축삭이 복잡한 중추 신경계 매트릭스를 탐색하는 방법은 신경 생물학의 근본적인 질문입니다. 이 프로토콜은 고해상도 이미징으로 생리적 환경에서 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학에 대한 연구를 가능하게합니다. 이 프로토콜은 마우스 배아 뇌에서 DNA의 전달을 위한 사용자 친화적인 종단 간 파이프라인, 고품질 유기형 슬라이스를 위한 준비 및 이미지 획득 및 분석을 위한 단계별 가이드를 기술한다.
원래 배아 중추 신경계에서 축삭 역학을 연구하기 위해 설계되었지만,이 프로토콜은 외상 또는 병리학 적 상태 후 축삭 가소성의 유기형 배양 및 시각화를 허용하도록 조정할 수 있습니다. 프로토콜 자체는 비교적 간단합니다. 그러나 뇌 구조의 첫 번째 라벨링 및 보존을 달성하는 것이 중요한 포인트입니다.
따라서 전기 천공, 뇌 해부 및 슬라이싱 단계는 특별한주의가 필요합니다. 절차를 시연하는 것이 도움이 될 것이며, 박사 과정 학생은 Bracket의 실험실 출신입니다. 임신 한 여성 마우스를 마취 한 후 절개하여 따뜻한 식염수 또는 포셉에 담근 면봉을 사용하여 자궁 뿔을 모두 꺼내 배아 사이의 공간을 조심스럽게 움켜 잡으십시오.
그런 다음 젖은 거즈에 배아를 놓습니다. 절단 후 자궁낭을 열고 각 배아를 제거하십시오. 배아를 얼음 위에 포도당이 보충된 HBSS가 들어있는 10센티미터 접시에 넣습니다.
ex utero electroporation의 경우, 배아를 집어 들고 홀더에 넣으십시오. 그런 다음 배아 두개골을 통해 DNA 빠른 녹색 믹스가 들어있는 유리 모세관을 측심실에 조심스럽게 삽입하고 두 세 마이크로 리터의 DNA 플라스미드 믹스를 각 심실에 주입하십시오. 다음으로, 백금 핀셋 전극 사이에 배아의 머리를 적절한 각도로 잡고 원하는 뇌 영역을 목표로하고 음극은 DNA 전달이 의도 된 영역을 향하게합니다.
자궁 전기 천공에서 자궁 뿔을 뽑아 내고 이전에 입증 된 것처럼 젖은 거즈에 배아를 놓은 후 손가락 끝을 사용하여 람도이드와 처진 봉합사가 위치 할 때까지 자궁 내부의 배아를 부드럽게 회전시킵니다. 그런 다음 자궁 벽과 배아 두개골을 통해 DNA 빠른 녹색 믹스가 포함 된 유리 모세관을 측심실에 조심스럽게 삽입하고 DNA 플라스미드 믹스의 두 세 마이크로 리터를 심실 당 최대 두 마이크로 리터로 원하는대로 하나 또는 양쪽 심실에 주입하십시오. 주사 후, 백금 핀셋 전극 사이에 배아의 머리를 적절한 각도로 잡고 원하는 뇌 영역을 목표로 삼고 음극이 DNA 전달이 의도 된 영역을 향하게하십시오.
필요한 모든 배아가 전기 천공되면 식염수에 적신 면봉을 사용하여 자궁 뿔을 복강 안쪽으로 부드럽게 다시 놓습니다. 5-0 봉합사를 사용하여 근육과 피부 절개를 봉합 한 다음 봉합사 클립을 사용하여 상처를 고정시키고 베타 딘으로 상처를 소독하여 상처를 소독하십시오. 마우스를 복구 케이지에 다시 넣고 시술 후 적어도 20 분 동안 원적외선 온열 등을 사용하여 따뜻함을 유지하십시오.
배아의 머리를 해부 현미경으로 고정하십시오. 그런 다음 머리 바닥에서 코쪽으로 시작하는 중간 선을 따라 절단하여 두개골의 피부를 제거하십시오. 두개골의 피부를 옆으로 껍질을 벗기면 뇌가 절제되기에 충분한 간격을 만듭니다.
다음으로, 뇌를 제거하여 후각 전구 아래에서 시작하여 뇌간을 향해 이동하는 멸균 해부 가위의 닫힌 끝을 삽입한다. 그런 다음 뇌 줄기를 자르고 뇌 주위의 많은 느슨한 수막 조각을 다듬습니다. 구멍이 뚫린 숟가락을 사용하여 뇌를 집어 들고 마른 티슈 페이퍼에 숟가락 바닥을 닦아 과도한 액체를 제거하십시오.
그런 다음 얼음 위의 아가로스 접시에 뇌를 넣으십시오. 다음으로, 더 작은 숟가락을 사용하여 아가로오스를 10 초 동안 섞어서 냉각시킨 다음 뇌를 접시 중앙으로 기동하여 등쪽을 위로 수평으로 놓고 모든 방향에서 아가로오스로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. Vibratome 워크 스테이션에서 아가로스 블록을 부드럽게 집어 들고 티슈 페이퍼에 닦아 바닥을 말립니다.
그런 다음 뇌의 로스트랄 쪽이 위를 향하게하는 표본 홀더의 접착 된 영역에 블록을 놓고 표본 홀더를 얼음 위에 놓습니다. 접착제를 한 분 동안 말리십시오. 15도 각도로 코로나 조각으로 뇌를 자릅니다.
그런 다음 깨끗한 주걱을 사용하여 뇌 조각을 수집하고 Parrafin을 사용하여 35 밀리미터 유리 바닥 접시에 고정 된 PTFE 멤브레인 위에 놓습니다. 멤브레인 당 최대 다섯 개의 뇌 조각을 수집하십시오. 다음으로, 200 마이크로리터 피펫을 사용하여 슬라이스를 반건조시킨 채로 남겨둔 멤브레인 상의 슬라이스 주위에서 과량의 HBSS 글루코스 용액을 제거한 다음, 500 마이크로리터의 미리 예열된 슬라이스 미디어를 멤브레인 아래의 공간에 직접 첨가하고, 슬라이스를 섭씨 35도에서 5% 이산화탄소로 인큐베이션한다.
축삭 성장을 이미징하려면 중간 세포 밀도가 낮은 피질 영역을 찾습니다. 성장 원뿔 역학을 이미징하는 동안, 피질의 바로 그 영역 또는 심실 하부 영역에서 성장 원뿔을 찾으십시오. 다음으로 Z 스택 크기를 정의합니다.
큰 Z 스택에서 축삭 성장을 하려면 스텝 크기를 두 마이크로미터로 설정하고 더 작은 Z 스택에서 원뿔을 성장시키려면 스텝 크기를 한 마이크로미터로 설정합니다. 데이터 분석을 위해 파일을 클릭한 다음 열고 이미지를 선택하여 피지에서 이미지 파일을 엽니다. 이미지를 클릭하여 시간 경과의 최대 강도 투영을 구한 다음 스택, Z 투영 및 최대 강도 투영을 가져옵니다.
시간 경과를 통과하고 성장하는 축삭을 찾으십시오. 일단 위치하면, 성장하는 축삭을 통해 선을 그립니다, 첫 번째 프레임의 축삭의 끝에서 시작하여 전체 시간 경과를 통해 축삭을 따라갑니다. 다음으로, 플러그인 kymo를 다시 슬라이스하여 넓게 노래하십시오.
이미지로 이동하여 키모그래프의 배율을 설정한 다음 속성을 설정합니다. 거리를 마이크로 미터, 픽셀 너비 및 시간을 초 또는 분 단위로 설정 한 후 픽셀 높이로 이동하여 분석하고 측정을 클릭하십시오. 성장 원뿔의 볼륨을 측정하려면 파일을 클릭하고 열고 관심 있는 파일을 선택하여 이미지 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 엽니다.
그런 다음 첫 번째 단계에서 새 서피스 추가 마법사를 선택하고 알고리즘 설정에서 관심 영역만 세그먼트를 선택한 다음 두 번째 단계에서 모든 프레임의 전체 성장 원뿔에 맞게 프레임을 자릅니다. 다음으로 세 번째 단계에서 임계 값을 절대 강도로 유지하고 네 번째 단계에서 전체 성장 원뿔 영역이 임계 값인지 확인하십시오. 그런 다음 다섯 번째 단계에서 필터 유형에서 복셀 LMG의 수를 선택합니다.
실행 단추를 선택하여 모든 생성 단계를 수행하고 새 서피스 추가 마법사를 종료합니다. 마지막으로 마법사 창 맨 위에 있는 통계 탭에서 세부 정보 탭에서 특정 값과 볼륨을 선택합니다. 전형적으로, utero 또는 ex utero electroporation에서 파생 된 성공적으로 배양 된 뇌 조각은 정상적인 세포 분포와 정점 지향적 인 필로 접촉 과정을 가진 방사형 신경교의 조직 된 배열을 보여줍니다.
때때로 방사형 신경교 스캐폴딩 및 배양된 뇌 조각에서 ex utero electroporation 표시된 교란이 관찰되어 이 조절 염색이 권장됩니다. Lyn-mNeonGreen을 발현하는 대표적인 피질 피질 돌출 뉴런과 그 성장 원뿔의 역동적 인 행동이 여기에 나와 있습니다. 추가적으로, 뉴런은 액틴 프로브를 발현하는 플라스미드를 사용하여 표지하여 축삭 성장 원뿔의 액틴 역학을 분석하였다.
계내 실험은 또한 플라스미드 설계를 발현하는 이중 cre dre 형광단으로 수행되었으며, 여기서 tRFP 또는 ZsGreen 형광단은 이웃 뉴런에서 각각 dre 또는 cre 재조합효소에 의해 특이적으로 그리고 개별적으로 활성화될 수 있었다. kymographs에서, 여러 축삭에 대한 성장 속도 및 시간에 따른 성장 원뿔 부피와 같은 동적 성장 매개 변수를 쉽게 얻을 수 있습니다. 이것은 액틴 디딜 방아의 속도와 성장 원뿔 탐험 활동 중 filopodia와 lamellapodia 사이의 균형을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
희소 한 라벨링을 달성하기 위해 뇌 구조를 유지하고 플라스미드 농도를 미세 조정하는 것이 중요합니다. 이것은 피질에서 축삭과 성장 원뿔의 정확한 시각화에 중요합니다. 선택된 혈장 및 유전 적 배경에 따라이 프로토콜을 통해 사용자는 뉴런이나 성장되는 환경을 수정하여 광범위한 연구를 수행 할 수 있습니다.
이 기술은 현장에서 뉴런에 대한 고해상도 접근을 가능하게함으로써, 신경 과학자들이 형태 학적 및 분자 수준에서 성장 원뿔과 중추 신경계 메트릭 사이의 동적 상호 작용을 조사 할 수있게합니다.
