Name: a cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3d setting
Uploaded: 2015-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
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NIH 보조금 P30의 CA051008 및 CA009686 T32 (ATR)에 의해 지원됩니다.

타원체의 1 세대 <ol><li> PBS를 사용하여 70 %의 합류 ~의 부착 암 세포 배양을 분리하여 드롭 문화를 걸려 위해 단일 ​​세포 현탁액을 준비 0.05 % 트립신 EDTA 용액에 노출 된 다음에 씻으십시오. <ol><li> 세포 배양 배지와 트립신 용액을 중화하고 세포 현탁액의 분취 량을 사용하여 세포를 카운트. 주 : 세포주에 달려 특정 세포 배양 배지는 테스트중인. 세포 배양 배지는 일반적으로 DMEM + 10 % FBS이고, ATCC 미디어 권장 사항을 따르십시오. 자세한 내용은 표 재료에서 찾을 수있다. </li><li> 세포 배양 배지를 20 μL 방울 당 500 ~ 1,000 세포 시딩 있도록 희석을 수행한다. </li></ol></li><li> 10cm 접시를 취득하고 아래로 멸균 PBS의 5 mL를 추가 할 수 있습니다. 참고 :이 단계는 교수형이 증발에서 떨어 보호합니다. 저비용 &quot;세균 등급&quot;요리, 세포 배양 등급 요리 대신에 사용될 수있는 바와 같이, 세포를 계속하지 않을 것이다문화 표면 역할을합니다. </li><li> 뚜껑의 내면에 희석 된 세포 현탁액 20 μL 방울을 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용한다. <ol><li> 피펫 (40)는 10cm 접시의 뚜껑에 (8 방울의 5 행)을 삭제합니다. </li></ol></li><li> 배양 접시 위에 뚜껑과 장소를 반전. 스페 로이드를 생성하기 위해 72 시간 동안 37 ℃에서 배양 매달려 드롭 부화. <ol><li> 자신감, 아직 통제 된 방식으로 뚜껑을 뒤집습니다. 참고 : 너무 빠르거나 너무 느린 뚜껑을 반전하면 물방울이 이동하는 원인이 될 수 있습니다. 다른 소형 응집체를 생성하기 위해 72 개 이상의 시간을 요구할 수 있지만 어떤 세포주는 48 시간 이내에 구 상체를 형성 할 수있다. </li></ol></li></ol> 3D 매트릭스에 타원체 2. 임베딩 <ol><li> 밤새 스페 로이드를 매립하기 전에 4 ℃에서 성장 인자 - 감소 된 기저막 물질의 분취 량을 해동. <ol><li> 옵션 : 사전에 ECM와 레이어 우물은 조직 cultu 잠재적 회전 타원체의 상호 작용을 방지하기 위해표면 재. <ol><li> 24 웰 플레이트에 웰 당 ECM의 피펫 200 μL. </li><li> ECM은 전체 잘 표면을 커버하도록 판을 기울. </li><li> 조심스럽게 피펫으로 초과 ECM을 제거합니다. </li><li> 3 시간 실온에서 또는 4 박 ° C에서 : 우물이 건조 될 때까지 판을 품어. </li></ol></li></ol></li><li> 조직 배양 접시의 뚜껑을 틸팅 및 미디어를 풀링하여 타원체를 수집한다. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 회전 타원체와 미디어를 전송합니다. </li><li> 타원체가 microcentrifuge 관의 바닥에 정착하는 10 분을 허용합니다. 타원체는 눈으로 볼 수 있어야합니다. </li><li> . 감기 (4 ° C를) 100 ㎕ 내가 별도의 사전 냉각 튜브에 콜라겐 유형의 기저막 재료의 100 μl를 혼합 조기 응고에서 중 젤을 방지하기 위해 4 ° C에서 혼합물을 유지합니다. <ol><li> 작은 볼륨을 전송하는 경우 사전 냉장 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 때주의를 줘I가 기포 형성을 방지하기 기저막 재료 및 콜라겐 형 혼합. 주 :이 겔에 매립 될 경우 기포 프로토콜 뒷부분 이미징을 방해 할 수있다. </li></ol></li><li> microcentrifuge 관의 40 μL 바닥 부분에서 타원체를 대기음, 나는 혼합물을 콜라겐 기저막 재료 / 유형과 결합. 혼합 할 때 기포 형성을 방지하기 위해주의해야합니다. 주 : 용액 100 μL 콜라겐 유형 I 및 타원체 40 μL 4 3D 배양 독립적 충분한 물질을 생성, 100 μL 기저막 재료 함유. 이 스케일 업 또는 다운 할 수 있습니다. </li><li> 피펫 24 웰 플레이트에 웰의 중심에 점성 혼합물의 40 μl를 삭제합니다. 웰의 측면에 실행 혼합을 방지하기 위해 플레이트를 수평으로 유지. 참고 : 24 웰 플레이트에 하나의 열 - 4 웰 - 각 조건 테스트 할 것을 권장합니다. </li><li> 판 INT 배치OA 37 ° C 배양기에서 30 분 동안 그대로 둡니다. 3D 문화는이 기간 동안 중합합니다. </li><li> 서서히 세포 배양 배지 1 ㎖로 3 차원 배양 잠수함. <ol><li> 또한 겔 중합을 촉진하기 위해 우물에 그것을 추가 할 때 미디어가 따뜻한 있는지 확인합니다. </li><li> 중요한 단계 : 부드럽게 3D 문화에 미디어를 추가 할 수 있습니다. 우물에 너무 빨리 미디어를 피펫은 조직 배양 표면에서 3D 문화의 분리로 이어질 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 3. 모니터링 및 회전 타원체 침공 분석 <ol><li> 연구자에 의해 결정 시간 지점에서 주변의 3D 매트릭스로 회전 타원체에서 이미지 침공. 20 배 대물 렌즈와 거꾸로 현미경을 사용하여 사진을 획득. 주의 : 이상적 시간 - 포인트는 테스트되는 세포주에 따라 다를 것이다. 더 침습적 세포주는 곧 도금 후 타원체에서 자신의 출구를 시작하고, 따라서, 초기 사진을 취할 것입니다도금 후 몇 시간 이내의. 일반적으로, 사진은 (도금 후) 0 시간, 24 시간, 48 시간에서 가져옵니다. 침략은 일반적으로 도금 후 24 시간 내지 48을 마칩니다. </li><li> 이미지 J. 같은 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 침입 능력을 정량 <ol><li> 회전 타원체의 가장자리에서 셀 거리로 침략을 분석합니다. <ol><li> 반경 및 / 또는 최대 침략 거리를 표시하기 위해 직선 그리기 도구를 사용합니다. </li><li> 길이 측정을 표시하는 &quot;측정&quot;을 상단 메뉴의 &quot;분석&quot;을 선택한 후 클릭합니다. </li></ol></li><li> 회전 타원체 외부 총 침략 영역으로 침략을 분석합니다. <ol><li> 회전 타원체 및 / 또는 총 침략 영역의 경계를 추적 자유형 그리기 도구를 사용합니다. </li><li> 지역 측정을 표시하는 &quot;측정&quot;을 상단 메뉴의 &quot;분석&quot;을 선택한 후 클릭합니다. </li></ol></li><li> 이미지의 스택에 대한 측정을 만드는 데 투자 수익 (ROI) 관리자 도구와 같은 플러그인을 사용합니다. </li></ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

본 연구는 회전 타원체 침윤 분석 (표 1) 암 세포주 패널의 성능을 평가 하였다. 일반적으로, 우리는 회전 타원체 형성 세포 간 접합이 존재 타원체 형상 구조의 형성을 촉진 더 상피 생긴 세포주에서 향상되는 것을 발견한다. MDA-MB-231 세포와 같은 상피 - 간엽 전환을받은 알려진 세포주, 그들의 감소 E-, N- 및 P-cadherin의 발현 16에 가장 가능성이 매달려 드롭 문화 타원체를 형성?...

그것은 암 세포의 운동성이 같은 행동이 순환 시스템 1에 기저막과 항목을 통해 침입을 용이하게 주어진, 전이 가능성의 예측이라고 설정됩니다. 운동성에 가장 연구가 광범위하게 3 차원 매트릭스에서 세포의 이동 것 실제로 방법이 동일 세포보다 대표 인 것으로 인식되고있다하더라도 세포가, 2 차원 (2D) 환경에서 동작하는 방법에 초점을 맞추었다 생체 2에서 작동합니다. 3 차원 배양 시스템은 점차 성장 역학 및 약물 감수성 3, 세포 형태의 범위 셀룰러 동작을 연구하기 위해 사용된다. 3 차원 환경의 컨텍스트 내에서 암 세포 침입을 모니터링하는 욕구는 3 차원 세포 내로 이러한 타원체 매립 하였다 매달려 드롭 배양법 (4)를 통해 3 차원 세포 집합체 (타원체)의 생성을 포함하는 이전에 확립 된 기술을 합성하게되었다 매트릭스 (ECM) 콜라겐과 기저막 재료 (5)으로 구성. 이 방법은 쉽게 실험 다양한 조건 하에서 내습과 비교하기 위해 이용 될 수있는 간소화 된 방법을 제공함으로써 이전에 확립 된 기술을 개선하고자한다. 체외에서 세포 운동성을 평가하는 전통적인 방법은 스크래치 상처 분석 및 트랜스 웰 분석 (6)이다. 전 분석은 2 차원 환경에서 세포 운동성을 도시 한 생체 침입에 중요한 다양한 기능, 예를 들면 프로테아제 활성 7 그러므로 독립적이다. 트랜스 웰 분석은 웰 인서트가 대향 막 표면에 세포의 모양, 즉 ECM 기재하지만, 단 하나의 파라미터를 더 모델 세포 침윤 코팅 할 수있을 때를 측정하고, 세포 침윤의 많은 뉘앙스 따라서 용이하게 관찰 할 수없는된다. 이러한 기술, 암세포 침윤 타원체 분석 (도 1 &lt;대조적/ 강해&gt;) 만 생리 관련이없는 환경에서 세포 침윤의 실시간 모니터링을 허용하지만, 또한 이러한 집단 대 개인 세포 이동 8로서 가시화 될 중요한 세포주 특정 기능을 허용한다. 이 방법은 표준 3 차원 배양 성장 분석보다 이점을 제공한다. 세포는 이러한 제한이 해제 된 후 침입하는 인센티브되도록 매달려 드롭 방법을 통해 세포 응집체의 생성은 처음에 세포의 움직임을 제한한다. 그 제약 조건이 해제되면 또한, 세포 출구는 편리하게 정량 할 수있는 일정한 방향으로 진행됩니다. 암세포 타원체 분석법에 가장 널리 사용되는 재료는 ECM의 Matrigel하고 이러한 구성 요소들의 각각은 전이 거동에 영향을 미치는 중요한 역할과 구별 갖는 경우 타입 I 콜라겐. 마트 리겔은 Engelbreth-Holm이 운집 마우스 육종 세포에 의해 생산 된 단백질의 분비 혼합물이며, baseme에 충실이러한 라미닌, entactin 및 제 4 형 콜라겐 (9)와 같은 NT를 막 단백질. 이 때문에 마트 리겔은 이제부터라고 &quot;기저막 물질.&quot;이 기저막 물질은 세포의 행동 (11) 상에 다양한 효과를 발휘하는 다른 많은 단백질 외에 암세포 침윤 (10) 중 접착 인테그린에 필요한 필수적인 리간드를 제공한다. 비교하면, 일반적으로 힘줄 등 치밀한 콜라겐 구조 (12)의 산으로부터 제조 다이제스트 I 형 콜라겐은, 본체의 결합 조직과 기질지지 조직과 기관의 주요 구조적 요소로서 기능 훨씬 단순 매트릭스 물질이다. 이것은 콜라겐의 물리적 특성은 세포 운동성의 기능의 수를 조절할 수 있음을 입증되었다; 예를 들어, 종양 - 기질 계면에서 콜라겐 섬유의 배향은 기질 (13)에 침입 할 때 그 다음에 피 브릴을 따라 이동하는 암세포를 허용. 여기에 제시된 분석에서는 두 종류의 난 콜라겐과 기저막 재료는 3D 암 세포 - 기질 상호 작용을 연구하는 도구로 사용된다. 세포를 3 차원 매트릭스에 매립 한 후 침입이 모니터링 될 수 제어 경로의 억제 또는 자극의 효과. 세포 매달려 방울 또는 긴 치료가 침공을 조절해야합니다 여부에 따라 3D 문화로 전송시 성장하는 동안 전처리 할 수​​ 있습니다. 짧은 치료를 들어, 약물이 컬렉션 후 타원체 서스펜션뿐만 아니라 셀에 충분한 약물 노출을 용이하게하기 위해, 3 차원 배양을 둘러싸 매체와 혼합하는 것을 추천합니다. 다음에, 정상 또는 종양 - 관련 기질 세포는 종양 세포의 침윤을 변조에서의 역할을 평가하는 방법 또는자가 분비 및 주변 분비 신호의 영향 세포 행동 결정하는 매트릭스 물질과 혼합 될 수있다. 이 아이디어는 연구에 나타내었다 곳 (COL)의 공 배양암 매달려 방울의 내피 세포에 회전 타원체 (14) 내의 혈관 네트워크되었다. 암세포 침윤이 다른 기판 (15)에 의해 영향을 마지막으로, ECM 성분은 또한 변경 될 수있다. 아래에 제시된 방법에 따라서 다양한 조건 하에서 암 세포의 침윤을 평가하기위한 프레임 워크를 제공한다. 일반적으로 모든 세포주가 걸려 방울에 타원체를 생성하고 상피 보이는 세포주는 일반적으로 일반 구를 형성하지 않는 것이 발견되었다.

<table><tbody><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-treated Dishes</td><td>Corning Incorporated</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>24-well TC-treated Plates</td><td>NEST Biotechnlology</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3d setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

회전 타원체 침입 분석을 이용하여 (도 1), 암 세포주의 패널뿐만 아니라, 기저막 재료 및 타입 I 콜라겐으로 이루어진 3 차원 매트릭스로 주입 후에 나타나는 셀 출구의 양 구 상체를 형성하는 능력에 대해 시험 하였다 (표 1). 이 결과는 모든 암 세포주가 시험 관내 상피 형태를 갖는 세포주 정규 매끄러운 골재를 생산하는 경향이 잘 형성된 타원체를 생성 함을 입증...

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A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

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Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

연구

의학

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

암 연구학

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

암 생물학의 3D 모델: 헤테로스페로이드의 침입 역학

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

저자 스포트라이트: 두경부암 진행 중 암과 면역 세포 사이의 누화 해독

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

<meta charset="utf8"></head><body>3D 콜라겐 매트릭스 설정에서 대식세포-종양 스페로이드 상호 작용 검사

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

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TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

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3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석