원발성 췌장암 및 전이에서 종양 미세환경의 전임상 모델로서의 유기형 절편 배양

유기형 조직 절편은 다양한 조직에서 생성되었습니다. 보존된 조직 무결성과 배양 기술의 개발로 인해 복잡한 생리학적 메커니즘을 모델링하는 데 적합했습니다. 췌장암의 기관형 절편 배양은 종양의 다세포 구조와 생체 외 미세환경을 면밀히 재계산합니다.

약물 반응 테스트와 같은 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 종양을 외과적으로 절제한 후 바로 배양할 수 있으며, 대부분의 다른 1차 배양 기술에 비해 저렴하고 시간이 적게 소요됩니다. 이 절차를 시연하는 사람은 뤼베크 대학의 기술 조교인 Olha Lapshyna입니다.

시작하려면 예열된 링거 용액 100ml에 아가로스 8g을 녹여 저융력 8% 아가로스 100ml를 준비하고 필요할 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다. 종양 절제술이 발표되면 아가로스를 전자레인지에 녹입니다. 아가로스를 예열된 수조에 넣고 준비하기 전에 생리적 온도로 냉각시킵니다.

면도날을 Vibratome 홀더에 넣고 제조업체의 지침에 따라 자동 각도 조정을 수행합니다. 냉각 장치 또는 젖은 얼음을 사용하여 절단 챔버의 재킷을 식히십시오. 절단 챔버에 약 100mL의 링거 용액을 채운 다음 장착된 면도날을 미리 냉각된 절단 용액에 넣어 면도날을 식힙니다.

냉각된 PBS로 조직 표본을 세척하고 얼음 위에 놓인 14cm 크기의 큰 페트리 접시에 넣습니다. 메스를 사용하여 얼음 위에서 거시적으로 보이는 과도한 결합 조직을 제거합니다. 티슈를 작은 페트리 접시에 넣습니다.

거시적으로 볼 수 있는 나머지 결합 조직이 페트리 접시 바닥의 평야와 동일한 방향을 갖도록 조직 방향을 조정합니다. 준비된 저융력 아가로스를 작은 페트리 접시에 붓고 조직의 방향을 재조정합니다. 필요한 경우 집게를 사용하여 페트리 접시를 젖은 얼음 위에 올려 놓아 아가로스를 더 빨리 경화시킵니다.

메스를 사용하여 조직을 조심스럽게 자르고 조직의 양쪽에 최소 5mm의 주변 아가로스를 남깁니다. 시료 홀더에 접착제를 넣고 펴 바른 다음 내장된 조직을 옮겨 초강력 접착제를 사용하여 시료 홀더에 붙입니다. 몇 초 후 샘플 홀더를 절단 챔버에 넣고 필요한 경우 면도날을 향한 조직의 방향을 조정합니다.

조직 표본의 크기에 따라 절단 범위의 외부 한계를 정의합니다. 칼날을 티슈 블록의 위쪽으로 조정합니다. 절단 속도를 초당 0.04mm, 절단 진폭을 1mm, 슬라이스 두께를 300마이크로미터로 설정합니다.

첫 번째 조각을 조심스럽게 자르고 젖은 얼음에 미리 냉각된 링거 용액이 있는 별도의 용기에 조각을 옮깁니다. 웰당 적절한 배양 배지 1밀리리터가 있는 6웰 플레이트를 준비합니다. 배지가 있는 6웰 플레이트를 인큐베이터에 넣고 배양 전에 온도와 pH가 조정되도록 합니다.

시선 필터를 사용하여 세포 배양 삽입물에 조각을 놓은 다음 로드된 필터를 멸균 천에 놓아 과도한 링거 용액을 제거합니다. 인서트에 추가 매체를 추가하지 않고 로드된 필터를 준비된 6웰 플레이트에 넣은 다음 6웰 플레이트를 인큐베이터에 넣고 2일마다 매체를 교체합니다. 장착된 조각이 있는 배양 필터를 페트리 접시에 놓습니다.

메스를 사용하여 장착된 조직 조각이 있는 필터 멤브레인을 조심스럽게 잘라냅니다. 장착된 슬라이스가 있는 필터 멤브레인을 생검 나일론 백에 옮기고 임베딩 카세트에 넣습니다. 그 후, 사전 냉각된 4.5% 포르말린이 있는 용기에 플라스틱 임베딩 카세트를 최소 24시간 동안 또는 나중에 사용할 때까지 옮깁니다.

포르말린 고정 슬라이스 배양액을 흐르는 수돗물로 1.5시간 동안 조심스럽게 헹굽니다. 포르말린 고정 조직 조각을 70 % 95 % 및 절대 에탄올에서 배양하여 탈수하십시오. 그런 다음 포르말린 고정 조직 조각을 크실렌에서 3시간 동안 두 번 배양하여 비웁니다.

파라핀을 넣은 티슈를 섭씨 60도에서 하룻밤 동안 담갔다가 다시 2시간 동안 담가둔다. 조직 매립 금형의 파라핀 블록에 조직을 삽입하고 얼음 위에 올려 샘플을 더 빨리 냉각시킵니다. 파라핀이 박힌 조직 블록을 마이크로톰으로 4마이크로미터 두께로 절단하고 증류수가 포함된 섭씨 40도의 수조에서 절단합니다.

단면을 유리 슬라이드로 옮깁니다. 섭씨 60도에서 1시간 동안 파라핀 절편을 배양하여 조직을 유리에 접착합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 슬라이드를 배양합니다.

자일렌에서 각각 5분씩 3회 배양하여 절편을 탈파라핀화합니다. 그런 다음 절대 알코올, 95% 알코올 및 70% 알코올에서 연속적인 배양으로 수분을 보충하십시오. Mayer Hematoxylin 용액의 섹션을 5분 동안 얼룩지게 하고 흐르는 수돗물로 10분 동안 헹굽니다.

0.5% ESN 용액으로 40초 동안 대조염색하고 증류수로 헹구고 에탄올로 탈수를 반복합니다. 몇 초 동안 크실렌을 세 번 교체하여 조직을 청소한 다음 장착 매체 한 방울을 놓고 커버 슬립으로 슬라이드를 덮습니다. 각 OTSC의 거시적 형태는 6일 동안 재배하는 동안 감소했습니다.

두 개의 다른 배지에서 두 개의 대표적인 원발성 종양의 OTSC에 대한 생존율이 저장되었으며, 절편 절차 및 배양 조건에 대한 조정으로 인해 0일 이후 생존율이 감소하고 오른쪽 패널에서 종양 표본의 생존력이 증가했습니다. H&E 염색 절편은 조직의 전체 구조가 생체 외 배양의 전체 시간 동안 보존되었으며 6일의 배양 기간 동안 증식 및 세포 사멸의 총체적인 변화가 감지되지 않았음을 보여주었습니다. H&E 절편의 현미경적 조직병리학적 평가에서는 배양 중 모든 배양 조직의 괴사가 크게 증가하지 않았습니다.

원발성 췌관 선암종(primary pancreatic docal adenocarcinoma, PDAC)을 15일 동안 배양한 후 절단된 Caspase-3 양성 세포가 증가했습니다. PDAC의 복막 전이에 대한 조직 병리학은 개별 절편 간의 높은 종양 내 이질성과 절단된 Caspase-3 염색으로 측정된 자연 발생 세포 사멸을 보여주었습니다. 복벽의 PDAC 전이에서 Cytokeratin 7에 대한 H&E 염색 및 면역조직학적 특성 분석은 파생된 OTSC가 종양 세포를 포함하지 않고 부분적으로 괴사하는 결합 조직으로만 구성되어 있음을 보여주었습니다.

예를 들어, 전사체학을 위한 RNA 염기서열분석 또는 공간적으로 분해된 단백질체학을 위한 마일드 이미징을 통해 특정 연구 질문에 따라 배양된 각 절편을 개별적으로 프로파일링할 수 있습니다. 미래에는 비파괴 분석 방법과의 결합을 통해 다양한 치료 요법에 대한 환자별 반응을 예측할 수 있는 큰 잠재력을 갖게 될 것입니다.