저자는 자신의 우수한 기술 지원, 공 초점 및 시간 경과 현미경에 대한 기술적 조언 안드레아스 Wodarz와 스테판 Heermann에 Chalid Ghadban 감사합니다. 저자의에 대한 관심의 충돌이 없습니다. 이 작품은 입는다하여 Forschergruppe 942 프로젝트 2 (FOR942 BI 703/3-1)에서 독일 연구 협회 (DFG)에 의해 투자된다. 바이엘 재단 (바덴 Württembergischer Krebspreis, 독일)와 의학부, 게오르그 8 월 - 대학 괴팅겐, 독일의 연구 프로그램에 의해.

이 새로운 모델은 이전에 출판의 Organotypic 해마의 뇌 조각의 접근 9-12의 적응이다. 변형 및 추가가 암세포 뇌 조직 상호 작용을 최적화하고 재현성을 보장하기 위해 도입되었다. 이 연구는 검토하고 지역 윤리위원회의 승인을 받았다. 동물은 의과 대학 괴팅겐에서 동물 보호에 대한 지침에 따라 신중하게 처리 하였다. 뇌의 Organotypic 슬라이스 공 배양은 두 단계로 세분화 할 수있다. 단계 하나의 Organotypic 뇌 조각의 준비입니다. 이 단계는 공동 배양 모델에서 종양 세포 준비 및 증착을 포함한다. 1. 뇌의 Organotypic 슬라이스 <ol><li> 0.2 MM의 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 포도당 4.5 ㎎ / ㎖로 보충 최소 필수 배지 (MEM)로 구성되는 해부 매체를 준비합니다. </li><li> 출생 후 하루 사이에 마우스 변형에서 쥐를 목을 베다6 및 8 (P6-8). </li><li> 무균 조건 하에서 두개골에서 빠르게 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 해부 매체로 전송. </li><li> 전체 뇌 섹션에서 정면 극과 소뇌를 제거합니다. </li><li> 수정하고 알아내는 접착제와 5 % 아가로 오스와 함께 무대에 뇌를 안정. </li><li> vibratome를 사용하여 350 ㎛의 두께로 가로로 뇌 단면을 조각. </li><li> 종과 나이에 따라, 하나의 마우스의 뇌에서 4-6 전체 뇌 조각을 수집합니다. </li><li> 50 % MEM 이루어진 배양액을 준비하고, 25 %의 행크 평형 염 용액 (HBSS), 25 % 정상 말 혈청 (NHS), 0.2 mM의 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 (시그마, 뮌헨 독일), 및 4.5 ㎎ / ㎖ 포도당. </li><li> 하단에 잘 재배 배지 1 ㎖로 여섯 잘 플레이트에 0.4 μm의 폴리 카보네이트 (polycarbonate) 트랜스 웰 막 삽입에 각각의 Organotypic 뇌 조각을 넣어. </li><li> humidifie에있는 문화의 Organotypic 뇌 조각의 하룻밤37 ° C의 배양기에서 5 % CO 2와 D의 분위기. </li></ol> 2. 조각 공 배양 모델 <ol><li> GFP 형질 전환 된 종양 또는 다른 세포 15 % RPMI 배지와 85 %의 ECM 젤로 구성된 20 μL 젤 매트릭스 (예를 들어, MCF-7-GFP 세포)의 10 5를 포함합니다. </li><li> 의 Organotypic 뇌 조각의 대뇌 피질의 영역에 직접 인접 멸균 금속 스페이서 (3.8 mm 직경)에 MCF-7-겔 매트릭스 믹스를 넣고 2 시간 동안 배양한다. </li><li> 스페이서를 제거하고 3D 종양 구형은 24-96 시간 동안의 Organotypic 슬라이스 공 배양 할 수 있습니다. </li><li> 매일 배지를 변경합니다. </li></ol> 3. 의 Organotypic 뇌 조각 공 배양의 성상 및 미세 아교의 면역 형광 염색법 <ol><li> 4 ℃에서 8 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드와의 Organotypic 뇌 조각의 공 배양을 수정 </li><li> 5 분 (0.5 % 트리톤 X-100으로 PBS) PBST로 슬라이스 공 배양을 씻는다. </li><li> 의 차단실온에서 1 시간 동안 PBST 정상 염소 혈청 (1:20)을 수행하여 amples. </li><li> 염소 항 - 마우스 TRITC (PBST에서 1:100) 염색 후 4 ° C에서 36 시간 동안 반 아교 섬유 성 산성 단백질 단일 클론 항체 (GFAP, PBST에서 1:200)와 뇌 조각의 공 배양을 배양하여 성상 세포를 얼룩 실온에서 1 시간 동안. </li><li> 5 분 PBST로 3 회 샘플을 씻으십시오. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 (PBST에서 1:100) ILB 4 알렉사 플 루어 647와 미세 아교 세포를 얼룩. </li><li> 실온에서 3 분 동안 DAPI와 뇌 슬라이스 공 배양 (1:1,000) Counterstain. </li><li> 마운트 및 DAKO 형광등 설치 매체와 뇌 조각의 공 배양을 커버 슬립. </li><li> 다음과 같은 평가 시스템에 따라 종양 침윤의 등급 평가 : + + = 1 / 3 - 2 / 3,,, + &lt;1 / 3 세포의 0 = 없음 침입 세포의 + + + ≥ 2 / 3를 (첫 번째 종양 플러그와 슬라이스 사이의 접촉 부분의 길이를 측정 한 후 측정을 fractio) 침입 세포에 의해 감지 접촉 명. </li></ol> 4. 폐해와 종양 세포 간의 상호 작용의 실시간 이미징 <ol><li> 라이카에서 실험을 수행하는 10 배 배율의 렌즈와 라이카 DFC (350) FX CCD 카메라에서 DMI 6000B 현미경 반전. </li></ol>

<ol>
	<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seed+and+soil+hypothesis+revisited--the+role+of+tumor-stroma+interactions+in+metastasis+to+different+organs.">The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs.</a> Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).</li><li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+metastasis.">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).</li><li>Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-related+inflammation.">Cancer-related inflammation.</a> Nature. 454, 436-444 (2008).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+organ+microenvironment+in+brain+metastasis.">The role of the organ microenvironment in brain metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).</li><li>Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+enhance+the+invasion+potential+of+glioblastoma+stem-like+cells.">Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells.</a> PloS one. 8, e54752 (2013).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+mechanistic+insights+and+clinical+challenges.">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12, 895-904 (2006).</li><li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies.">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).</li><li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis.">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+and+neuronal+damage:+differential+effects+of+THC,+AEA+and+2-AG+on+activated+microglial+cells+and+degenerating+neurons+in+excitotoxically+lesioned+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Cannabinoids and neuronal damage: differential effects of THC, AEA and 2-AG on activated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned rat organotypic hippocampal slice cultures.</a> Exp. Neurol. 203, 246-257 (2007).</li><li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures:+interface+method.">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li><li>Fuller, L., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rodent+hippocampal+slice+cultures.">Preparation of rodent hippocampal slice cultures.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4848 (2007).</li><li>Lorger, M., Felding-Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+changes+in+the+brain+microenvironment+during+initial+steps+of+breast+cancer+brain+metastasis.">Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis.</a> Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).</li><li>Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+hippocampal+slice+co-culture+system:+application+to+the+study+of+HIV-induced+brain+damage.">A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage.</a> J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).</li><li>Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mossy+fiber+pathfinding+in+multilayer+organotypic+cultures+of+rat+hippocampal+slices.">Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).</li><li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model.">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. , (2011).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J. Immunol. 188, 29-36 (2012).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+microglia.">Physiology of microglia.</a> Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).</li><li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2.">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).</li><li>Baumert, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathology-based+substrate+for+target+definition+in+radiosurgery+of+brain+metastases.">A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).</li><li>Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+metastasis+to+a+sanctuary+site.">The biology of metastasis to a sanctuary site.</a> Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+colonization+of+brain+tissue+by+breast+cancer+cells+in+a+Wnt-dependent+way.">Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way.</a> Glia. 58, 1477-1489 (2010).</li><li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain.">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459, 1005-1009 (2009).</li></ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

뇌 전이의 이전 조직 학적 조사는 특히 성상 세포와 미세 아교 세포 (13)의 거주자 glial 세포의 신속하고 과감한 변화를 보여 주었다. 암 세포와 이러한 변화와 상호 작용을 연구하기 위해,이 소설 공 배양 시스템은 매우 적합하다. 다른 연구 분야는 이미의 Organotypic 해마의 뇌 조각과 오랜 경험이 있습니다. 하나의 장점은 해마의 Organotypic 뇌 슬라이스 배양 장기 실험에 적합하다, 주에 실용적이고 효과적 일 동안 보존되어 있다는 점이다. 1991 년의 Organotypic 해마 슬라이스 시스템 Stoppini의 도입 이후, 폭넓게 퇴행성 질환의 연구, 예를 들어, 사용되어왔다. 따라서,이 혁신의 공 배양 시스템은 종양 생물학 9,11에있는 응용 프로그램의 범위와 잘 설립 접근 방식의 변경을 나타냅니다. 수정은 종양 침략 AF의 등급을 평가하는 우리에게 재현 모델을 제공인터페이스 방법에 의해 성장 terwards 문화 이상적 입체 구조를 필요로 실험에 적합하다. 몇 가지 기술은 다른 세포와의 Organotypic 해마 슬라이스를 공 배양하는 데 사용되었습니다. 이들은 대식 세포와 뇌의 Organotypic 슬라이스 (14) 사이의 간접적 인 시스템 및 해마 영역 (15)에서 두 개의 서로 다른 조각의 직접 공 배양이 (가) 있습니다. 신경 교종 집계는 뇌 조각 (16)와 공 배양되었다. 이러한 모델은 뇌 조각의 세포 및 분자 이벤트를 분석하는 데 사용될 수 있지만, 종양 세포, 미세 아교 세포 및 뇌 실질 간의 직접적인 생리적 접촉을 허용하지 않는다. 또한,이 방법은 골수 유래 주변 단핵구 / 대 식세포의 오염없이 미세 아교 세포의 관찰을 할 수 있습니다. CCR2 및 CX3CR1 트랜스 제닉 마우스 모델을 사용하기 때문에 그것이 단핵구 침입 상주 미세 아교 세포를 구별하기 어렵다는 사실에 중요한 개선자신의 유사한 특성 17,18,19에 따라. 암 세포의 뇌내 주입은 종양의 진행을 조사 할 수 있지만, 그것은 둘러싸여 대식 세포와 같은 세포가 뇌에 상주하는 미세 아교 세포 인구 또는 골수 유래 말초 단핵구 / 대 식세포 (17)에서 발생 여부에 많은 것을 말할 수 없습니다. Kettenmann의 팀은 미세 조작기 (20)와 뇌 조각으로 신경 교종 세포를 접종 관련의 Organotypic 뇌 조각 모델을 소개했다. 그러나, 주요 악성 신경 교종은 전이성 암에서 많은 관련이 다릅니다. 첫째, 악성 신경 교종은 중간 엽 기원하고, 종양 및 뇌 조직 사이에 경계와 같은 하나의 세포에 침입 / 신경계 이외의 전이 및 마이그레이션되지 않습니다. 반면 침윤성 성장은 일반적인 병적 특징, 그러한 암은 보통 마이그레이션 / 동료로서 침입. 세포를 아교 동안 두 번째로, 암은 종종 뇌의 상피 구조를 다시 시도(의사)에 의해 캡슐 뇌 조직에서 종양을 분리하려고. 생물학 및 형태 학적 특징을 고려하여, 악성 신경 교종 및 암의 전이 정말 비교할 수 없습니다. 이러한 이유로, 우리는 우리가 변경됨 뇌 슬라이스에 인접한 암종 세포 플러그를 주입하지만 공 배양하지 않는 공 배양 시스템을 개발 하였다. 더욱이, 우리는 미세 아교 세포가 종양 플러그를 입력하여 쉽게 명 시야 현미경에 의해 검출하고, 그 후 공 초점 현미경에 의해 확인 될 수 있음을 의미 소교 및 종양 플러그의 테두리에서 성상 세포의 축적을 관찰했다. 암 세포는 생체 내 상황에서 실물과 Baumert 뇌가 21 전이와 부검의 경우 63 %에 침투 영역을 발견 동료에 의해 ​​관찰에 필적 뇌 슬라이스로 침입. 때문에 누락 된 혈액 관류,이 문화에만 상주 식세포 / 미세 아교 세포가 있습니다. 또한, 때문에 Missing T 세포는, 그러므로, 부재는 알로 반응성 인간 암종 세포에서도 면역 적격 마우스 또는 쥐의 뇌 조각 (NMRI, B6, 또는 스타 (Wistar))와 공동 배양에 사용될 수있다. 이 누드 마우스 모델에 대한 대안이 될 수 있습니다. 4-5 슬라이스는 각 마우스로부터 획득 될 수 있기 때문에, 동물의 수는 현저하게 감소 기존 사출 모델과 비교하여, 요구된다. 또한, 동물은 전이성 질환의 장기간 고생하지 않기 때문에 반복적 22 수술 절차를 거치지 않는다. 이 공 배양 시스템으로, 우리는 암 세포에 의한 미세 아교 세포의 활성 및 암세포의 침윤을 촉진하는 능력을 증명하고있다. 또한, 이것은 우리의 지식, 미세 아교 세포가 적극적으로 암 세포 23을 수송하기 위해 발견 된 것은 이번이 처음이다. 이러한 모든 장점에도 불구하고, 공동 배양 시스템은, 참으로, 또한 한계가있다. 아직 체외입니다이전의 식민지로 전이의 단계를 누락 모델. 때문에 관류의 부족, 그것이 혈관 외 유출을 연구하는 것은 불가능하다. 따라서, 혈관 외 유출을 연구하는 다른 방법은 혈액 - 뇌 장벽 (22, 24)를 모방하는 생체 주입 모델 또는 변형 된 보이 덴 챔버 시스템 세포 외 매트릭스, HUVEC 및 성상을 사용하는 것이다. 뇌 슬라이스 공 배양 방법은 아직 많은 장점과 함께 신뢰할 수 있고 재현성 모델과 같은 군체의 분석과 같은 다양한 애플리케이션에 대한 잠재적 인 상주 세포의 역할에 초점을 특히. (예 : 면역 조직 화학, 공 초점 현미경 및 시간 경과 현미경과 같은) 다른 설치 기술과의 조합은 직접 세포 간 상호 작용의 조사를 지원합니다. 그것은 쉬운 대안과 다른 기술의 보완과 전이성 미세 환경에 의해 부과로 신호와 효과 조사에 대한 액세스를 제공합니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt,Germany</td>
			<td>24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt , Germany</td>
			<td>32360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>PAA Laboratories Inc., C&#246;lbe, Germany</td>
			<td>E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Pan Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum (NHS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>10091148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>B. Braum, Melsungen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica SM 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>BD Falcon, Heidelberg,Germany</td>
			<td>353090</td>
			<td>transwell membrane insert (0.4 &#956;m pore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM gel</td>
			<td>Trevigen, R&#38;D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany</td>
			<td>3432-005-01</td>
			<td>Basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic spacer</td>
			<td>Kig GmbG, Kirkel, Germany</td>
			<td>DIN 433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-lapse microscope and camera</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomy microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>Stemi SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, F(ab&#39;)2- TRITC</td>
			<td>Santa Cruz, Heidelberg, Germany</td>
			<td>SC3796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>132450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6&#39;-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride)</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent mounting medium</td>
			<td>DAKO, Glostrup, Denmark</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells

암의 뇌 전이 환자는 예후가 있습니다. 그러나, 전이성 부위 프로세스 간신히 특히 상주 (기질) 세포의 역할을 조사하고있다. 차 암의 연구도 예후 1,2에, 전이의 미세 환경의 영향을 보여줍니다. 특히 종양 관련 대 식세포 (TAM) 마이그레이션을 지원, 침입 및 확산 3. 흥미롭게도, 전이의 주요 대상 사이트는 CNS에 간 또는 미세 아교 세포에있는 쿠퍼 ​​세포와 같은 조직 특정 대식 세포를 가지고있다. 또한, 전이성 사이트도 성상 세포와 같은 다른 조직 특정 세포를 가지고있다. 최근, 성상 세포는 증식과 암세포 4,5의 지속성을 육성하기 위해 입증했다. 따라서, 이들 조직 특정 세포 유형의 기능은 뇌 전이의 6,7 과정에서 매우 중요한 것 같다. 이러한 관측에도 불구하고,그러나, 지금까지 직접 시야 현미경으로 특히 뇌 전이 형성 동안 아교 세포 반응을 시각화 할 수 생체 / 체외 모델에 적합하지 않습니다. 암 세포의 생체 내 실시간 영상 최근 자신의 뇌 식민지 동작 8을 보여 주었다. 그러나,이 방법은 매우 힘들고 비용이 많이 들고 기술적으로 복잡하다. 또, 동물 실험의 이러한 종류의 작은 시리즈로 제한되며 실질적인 (유리판의 주입에 의해, 종양 세포의 주입, 반복적 마취 및 장기 고정) 동물에 대한 스트레스와. 상주 세포와의 상호 작용이 아직 도시되지 않은 반면, 또한, 생체 내 이미징은 지금까지 암 세포의 시각화에 한정된다. 마지막으로, 면역 동물 내에서 인간의 암 세포의 조사는 8 불가능합니다. 이러한 이유로, 우리는 공 배양 시스템 consi 설립리겔 (3D 셀 영역)에 포함 된의 Organotypic 마우스 뇌 조각과 상피 세포의 고통. 3D 암종 세포 분야는 이웃하는 뇌 조직의 침입을 조사하기 위해 바로 옆 뇌 슬라이스 에지에 넣었다. 이 형광으로, 심지어 시야 현미경으로 glial 세포와 암 세포 사이의 형태 학적 변화와 상호 작용을 시각화하는 가능하게한다. 공 배양 실험 후 뇌 조직 또는 3D 세포 상체를 수집 할 수 있고, 또한 분자 분석 (예 : QRT-PCR, IHC, 또는 면역 블롯)뿐만 아니라, 공 초점 현미경으로 조사를 위해 사용됩니다. 이 방법은 뇌 조각에 대한 해로운 영향없이 일 살아있는 뇌 조직 내의 이벤트를 모니터링하는 데 적용될 수있다. 모델은 또한 선택적 억제 및 관련 유전자형의 뚜렷한 영향을 확인하기 위해 공여 조직으로부터 세포에 의해 상주 세포의 보충을 허용한다. 마지막으로, 공동 배양 모델은 실행 가능한 대안타겟 약리 조작을 테스트 할 때 생체 내 접근법.

첫째, 모든 사용 암 세포 (인간 : MCF-7 및 쥐 : 410.4)은의 Organotypic 마우스의 뇌 조각을 침공. 침입 종의 독립적 인 방식으로 응용 프로그램의 넓은 범위를 나타내는, 따라서 종 - 독립 (그림 1A)이었다. 또한, 미세 아교 세포뿐만 아니라 이전에 생체 시료 및 환자 (13)에 설명 된 계면에 축적 성상. 오랜 기간 동안 시간 경과 영상은 조각의 가능성을 제시 할뿐만 아니라 세포의 상호 작용을 관찰 할 수있는 좋은 플랫폼을 제공뿐만 아니라. 시간 경과 실험에 의해, 미세 아교 세포는 다시 암 세포도 뇌 조각 (그림 1B1-B2)를 침공, 3D 세포 구 동안 입력 기록되었다. 또한, 우리는 이전함으로써 암의 침공을 지원하기 위해 여전히 수수께끼의 메커니즘에 의해 암 세포를 수송하는 미세 아교 세포의 능력을 보여 주었다. 면역 형광 라벨링 기술을 사용하여, 우리침입 프로세스 동안 이들 세포 간의 긴밀한 상호 작용을 제안하는 뇌 조직 및 종양 세포 플러그 (도 1C-D)에서 두 종양 세포 및 간질 세포의 공동 현지화 (예, 미세 아교 세포 및 성상 세포)를, 기재. 다른 종의 유전자형과 균주의 세포를 연구하는 응용 프로그램의 넓은 범위를 보여주는 - 마우스의 뇌 조각이 인간 (그림 1C1-C3) 또는 쥐 (그림 1D1-D3) 암 세포를 하나 공 배양했을 때 대등 한 결과를 얻었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1.jpg" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" /> 그림 1. 마우스와 인간의 암 세포의 3 차원 회전 타원체와 뇌 조각의 공동 배양 모델. 마우스 유방암의 Organotypic 전체 뇌 슬라이스 공 배양에 암 세포 침윤) 정량세포주 410.4 또는 인간 유방암 세포주 MCF-7. 데이터는 N의 ≥ 38 각 그룹의 뇌 조각으로 세포의 침윤 정도의 비율을 나타냅니다. 이 두 그룹 사이에 유의 한 차이 (크루스 칼 - 월리스 시험). B) MCF-7-GFP 세포와 DAY2 (B1 대표 이미지의 Organotypic 전체 뇌 슬라이스 공 배양의 시간 경과 이미지)과 5 일 (B2)했다가 없었다 표시. CD) 공 초점 현미경 이미지는 암, 성상 세포와 미세 아교 세포의 동료를 보여 주었다. 두 성상 세포의 염색 (안티 GFAP-TRITC, 빨간색)와 미세 아교 세포 350 μm의 두께의 Organotypic 뇌 조각과 GFP 형질 종양 세포 플러그 (녹색)와 전체 공 배양의 (ILB4 - 알렉사 플 루어 647, 보라) : 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) 및 3D-410.4-GFP (D1-D3). 화이트 대시 뇌 조각과 종양의 침략 전면의 가장자리를 보여 주었다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 미세 아교 세포, 성상 세포의차 종양 colocalizations (C1 및 D1), 성상 세포 - 종양 colocalizations (C2와 D2)와 슬라이스 공 배양에있는 미세 아교 세포 종양 colocalizations (C3 및 D3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>

Watch this Scientific Journal Video about Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells at JoVE.com

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

암 세포와 뇌의 Organotypic 슬라이스 공 배양은 뇌 조직의 암 세포 침략의 과정에서 형광뿐만 아니라 시야 (비디오) 현미경으로 형태 학적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 이 모델 시스템은 전지 교환 및 보충 접근이 가능하며 조작 및 분석의 다양한 제공합니다.

뇌의 Organotypic 슬라이스와 암 세포의 3 차원 회전 타원체와 공 배양 시스템

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

coculture-system-with-an-organotypic-brain-slice-3d-spheroid

Research

JoVE Journal

Medicine

20.5K 조회수.  University of Göttingen.  암 세포와 뇌의 Organotypic 슬라이스 공 배양은 뇌 조직의 암 세포 침략의 과정에서 형광뿐만 아니라 시야 (비디오) 현미경으로 형태 학적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 이 모델 시스템은 전지 교환 및 보충 접근이 가능하며 조작 및 분석의 다양한 제공합니다. 

비디오: Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

C57BL/6J 마우스의 Stromal 셀 및 암종 세포 이식 내유

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

연구

의학

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

역 형성 갑상선 암의 동소 마우스 모델

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

약물 치료를 종양 미세 환경을 공부하고 대상에 대한 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 문화 시스템

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

종양 세포 이동 연구를위한 인간 Glioblastoma Organotypic Slice 문화 모델 및 항 침윤성 약물의 환자 특이 적 효과

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena described in those patients for whom a brain autopsy has been requested. Although the advancements of biomedical sciences and neuroimaging have revolutionized the neuropsychiatric field, they have also generated the misleading idea that brain autopsies have only a confirmatory value. This false idea created a drastic reduction of autopsy rates and, consequently, a reduced possibility to perform more detailed and extensive neuropathological investigations, which are necessary to comprehend numerous normal and pathological aspects yet unknown of the human brain. The traditional inferential method of correlation between observed neuropsychiatric phenomena and corresponding localization/characterization of their possible neurohistological correlates continues to have an undeniable value. In the context of neuropsychiatric diseases, the traditional clinicopathological method is still the best possible methodology (and often the only available) to link unique neuropsychiatric features to their corresponding neuropathological substrates, since it relies specifically upon the direct physical assessment of brain tissues. The assessment of postmortem brains is based on brain cutting procedures that vary across different neuropathology centers. Brain cuttings are performed in a relatively extensive and systematic way based on the various clinical and academic contingencies present in each institution. A more anatomically inclusive and symmetric bi-hemispheric brain cutting methodology should at least be used for research purposes in human neuropathology to coherently investigate, in depth, normal and pathological conditions with the peculiarities of the human brain (i.e., hemispheric specialization and lateralization for specific functions). Such a method would provide a more comprehensive collection of neuropathologically well-characterized brains available for current and future biotechnological and neuroimaging techniques. We describe a symmetric bi-hemispheric brain cutting procedure for the investigation of hemispheric differences in human brain pathologies and for use with current as well as future biomolecular/neuroimaging techniques.

Organized brain cutting procedures are necessary to correlate specific neuropsychiatric phenomena with definitive neuropathologic diagnoses. Brain cuttings are performed differently based on various clinico-academic contingencies. This protocol describes a symmetric bihemispheric brain cutting procedure to investigate hemispheric differences in human brain pathologies and to maximize current and future biomolecular/neuroimaging techniques.

인간의 건강과 병리학 적 뇌 조건을 연구에 절단 대칭 Bihemispheric 사후 뇌

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

Organotypic Slice Cultures as Preclinical Models of Tumor Microenvironment in Primary Pancreatic Cancer and Metastasis

Realistic preclinical models of primary pancreatic cancer and metastasis are urgently needed to test the therapy response ex vivo and facilitate personalized patient treatment. However, the absence of tumor-specific microenvironment in currently used models, e.g., patient-derived cell lines and xenografts, only allows limited predictive insights. Organotypic slice cultures (OTSCs) comprise intact multicellular tissue, which can be rapidly used for the spatially resolved drug response testing.
This protocol describes the generation and cultivation of viable tumor slices of pancreatic cancer and its metastasis. Briefly, tissue is casted in low melt agarose and stored in cold isotonic buffer. Next, tissue slices of 300 &#181;m thickness are generated with a vibratome. After preparation, slices are cultured at an air-liquid interface using cell culture inserts and an appropriate cultivation medium. During cultivation, changes in cell differentiation and viability can be monitored. Additionally, this technique enables the application of treatment to viable human tumor tissue ex vivo and subsequent downstream analyses, such as transcriptome and proteome profiling.
OTSCs provide a unique opportunity to test the individual treatment response ex vivo and identify individual transcriptomic and proteomic profiles associated with the respective response of distinct slices of a tumor. OTSCs can be further explored to identify therapeutic strategies to personalize treatment of primary pancreatic cancer and metastasis.

This protocol describes the preparation of organotypic slice cultures (OTSCs). This technique facilitates the ex vivo cultivation of intact multicellular tissue. OTSCs can be used immediately to test for their respective response to drugs in a multicellular environment.