로 얻을 수있는 대표입니다. 성장 인자 (즉, GDNF)의 사용은 GFP를 발현하는 장 이식편에서 그리고 콜라겐 겔에 장내 NCC (그림 2)의 이동을 자극한다. 일부 세포가 성장 인자의 부재하에 이식편 밖으로 나와 있지만, 이들은 주로 GFP-표지 아니며 패시브 엔트리를 나타낸다. 그것은이 조직이 여전히 크게 형광 세포에 의해 채...

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A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

우리는 다양한 성장 인자의 존재 하에서 장용성 신경 능선 세포 이동 전위의 정확한 정량을 허용 생체 세포 이동 분석을 제시한다.

쥐과 장내 신경 전구 세포에 대한 양이 세포 이동의 분석

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

a-quantitative-cell-migration-assay-for-murine-enteric-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K 조회수.  UQAM.  우리는 다양한 성장 인자의 존재 하에서 장용성 신경 능선 세포 이동 전위의 정확한 정량을 허용 생체 세포 이동 분석을 제시한다. 

비디오: A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

2D 및 3D 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

연구

생체공학

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during embryonic development that also commonly occurs in glioblastoma, the most frequent malignant brain tumor. EMT has also been observed in multiple carcinomas outside the brain including breast cancer, lung cancer, colon cancer, gastric cancer. EMT is centrally linked to malignancy by promoting migration, invasion and metastasis formation. The mechanisms of EMT induction are not fully understood. Here we describe an in vitro system for standardized isolation of cortical neural stem cells (NSCs) and subsequent EMT-induction. This system provides the flexibility to use either single cells or explant culture. In this system, rat or mouse embryonic forebrain NSCs are cultured in a defined medium, devoid of serum and enzymes. The NSCs expressed Olig2 and Sox10, two transcription factors observed in oligodendrocyte precursor cells (OPCs). Using this system, interactions between FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling involving Zeb1, Zeb2, and Twist2 were observed where TGF&#946;-activation significantly enhanced cell migration, suggesting a synergistic BMP-/TGF&#946;-interaction. The results point to a network of FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling to be involved in EMT induction and maintenance. This model system is relevant to investigate EMT in vitro. It is cost-efficient and shows high reproducibility. It also allows for the comparison of different compounds with respect to their migration responses (quantitative distance measurement), and high-throughput screening of compounds to inhibit or enhance EMT (qualitative measurement). The model is therefore well suited to test drug libraries for substances affecting EMT.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

발생학

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

아가로 오스 겔 기반 Microfluidic 장치를 사용 신경 줄기 세포의 운동성 평가

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

생물학

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

신경과학

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

외부 응용 직류 전기 분야에 신경 전구체 세포 마이그레이션 속도론 분석을위한 Galvanotaxis 분석

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

만성 EAE와 마우스의 신경 줄기 / 전구 세포의 전신 주입

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

면역학 및 감염병학

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

설치류 Neuroblasts의 Nucleofection는 Neuroblast 마이그레이션을 연구하는<em&gt; 체외</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Visualizing Neuronal and Glial Cell Dynamics in the Developing Mouse Brain

Time-Lapse Imaging of Migrating Neurons and Glial Progenitors in Embryonic Mouse Brain Slices

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. This process is crucial for proper brain function, and its dysregulation can result in neurodevelopmental and psychiatric disorders after birth. In fact, many genes responsible for these diseases have been found to be involved in this process, and therefore, revealing how these mutations affect cellular dynamics is important for understanding the pathogenesis of these diseases. This protocol introduces a technique for time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors in brain slices obtained from mouse embryos. Cells are labeled with fluorescent proteins using in utero electroporation, which visualizes individual cells migrating from the ventricular zone with a high signal-to-noise ratio. Moreover, this in vivo gene transfer system enables us to easily perform gain-of-function or loss-of-function experiments on the given genes by co-electroporation of their expression or knockdown/knockout vectors. Using this protocol, the migratory behavior and migration speed of individual cells, information that is never obtained from fixed brains, can be analyzed.

저자 스포트라이트: Exploring Cell Migration and Gene Roles in the Developing Brain

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. Many genes are involved in this process. This protocol introduces the technique for the time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain ...