Wir danken Denis Flipo für die Bildverarbeitung und Analyse Beratung und David W. Silver in dessen Labor die Gata4p [5 kb]-GFP-Mauslinie generiert wurde. Die Forschung im Labor wird von Pilon CIHR, NSERC, FRQS und FRQNT finanziert.

Ethik-Erklärung Experimente mit Mäusen wurden folgende Kanadischer Rat der Tierpflege-Richtlinien für die Versorgung und Manipulation von Tieren in der medizinischen Forschung durchgeführt. Protokolle, die die Manipulation der Tiere wurden von der Ethikkommission der Universität von Quebec in Montreal genehmigt (Comité institutionnel de Protection des Animaux, Referenznummer 0512-R3-650 bis 0513). 1. Herstellung von Kollagen-Gels Arbeiten Sie in einem steril unter einer Gewebekultur Kapuze. <ol><li> Bereiten Sie komplette 5x DMEM (Eagle modifiziertem essentiellen Medium) einschließlich Standard-Antibiotika. Man löst 3,37 g DMEM-Pulver und 0,925 g NaHCO 3 in 20 ml Wasser. Sterilisiert, indem sie durch ein 0,22 um-Filter. Hinzufügen von 2,5 ml sterilem 100x Penicillin / Streptomycin und 25 ml sterile hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum. Lagern bei 4 ° C </li><li> Auf Eis, mischen Sie 800 ulvon Collagen-I-Lösung (3,77 mg / ml in 0,02 N Essigsäure, filtersterilisiert), 600 ul 5x vollständigen DMEM und 17 &amp;mgr; l 1 N NaOH. Verdünnt mit sterilem Wasser auf ein Endvolumen von 3 ml. Fügen Sie relevanten Wachstumsfaktoren in der Mischung. Wir verwenden in der Regel GDNF bei 10 ng / ml zu ente NCC Migration anzuregen. </li><li> Kaution ca. 480 ul in jede Vertiefung einer einzelnen Zeile in einer 24-Well-Platte. Vermeiden Sie Luftblasen. Die restlichen Zeilen verwendet werden, um die Wirkung anderer Wachstumsfaktoren auf die Zellmigration testen. </li><li> Das Kollagen zu polymerisieren lassen mindestens 1 Stunde in einem sterilen Inkubator bei 37 ° C. </li></ol> 2. Präparation der Tiere 16 <ol><li> Richten Sie Paarungen und überprüfen Vaginalpfropf am nächsten Morgen. Tag E0.5 als Uhr am Tag der vaginale Stecker gefunden wird, isolieren die weibliche und warten Sie 12 Tage bis E12.5. </li><li> Anesthetize schwangere Mäuse mit Isofluran und einschläfern durch CO 2-Inhalation. </li><li> Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Heben Sie die Bauch skin und öffnen Sie den Bauch Hohlraum mit Dissektionsscheren. </li><li> Entfernen der Gebärmutter in eine Glaspetrischale mit eiskaltem PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) gefüllt. Schneiden Sie die Gebärmutter quer zwischen den einzelnen deciduum Schwellungen, jeden Embryo Implantationsstelle zu isolieren. </li><li> Die Arbeiten an jeder Implantationsstelle separat in einem anderen Glaspetrischale mit eiskaltem PBS gefüllt. Unter einem Binokular, feinen Pinzette verwenden, um die Muskelschicht der Gebärmutter zu entfernen. </li><li> Öffnen Sie die viszerale Dottersack und Amnion, um den Embryo zu offenbaren. Achten Sie beim Abtrennen der Blutgefäße Beitritt der Embryo mit der Plazenta / viszeralen Dottersack, da sie mit den Entwicklungs Darm verflochten. </li><li> Sever Kopf des Embryos am Hals. </li><li> Legen Sie eine geschlossene Zange in der Bauchhöhle des Embryos, knapp über dem dunklen rot gefärbten Leber und lassen Sie die Zange geöffnet von sich selbst (mehr anwenden Druck), um eine Queröffnung in den Bauch Hohlraum zu machen. Ziehen Sie die Zange geöffnet nach unten in Richtungdas hintere Ende des Embryos, um den Bauch vollständig zu öffnen. </li><li> Schnappen Sie sich das Bindegewebe hinter der Leber und aus dem Bauch ziehen den Mut, man aufpassen, nicht zu brechen, den Darm (der Dickdarm bis zum Anus beigefügt). </li><li> Schneiden Sie den Doppelpunkt, um die Eingeweide aus dem Rest des Embryos zu befreien. Der Schnitt kann an jeder Stelle entlang des Dickdarms werden. Reservieren Sie den Schwanzteil für später. </li><li> Herauszuarbeiten, die das Bindegewebe von der Blinddarm, dann den Rest des Darms. Achten Sie darauf, um den Darm gewickelt, während dies zu tun. </li><li> Schneiden Sie die Leber und Magen (auf dem rostralen Ende des Dünndarms), sowie die Urniere und Genitalleisten, wenn einige vorhanden sind. </li><li> Isolieren Sie den Dünndarm. Auch darauf achten, nicht um den Darm zu ersticken. Von nun an kann der rosrrocaudal Ausrichtung des Darmgewebe unter Verwendung des auf der rostralen Ende vorhanden scharfen Krümmung verfolgt werden. Lassen Sie den Dünndarm in PBS bei Raumtemperatur für so kurze Zeit wie möglich vor emBettwäsche (siehe Schritt 3.3). </li><li> Schließlich notieren die Anzahl der Schwanz Somiten für jeden Embryo das Stadium der embryonalen Entwicklung genau zu bestimmen. </li></ol> 3. Schnitte von embryonalen Darm <ol><li> Bevor Sie mit Embryo Dissektionen fortfahren, schmelzen 1,5 g Agarose in 100 ml PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) und halten bei 50 ° C </li><li> Gießen Agarose in eine Einbettungsform geschmolzen (zB ein geschlossener 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die längs geschnitten auf etwa 1/4 der Rohrwand herausgeschnitten). Lassen Sie die Agarose abkühlen auf ca. 42-45 ° C, sollte es nur leicht warm an. </li><li> Betten Sie die embryonalen Darm, kurz bevor die Agarose erstarrt (dies kann mit einer Pinzette Tipps ausgewertet und 36-38 ° C um auftreten). Halten Sie den Darm mit einer Zange durch die gefaltete rostralen Ende, ziehen Sie es sehr langsam durch die Agarose entlang der Länge der Form. Dies hilft, den Darm gerade, während die Agarose-Sets zu halten. Lassen Sie die Tausgeben, sobald sie beginnt, zu wider bewegt. Verfolgen Sie die rostral-kaudale Ausrichtung der Darm. </li><li> Legen Sie die Form in einem Kühlschrank 2-3 Minuten, um zu gewährleisten, die Agarose wurde komplett eingestellt. </li><li> Nehmen Sie die Agarose aus der Form (indem Sie sie aus dem geöffneten Eppendorf-Röhrchen). Mit einer Klinge, nehmen Sie die überschüssige Agarose an beiden Enden, Kürzungen senkrecht auf den Darm. </li><li> Kleben Sie den rostralen Ende des Darms / Agarose blockieren Sie auf die Metallphase eines Mikrotom mit vibrierender Klinge. Schneiden Sie die überschüssige Agarose an den Seiten des Darms / Agarose-Block. </li><li> Montieren Sie den Metall Bühne, auf der vibrierenden Mikrotom Kammer. Wenn nötig, stellen Sie den Winkel der Bühne, so ist der Darm so senkrecht wie möglich (also senkrecht zur Klinge). Decken Sie die Probe mit eiskaltem PBS. Bringen Sie die Mikrotomklinge bis auf wenige Millimeter unter der Oberfläche Puffer. </li><li> Stellen Sie 200 um Vibratoms Querschnitte der Schwanz-die meisten Dünndarm, sicherzustellen, dass die each Agarose-Scheibe enthält eine vollständige Darmabschnitt. </li></ol> 4. Kultur der Darm Explantate <ol><li> Sanft legen das frisch geschnittene Darm / Agarose-Scheiben flach auf den Kollagen Gele mit einer Pinzette, indem eine Scheibe in die Mitte von jedem gut. </li><li> Inkubiere 3 Tage bei 37 ° C in einer feuchten 5% CO 2-Atmosphäre, um die Migration von NCC aus dem Explantat ermöglichen. </li><li> Nehmen Sie die Darm / Agarose-Scheiben aus dem Kollagen-Gel sehr vorsichtig mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, um das Gel unter beschädigen. </li><li> Vermeiden direkt während der nachfolgenden Inkubation und Waschschritte, um Berühren der Kollagen-Gel, um sicherzustellen, dass die Zellmigrationsmuster nicht gestört wird. Fix mit 500 ul 4% PFA (Paraformaldehyd) (in PBS) pro Vertiefung 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Ersetzen Sie das Fixiermittel mit 500 ul DAPI (4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindol)-Lösung (5 pg / ml in PBS) pro Vertiefung und Inkubation 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie jede Vertiefung 3xmit 500 ul PBS für 5 min. </li><li> Fotografieren Sie die fluoreszierenden Zellen (GFP und DAPI-Kanäle) in der Kollagen-Gel in jedem gut eingebettet. </li></ol> 5. Bildanalyse Wir haben umfangreiche Verwendung von ImageJ 17 zu verarbeiten und zu quantifizieren, die nach Explantatkultur erzeugten Bilder. <ol><li> Beginnen Sie mit der Abbildung einer Mikrometer-Objektträger mit der gleichen Vergrößerung wie die fluoreszierenden Zell Fotografien. Messen Sie die Länge von einem Mikrometer in Pixeln (mit der Straight Line Tool). </li><li> Stellen Sie die Skala (Analyse / Set-Skala; Eingang Anzahl der Pixel / Mikron). </li><li> Für jedes Foto GFP-Fluoreszenz, ändern Sie das Bildformat auf 8-Bit-Graustufen (Image/Type/8-bit). </li><li> Passen Sie Intensität des Signals (Bild / Anpassen / Helligkeit / Kontrast). </li><li> Subtrahieren Sie die Hintergrundgeräusche, falls erforderlich (Prozess / Subtrahieren Hintergrund; stellen Sie den rollenden Ball Radius). </li><li> Stellen Sie eine Schwelle, um Zellen und Zellklumpen (Bild / Anpassen / Threshold), markieren Sie dieeinen Wende n anwenden, um die Klumpen (Process / Binary / Watershed) teilen. </li><li> Analysieren Teilchen Regionen von Interesse (ROI) zu spezifizieren und generieren Zellzahl-Statistik (Analyse / Analysieren Partikel; Set-Größe Mindest, um die verbleibenden Pixel auszuschließen). </li><li> Stellen Messoptionen zu Feret-Durchmesser (Analyse / Set Maße) enthalten. </li><li> Gruppe ROIs und messen als Ganzes der Feret-Durchmesser zu bestimmen, die Angabe der Zellausbreitung (Analysieren / Tools / ROI-Manager / Mehr / OR, dann ROI-Manager / Hinzufügen und ROI-Manager / Measure). </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF+Is+a+chemoattractant+for+enteric+neural+cells.">GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells.</a> Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).</li><li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease,+associated+syndromes+and+genetics:+a+review.">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li><li>Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir zeigen, wie unser Ex-vivo-Explantatkultur Technik kann verwendet werden, um genau zu quantifizieren ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von GDNF werden. Eine solche genaue Quantifizierung wird stark durch Verwendung von 200 um dicke Vibratoms Darmstücke statt große Stücke ungefähre Größe, wie zuvor beschrieben, 11,12,15 erleichtert. Tatsächlich ermöglicht uns das mit einer angemessenen Anzahl von Zellen in einem hoch reproduzierbare Einstellung zu arbeiten. Zu beachten ist, ermögli...

Neuralleistenzellen (NCC) sind eine Übergangszelltyp spezifisch für Wirbeltiere, die während der Embryonalentwicklung viele Derivate bildet. Diese Zellpopulation entsteht am Rand des neuronalen Platte, benachbart zu nicht-neuralen Ektoderm 1. Während Neurulation, Biegen der Neuralplatte NCC Orten entlang der dorsalen Rand der bildenden Neuralrohr. NCC laufen dann eine epitheliale-mesenchymale Transition, Trennung und die Migration weg von dem Neuralrohr. NCC besiedeln verschiedenen embryonalen Strukturen, einschließlich des Verdauungstraktes, wo sie den gesamten enterische Nervensystem (ENS) zu bilden, ein zusammenhängendes Netzwerk von Nervenknoten in der Darmwand eingebettet. Wie kürzlich Bewertung 2,3 haben viele Gene in der Entwicklung dieser komplizierten Struktur beteiligt. Die meisten der ENS wird aus einem kleinen Pool von NCC mit Ursprung aus dem Vagus Neuralrohr (dh rund um die potenziellen Hinterhirn / Rückenmark-Grenze) abgeleitet 4.Diese neuronalen Vorläuferzellen erreichen die Vorderdarm um embryonalen Tag (e) 9,0 bei Mäusen und dann kaudal wandern im Darm Mesenchym bis ca. EUR 15,0 um die ganze embryonalen Darm zu kolonisieren. Eine kleinere Teilmenge von Kolon neuralen Vorläuferzellen wird auch durch sakrale NCC, die den hinteren Darm in die entgegengesetzte Richtung bis zum Blinddarm 4 eindringen vorgesehen. Sowohl Vagus-und sakralen NCC erfordern mehrere migrations, Proliferation-, Überlebens-und Differenzierungsfördernde Hinweise, um vollständige Bildung des ENS zu gewährleisten. In dieser Hinsicht Tiermodellen - vor allem gentechnisch veränderte Mäuse - haben maßgeblich bei der Identifizierung von mehreren wesentlichen extrazellulären Liganden: GDNF (Glia-Zellen-derived neurotrophic factor), Endothelin-3, Neurotrophin-3, BMPs (Bone morphogenetische Proteine), Netrin sowie Sonic und Indian Hedgehog (Shh und Ihh) 10.05. Von diesen ist GDNF Signal durch die Transmembran-Rezeptor-Tyrosin-Kinase RET (während der Transfektion Rearranged) als th erkanntE kritischen Weg für die Anziehung und Führung von NCC nach und in der embryonalen Darm. GDNF ist durch den Darm ausgeschieden und Mesenchym bildet eine raumzeitlich gesteuert rosrrocaudal Gradienten, die direkt chemoattractive zu ente NCC, die ausdrücken, RET ist 11,12. Neben anderen Funktionen steuert der ENS Bewegung im Verdauungstrakt durch seine Wechselwirkung mit der glatten Muskulatur in der Darmwand. Abwesenheit von neuralen Ganglien im Anschlussbereich der Darm Ergebnisse in Hirschsprung-Krankheit: tonische Kontraktion des betroffenen Segments führt zu Verstopfung stromauf Anhäufung von aufgeschlossenen Material und massive Ausdehnung des Darms und Bauch. Hirschsprung-Krankheit tritt in etwa einem von 5.000 Lebendgeburten. Die rostro-kaudale Migrationsmuster von magensaft NCC ist vermutlich die wichtigsten Einflussfaktor auf die Ätiologie der Hirschsprung-Krankheit sein. Der Doppelpunkt, die am weitesten von der Quelle der Migration NCC und letzte Teil Bowel besiedelt zu werden, ist besonders anfällig für Mängel in der ENS-Bildung. In Übereinstimmung mit ihrer entscheidenden Rolle bei magensaftresistenten NCC Migration ist Störung der GDNF / RET Signalisierung der Haupt bekannte genetische Ursache von Morbus Hirschsprung 13. Um besser zu studieren, NCC und ENS Entwicklung, erzielten wir eine transgene Mauslinie - mit Namen Gata4p [5 kb]-GFP 14 -, in dem Migrations NCC mit Green Fluorescent Protein (GFP) markiert. Als nächstes perfektioniert ein ex vivo Zellmigrationsassay, durch andere Gruppen 11,12,15 aus veröffentlichten Arbeiten ausgelegt, die jetzt ermöglicht eine präzise Quantifizierung der ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren, wie GDNF.

<table><tbody><tr><td>DMEM powder</td><td>Wisent</td><td>219-010-XK</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td>Biotechnology grade</td></tr><tr><td>Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin solution, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Wisent</td><td>095-150</td><td>High quality grade</td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>BD biosciences</td><td>354236</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Bioshop</td><td>SHY700</td><td>Diluted from 10 N stock then sterile-filtered</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Cedarlane</td><td>CLCYT305</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 24-well Plate</td><td>BD biosciences</td><td>353047</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>089515</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass Petri dish</td><td>VWR</td><td>89000-306</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>Cell culture grade</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td>Biotechnology grade</td></tr><tr><td>Surgical blade</td><td>Feather</td><td>21</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>All Purpose Instant Krazy Glue Pen</td><td>Krazy Glue</td><td>KG824</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HM 650V Vibrating-Blade Microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>920110</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;Table of specific reagents and equipment.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

a quantitative cell migration assay for murine enteric neural progenitors

Neuralleistenzellen (NCC) sind eine vorübergehende und multiZellPopulation, die aus dem dorsalen Neuralrohr stammt und ausgiebig wandert in den Entwicklungswirbeltierembryo. Neben der Bereitstellung von peripheren Neuronen und Glia, NCC erzeugen Melanozyten sowie die meisten der Schädel-Gesichtsskeletts. NCC Migration und Differenzierung wird durch eine Kombination ihrer axialen Ursprung entlang des Neuralrohrs und ihrer Ausrichtung auf regional unterschiedliche extrazelluläre Signale gesteuert. Ein solcher Beitrag der extrazellulären Liganden bei der Bildung des enterischen Nervensystem (ENS), einem komplexen Netzwerk von miteinander verbundenen neuralen Ganglien, die lokal steuert (unter anderem) Darmmuskelbewegung und Darmmotilität besonders deutlich. In einem rostral Schwanz fashion - - über die gesamte Länge des zukünftigen Darm meisten der ENS wird aus einer kleinen Anfangs Pool von NCC, die eine lange Reise, um zu kolonisieren verpflichten abgeleitet. Unter mehreren Signalwege bekanntbeeinflussen ente NCC Kolonisation wird GDNF / RET-Signalisierung als wichtigste anerkannt. Tatsächlich ist zeitlich und räumlich gesteuert Sekretion des RET-Liganden GDNF durch den Darm Mesenchym vor allem für die Attraktivität und Anleitung von RET-exprimierenden ente NCC nach und in der embryonalen Darm verantwortlich. Hier beschreiben wir ein ex vivo Zellmigrationsassay unter Verwendung einer transgenen Mauslinie, die über fluoreszenzmarkierten NCC, die genaue Quantifizierung von ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren, einschließlich GDNF ermöglicht.

Die folgenden Ergebnisse sind repräsentativ dafür, was mit dem hier beschriebenen (1)-Technik erhalten werden. Die Verwendung von Wachstumsfaktoren (dh GDNF) stimuliert die Migration der GFP-exprimierenden ente NCC aus dem Darm in das Explantat und Kollagen-Gel (Abb. 2). Obwohl einige Zellen kommen aus dem Explantat in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren, sind diese meist nicht GFP-markierten und für passive Eintrag. Es ist notwendig, die Scheibe von dem Darm Kollagen-Gel, um ...

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A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Wir stellen ein ex vivo-Assay, der die Zellmigration präzise Quantifizierung der ente Neuralleistenzellen Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren ermöglicht.

Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K Aufrufe.  UQAM.  Wir stellen ein ex vivo-Assay, der die Zellmigration präzise Quantifizierung der ente Neuralleistenzellen Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren ermöglicht. 

Serie: A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

Electric Field-gesteuerte gerichtete Wanderung von neuralen Vorläuferzellen in 2D-und 3D-Umgebungen

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Forschung

Biotechnik

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during embryonic development that also commonly occurs in glioblastoma, the most frequent malignant brain tumor. EMT has also been observed in multiple carcinomas outside the brain including breast cancer, lung cancer, colon cancer, gastric cancer. EMT is centrally linked to malignancy by promoting migration, invasion and metastasis formation. The mechanisms of EMT induction are not fully understood. Here we describe an in vitro system for standardized isolation of cortical neural stem cells (NSCs) and subsequent EMT-induction. This system provides the flexibility to use either single cells or explant culture. In this system, rat or mouse embryonic forebrain NSCs are cultured in a defined medium, devoid of serum and enzymes. The NSCs expressed Olig2 and Sox10, two transcription factors observed in oligodendrocyte precursor cells (OPCs). Using this system, interactions between FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling involving Zeb1, Zeb2, and Twist2 were observed where TGF&#946;-activation significantly enhanced cell migration, suggesting a synergistic BMP-/TGF&#946;-interaction. The results point to a network of FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling to be involved in EMT induction and maintenance. This model system is relevant to investigate EMT in vitro. It is cost-efficient and shows high reproducibility. It also allows for the comparison of different compounds with respect to their migration responses (quantitative distance measurement), and high-throughput screening of compounds to inhibit or enhance EMT (qualitative measurement). The model is therefore well suited to test drug libraries for substances affecting EMT.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

Ein Enzym- und Serumfreie Neural Stem Cell Culture Modell für EMT Investigation Geeignet für Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

Entwicklungsbiologie

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Biologie

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Neurowissenschaften

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

Schnelle Erkennung von Entwicklungsstörungen Phänotypen in menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

Die systemische Injektion von Neural Stem / Progenitor-Zellen in Mäusen mit chronischer EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Immunologie und Infektion

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucleofection von Nagerneuroblasten zu Neuroblast Migrationsstudie<em&gt; In-vitro-</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Visualisierung der Dynamik von neuronalen und glialen Zellen im sich entwickelnden Gehirn von Mäusen

Time-Lapse Imaging of Migrating Neurons and Glial Progenitors in Embryonic Mouse Brain Slices

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. This process is crucial for proper brain function, and its dysregulation can result in neurodevelopmental and psychiatric disorders after birth. In fact, many genes responsible for these diseases have been found to be involved in this process, and therefore, revealing how these mutations affect cellular dynamics is important for understanding the pathogenesis of these diseases. This protocol introduces a technique for time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors in brain slices obtained from mouse embryos. Cells are labeled with fluorescent proteins using in utero electroporation, which visualizes individual cells migrating from the ventricular zone with a high signal-to-noise ratio. Moreover, this in vivo gene transfer system enables us to easily perform gain-of-function or loss-of-function experiments on the given genes by co-electroporation of their expression or knockdown/knockout vectors. Using this protocol, the migratory behavior and migration speed of individual cells, information that is never obtained from fixed brains, can be analyzed.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der Zellmigration und der Rolle der Gene im sich entwickelnden Gehirn

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. Many genes are involved in this process. This protocol introduces the technique for the time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain ...