우리는 단일 클론 항체 CR9114 패트릭 C. 윌슨에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 원래 A/Anhui/1/13 플라스미드에 제니퍼 Debeauchamp 리처드 웨비 감사합니다. 이 작품에 대한 부분 지원은 알레르기에 대한 국립 연구소에 의해 제공되고 전염성 프로그램 프로젝트 부여 AI097092-01A1와 CEIRS (인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수의 센터 HHSN26620070010C) 질병 - 투자되었다. FK는 오스트리아 과학 기금 (FWF)에서 어윈 슈뢰딩거의 교제 (J 3232)에 의해 지원되었다.

1. 재조합 배큘로 바이러스의 생성 <ol><li> 배큘로 바이러스 전송 - 플라스미드에 복제 <ol><li> 복제 H7 HA 및 수정 pFastBac 전송 플라스미드에 N9 NA의 ectodomain (또는 다른 HA 또는 NA 유전자) (소개 참조). HA는 N-말단 헥사 도메인 및 hexahistidine 태그를 포함하는 C-말단 삼량 체화 도메인 및 hexahistidine 태그를 함유뿐만 아니라 NA 용 용 벡터는, (도 1) 1,10,11,22 설명되었으며로부터 요청 될 수있다 저자. 해설 : 삼량 도메인없이 표현 HA의 ectodomains 특히 줄기 도메인에서, 구조적 중화 항원의 손실로 이어지는, 잘못 접힌됩니다. 마찬가지로, NA의 효소 기능은 적절한 테트라에 의존합니다. </li><li> bacmids의 생성 배큘로 바이러스 표현식을 사용하여 따라 DH10Bac 박테리아에 HA 및 NA 유전자를 포함하는 배큘로 바이러스 전송 - 플라스미드를 변환제조업체의 지침에 따라 시스템. 분리 및 제조 업체의 지침 (그림 2)에 따라 Midiprep 키트를 사용하여 bacmids를 정화. </li></ol></li><li> 단백질의 발현 재조합 배큘로 바이러스 및 검증의 구조 해설 : 다음 단계는 층류 후드에서 무균 적으로 수행해야합니다. HA 및 NA (또는 그 어떤 다른 유전자)에 대해 독립적으로이 절차를 수행합니다. 곤충 세포는 일반적으로 CO 2없이 28 ° C에서 재배되고 있습니다. 이 프로토콜 인 Sf9 세포를 지시하지 않을 경우 10 % FBS, 1 % 펜 패 혈성 * 0.1 % 플루로 닉 F68 솔루션, 보충 전체 TNM-FH 곤충 세포 미디어에서 성장하고, 일주일에 두 번 1:4 계대 있습니다. 하이 파이브 세포 SFX 혈청이없는 배지에서 재배하고 일주일에 두 번 1:15 계대 있습니다. * 항생제 첨가 프로토콜을 통하여 선택적으로 간주하고, 각 실험에 사용 된 방법에 따라 조정되어야한다. <ol><li> / cm 2 × 10 5 세포의 밀도로 6 - 웰 플레이트에 인 Sf9 곤충 세포를 플레이트와 (CO 2)없이 28 ° C 배양기에서 20 분 동안 앉아 보자. </li><li> 혼합 2 μg TNM-FH 배지 (혈청, 1 % 펜 연쇄상 구균)의 100 μL와 재조합 백 미드의 (conc. 0.5 ㎍ / UL). TNM-FH 배지 (혈청 무료, 펜 연쇄상 구균)의 100 μL로 형질 전환 제 6 μl를 섞는다. 두 개의 볼륨을 결합 부드럽게 섞어 실온 (형질 전환 혼합물)에서 20 분 동안 앉아 보자. 컨트롤로 한 모의 형질 (그림 3)를 포함합니다. </li><li> (세포가 이제 플레이트에 붙어 것) 및 펜 연쇄상 구균 (1 %)를 포함하는 혈청 TNM-FH 배지 2 ㎖로 대체 도금 인 Sf9 세포에서 뜨는을 제거합니다. (단계 1.2.2에서) 형질 전환 혼합물의 전체 볼륨을 추가하고 5 초 동안주의 깊게 6 잘 플레이트 바위. 6 시간 (그림 3)에 대한 CO 2없이 28 ° C 배양기에서 배양한다. </li><li> 미디어 위스콘신 교체th 신선한 전체 TNM-FH 미디어 (10 % FBS, 1 % 펜 - Strep의 0.1 % 플루로 닉 F68를 포함). 육일에 대한 CO 2없이 28 ° C 배양기에서 배양한다. 현미경으로 때때로 세포를 확인합니다. 감염된 세포는 일반적으로, 라운드, 더 큰 나타 핵을 확대하였으며, (그림 4)를 분리하기 시작합니다. </li><li> 세포와 단백질 발현의 확인 수확 <ol><li> 상온에서 5 분 2,000 XG에 원심 분리하여 수확 세포 육일 포스트 형질. 상층 액을 재조합 배큘로 바이러스를 포함 -이 바로 작동 주식을 생성하는 데 사용됩니다, 또는 몇 년 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 단백질 발현을 확인하기 위해 PBS 500 μL에 펠릿에 resuspend를 수집합니다. (환원제를 포함) SDS-PAGE 로딩 버퍼 50 μL와 현탁액의 50 μl를 섞는다. SDS-PAGE를 실행하고 유전자 발현을 확인하기 위해 안티 hexahistidine 항체로 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다. 모의에서 세포를 포함음성 대조군으로 형질 전환 (그림 3). </li></ol></li><li> 작업 주식의 준비 <ol><li> 판 5 × 5 인 Sf9 세포 / T175의 cm 2 플라스크 cm 2, 20 분 그들을 요리에 부착 할 수 있도록 방치. TNM-FH 미디어는 3 % FBS (1 % 펜 연쇄상 구균, 0.1 % 플루로 닉 F68)를 포함하는 완전한 TNM-FH 미디어를 교체합니다. </li><li> 구조의 상층 액 100 μL와 세포를 감염. 육일에 대한 CO 2없이 28 ° C 배양기에서 품어 세포가 감염 얻을 경우 가끔 확인한다 (단계 1.2.5에 설명 된대로.). </li><li> 5 분 상온에서 2,000 XG에 스핀과 상층 액을 수집합니다. 이 이제 P2의 재고입니다. 이 주식은 4 ℃에서 무한정 저장할 수 있습니다 세포를 감염 P2 주식 100 μl를 사용하여 감염의 절차를 반복합니다. 그 결과 주식은 P3 또는 4 ° C에 저장되거나 단백질 발현에 직접 사용할 수있는 작업 주식,라고합니다. P3의 주식은 보통 10를 포함 &lt;SUP&gt; 7 -10 9 패 단위 / ㎖을 형성한다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 단백질 발현 및 정제 해설 : 인 Sf9 세포는 잘 바쿨로 바이러스의 성장을 지원한다. 그러나, 재조합 단백질의 다량 분비하는 그들의 능력은 제한된다. 그러므로 우리는 분비 된 재조합 단백질의 발현에 대한 또 다른 곤충 세포주, 하이 파이브 세포를 사용합니다. 이 세포는 매우 높은 역가 13 배큘로 바이러스 복제를 지원하지만, 높은 분비 능력이 없습니다. <ol><li> 하이 파이브 세포를 성장 T175의 cm 2 플라스크에 SFX 곤충 세포 배양 배지에서 하이 파이브 세포를 성장. 항로 매일 1시 3분. 200 ㎖의 식 문화의 경우 5 합류 플라스크 성장을해야합니다. </li><li> 하이 파이브 세포를 수확하고 감염 <ol><li> 손으로 플라스크를 눌러 5 T175의 cm 2 플라스크에서 하이 파이브 세포를 분리합니다. 셀 suspe 수집nsion 및 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 12 분 동안 1,200 XG에 스핀. 경사 분리하여 상층 액을 제거하고 P3 주식의 15 ㎖에 그들을 재현 탁하여 알약을 결합한다. </li><li> (그림 5) 흐름 후드에서 15 분 동안 앉아 보자. </li><li> 깨끗하고 무균 1,000 ml로 흔드는 플라스크에 HyClone 사 SFX의 배지 200 ㎖로 이동 (고압 증기 멸균 전에 알루미늄 호일로 밀봉 buffles하지 않고, 이전에 세균 배양에 사용되지 않은해야합니다.) </li><li> 진탕 플라스크에 P3/cell 현탁액을 전송합니다. 쉐이커에 무균 알루미늄 호일 및 전송 플라스크 인감. 72-96 시간 동안 28 ° C에서 70 rpm으로 흔들어. </li></ol></li><li> 하이 파이브 세포 발현 상층 액에서 재조합 단백질을 수확 <ol><li> 500 ㎖의 원심 분리 버킷에 72-96 시간 후 감염 전송 배양 상층 액. 4 ℃에서 20 분 동안 5,500 XG에 스핀 그 동안 진탕 플라스크 두 번 증류수로 3 배 씻어(DDH 2 O). </li><li> PBS (한 200 ㎖의 배양에 필요한이) 45 mL를 50 ㎖ 튜브에 전송 3 ㎖ 니켈 수지 슬러리. 잘 흔들어서 10 분 동안 실온에서 3000 XG에 스핀. PBS를 가만히 따르다 펠릿을 유지합니다. 니켈 수지 펠렛과 곤충 세포의 상층 액을 혼합하고 이미 세척 통 플라스크에 옮긴다. (그림 6)을 흔들면서 2-4 시간 동안 4 ° C에서 알을 품다. </li><li> 지원 스탠드에 클램프 산 10 ㎖ 폴리 프로필렌 열. 두 캡을 제거하고 (폐기물)를 통해 흐름을 수집하기 위해 열 아래 비커를 놓습니다. 통 밖으로 흔드는 플라스크를 타고 칼럼에 뜨는 / 슬러리 혼합물을 전송하기 시작, 그것은 니켈 수지를 유지하고 만 상등액을 통해 흐를 것이다. 열을 통해 전체 볼륨 (그림 7)를 전달합니다. </li><li> 세척 완충액 15 ㎖ (50 mM의 나 2 HCO 3, 300 밀리미터의 NaCl, 20 mM의 이미 다졸, 산도 8)과 수지의 4 배를 씻으십시오. 모든 세척 버퍼 드레인에게하자열에서 캡 (아래쪽)를 닫습니다. </li><li> 용출 버퍼의 2 ㎖ (50 mM의 나 2 HCO 3, 300 밀리미터의 NaCl, 300 mM의 이미 다졸, 산도 8)을 추가하고 5 분 동안 앉아 보자. 열을 열고 용출액을 수집합니다. (용출 버퍼 8 ㎖의 총)이 3 번 이상 반복합니다. (그림 7) 흔들릴 때 단백질의 높은 농도를 포함 용출액은 일반적으로 폼을 보여줍니다. 가능하면 젖은 얼음에 용출액을 유지합니다. </li></ol></li><li> 버퍼 교환 및 농도 <ol><li> Prespin 15 ㎖의 한외 여과 원심 분리 장치 20 분 동안 4 ° C에서 3,000 XG에서 PBS (pH가 7.4-7.6)과 (HA / NA 30 kDa의 차단하지만 정제 된 단백질의 크기에 따라 달라질 수 있습니다.) 스핀 컬럼으로 통해로드 용출액 흘러 버린다. 4 ℃에서 5 살균, 얼음 차가운 PBS의 ML 3,000 XG에 60 분 동안 스핀으로 채워 </li><li> 다시 통해 배출 흐름은 15 얼음 차가운 PBS의 ML, 4 ° C에서 3,000 XG에 60 분 동안 스핀 리필 이 proce를 반복한 번 더 두레. </li><li> 원심 분리기 밖으로 스핀 열을 가지고 버퍼 교환 농축 (일반적으로 200 μL)를 수집합니다. 이것은 매우 재조합 단백질을 농축한다. 살균 얼음 차가운 PBS 400 μL와 스핀 열을 씻어 농축이를 추가합니다. 항상 얼음에 집중하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 특성 및 품질 관리 <ol><li> 단백질 농도를 측정 농축 나누어지는을 가지고 선택의 단백질 정량 방법을 사용하여 측정합니다. PBS를 추가하여 1 ㎎ / ㎖의 단백질 농도를 설정하고 -80 ° C.에 작은 분량 씩 동결 동결 해동 사이클은 단백질 구조를 손상과 통합으로 이어질 수 있습니다. </li><li> SDS-PAGE와 쿠마시 염색 SDS-PAGE에 단백질의 500 NG를 실행하고 쿠마시 염색을 수행합니다. 빠르고 편리하게 염색을 위해 전자 프로토콜과 함께 쿠마 시약을 사용합니다. HA 단백질은 일반적으로 64에서 나타나는kDa의 NA 단백질은 약 56 kDa의 (그림 8A와 B)의 크기로 실행해야합니다 반면. 설명 된 프로토콜을 사용하면 모든 해산물을 볼 수 없습니다. 저하가 발생하면 일반적으로 표현하는 동안 효모 / 곰팡이 오염의 표시이다. 이 경우 절차를 반복하고 멸균 모든 것을 유지해야합니다. </li><li> 웨스턴 블롯 / ELISA 단백질의 신원을 확인하기 위해 우리는 특정 항체로 웨스턴 블롯 또는 ELISA 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 이상적으로, ELISA 분석 실험은 형태 적 항원 (예 : 항-HA 줄기 항체 1)에 결합하는 항체로 수행됩니다. 이러한 항체를 이용한 단백질의 정확한 폴딩 (도 8C)를 확인할 수있다. </li><li> 활동 NA 측정 바이러스 NA의 정확한 폴​​딩 또한 NA 활성을 측정함으로써 결정될 수있다. 우리는 상업적으로 이용 가능한 NA * STAR의 분석을 (단지 사용자의 지침을 따르십시오)를 사용하여이 테스트를 수행하는 것이 좋습니다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

배큘로 바이러스 발현 시스템을 이용하여 곤충 세포에서 인플루엔자 바이러스 HA 및 NA 단백질의 발현이 곧장 앞으로 일반적이지만, 고려해야 할 여러 가지 중요한 점이있다. 서론에서 지적한 것처럼 그것은 HA와 NA의 ectodomains이 각각 삼량 또는 테트라 도메인과의 융합으로 표현되는, 중요합니다. 이 도메인은 일반적 ectodomain 표현하면 존재하지 않는 횡단 도메인의 도움으로 분자의 정확한 폴​​?...

중국에서 새로운 H7N9 인플루엔자 바이러스 균주의 최근 출현에 첫 번째 응답으로, 우리는 헤 마글 루티 닌 (HA)과 뉴 라미니다 제 (NA)의 처음 두 균주의 유전자에 대한 게놈 서열을 운반하는 플라스미드를 취득했다. 우리는 신속하게 곤충 세포에서 재조합 HA와 NA의 생산 배큘로 바이러스 발현 벡터를 구축 할 수 있었다 이러한 플라스미드를 사용하여. 이 발현 시스템은 잘 실험실에 설립되어 지속적인 연구 프로젝트 1-8의 많은 중요한 입증되었습니다. 곤충 세포는 올바르게 접혀 사후 병진 복합 단백질을 수정할 수있다. 이러한 수정은 많은 바이러스 당 단백질에 중요한 N-결합 글리코 실화를 포함한다. 따라서, 그것은 배큘로 바이러스 시스템이 꽤 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 발현하는 확립되는 것은 놀라운 일이 아니다. 사실, HA 및 NA 결정 구조의 많은 곤충 세포 발현 된 단백질을 사용하여 9-11 해결되었다. 또 다른 장점강한 폴리 헤드린 프로모터로부터 바이러스 감염 구동 식의 결과 - 시스템 (50 개 이상의 서로 다른 HA 단백질과 우리의 경험을 바탕으로) HA / L 세포 배양의 최대 30 밀리그램의 신뢰성 높은 단백질 수율에 자리 잡고 있습니다. HA 및 NA 단백질의 막 횡단 및 endodomain 제거하여 단백질 secretable, 수용성 버전의 발현을 허용하고 따라서 크게 정제 공정을 용이하게한다. 또, 이러한 ectodomains는 hexahistidine 태그 된 따라서 니켈 2 +-수지를 사용하여 친 화성 크로마토 그래피를 이용하여 정제 할 수있다. HA 및 NA 단백질의 막 관통 도메인은 각각 homotrimer 및 homotetramer 형성에 기여한다. 이러한 oligomerizations을 유지하기 위해, 우리는 HA-, 및 NA에 N-말단 테트라 도메인 (그림 1) 생성에 C-말단 삼량 도메인을 추가합니다. 우리는 삼량 도메인 기능,하고 당연한를 안정 결론적으로 보여 주었다HA 1의 줄기 영역에 구조적 에피토프를 rved. NA의 올바른 테트라는 접는 및 NA 기능 10를 해결하는 데 기여할 수 있습니다. 삼량 또는 테트라 도메인을 품고 시퀀스와 baculo 전송 벡터는 저자 또는 필드, 9,10,12의 다른 실험실에서 요청하실 수 있습니다. 곤충 세포에서 분비되는 단백질의 발현을위한 또 다른 중요한 문제는 바로 세포주의 선택입니다. 스포 도프 테라 프 루기 페르가 인 Sf9 세포가 잘 배큘로 바이러스 복제를 지원하고 일반적으로 바이러스 구조 및 증식을 위해 사용되는 파생 동안, 단백질의 다량 분비하는 능력을 제한 하였다. Trichoplusia NI는 (일반적으로 하이 파이브로 알려진) BTI-TN-5B1-4 세포 유래 높은 분비 능력을 가지고 있고이 프로토콜 13, 14의 발현에 대한 선택의 세포주이다. 또한,이 소 태아 혈청을 감소 또는 제거하는 것이 도움이된다 (FB표현 문화의 S). 따라서 우리는 바이러스 일 주식을 성장에 대한 감소 (3 %) FBS 콘텐츠와 미디어를 사용하여, 우리는 혈청이없는 배지에서 단백질 발현을 수행합니다. 재조합 HA 및 NA 단백질은 많은 면역 학적 기술에 사용된다. 아마도 가장 일반적인 것은 사람이나 동물에 접종 4,6,7,15에 혈청 전환을 측정하기위한 ELISA 분석법이다. 가 및 NAS는 항체를 분비하는 세포 (16)에 대한 자극 분자 검출 시약 모두로 ELISPOT 분석 실험에 사용됩니다. 분자 미끼로서의 용도는 특별히 plasmablasts 또는 후 (치료) 단일 클론 항체 (모노클로 날 항체)를 분리하기 위해 사용될 수 B-세포의 다른 유형에 대해 정렬 할 수있다. 재조합 HA 및 NA 분자는 더 이상 이러한 단클론 항체 (8)의 특성 분석에 사용됩니다. 다른 예로는 pH가 안정 또는 수용체 특이성 다른 바이러스 균주에 의해 표명의, 또는 정량적으로 평가하는 특정 NA의 효소를 연구 포함억제제 활동이나 저항. 또한, 재조합, 정제 된 HA는 불 활성화 인플루엔자 바이러스 백신의 HA 함량을 표준화하기 위해 사용될 수있다. 중요한 것은, RHA (그리고 어느 정도 NA) 백신 후보는 현재 하나의 백신 후보 2013 2,17-19에 FDA에 의해 허가 된 상태 동물 모델과 인간의 임상 실험으로 테스트되고있다. 이러한 신규 한 백신의 장점으로 인해 이들 단백질의 재조합 특성으로 높은 성장 재조합 바이러스의 생성의 노동 집약적 공정이 회피 될 수 있다는 것이다. 아마도 더욱 중요한 자신의 HA의 수율이 높고 변형의 변형을 재현 할 수 있다는 사실입니다. 이 백신은 계란이없는 시스템에서 생산되기 때문에 또한, 그들은 계란 알레르기가있는 개인에 대한 문제가있다 단백질 오염 물질을 포함하지 않습니다. 여기서 우리는 새로운 중국어 H7N9 인플루엔자 바이러스, A / ANH의 두 균주에서 HA와 NA 단백질을 표현하기 위해 선택ui/1/13 및 A/Shanghai/1/13 (20, 21). 이들은 적시 예이지만 설명한 프로토콜은 임의의 인플루엔자 A와 B HA 또는 NA 단백질의 발현을 위해 사용할 수있는 다른 어떤 분비 된 바이러스 또는 세포 단백질을 표현하도록 할 수있다. 삼량 체 또는 사량 막 횡단 단백질은 각각, HA 및 NA에 사용되는 발현 카세트로 클로닝 될 수있다. 그러나, 대부분의 수용성 분비 세포 단백질은, 예를 들어 인터페론 같은 안정화를위한 추가 도메인을 필요로하지 않고, C-말단 hexahistidine 태그 전적으로 표현 될 수있다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus expression system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNM-FH insect medium</td>
			<td>Gemini Bioproducts</td>
			<td>600-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone SFX-Insect</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N58760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000702664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC902024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max efficiency DH10Bac bacteria</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399-100G</td>
			<td>for elution and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Five cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B85502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system

배큘로 바이러스 발현 시스템은 재조합 단백질의 발현을위한 강력한 도구이다. 헤 마글 루티 닌 (HA)과 뉴 라미니다 아제 (NA) - 여기서 우리는 독감의 제대로 접어 당화 버전의 바이러스 표면 당 단백질을 생산하기 위해 사용합니다. 예를 들어, 우리는 최근 중국에서 출현 한 새로운 H7N9 바이러스에 의해 표현 된 HA 및 NA 단백질을 선택했다. 그러나 프로토콜은 쉽게 다른 인플루엔자 및 B 바이러스 균주에 의해 발현 HA 및 NA 단백질을 위해 적응 될 수있다. 재조합 HA (RHA)와 NA (RNA) 단백질은 ELISPOT 및 ELISA와 같은 면역 학적 분석을위한 중요한 시약, 그리고 백신 표준화, 항체 발견, 분리 및 특성 분석을위한 다양한 프로그램도 사용합니다. 또한, 재조합 NA 분자는 작은 분자 억제제에 대한 화면으로 사용하고 NA의 효소 기능의 특성뿐만 아니라, 항 바이러스제에 대한 민감도에 유용하다 할 수있다. 재조합 HA 단백질은 또한 바이 아르NG는 동물 모델에서 실험적인 백신으로, 테스트 및 재조합 HA 기반의 백신은 최근에 인간에 사용하기 위해 FDA에 의해 허가했다. 그것은 빠르고 저렴한 비용으로 단백질의 대량 생산이 가능하기 때문에 우리는이 분자를 생산하기 위해 여기에 설명하는 방법은, 곧장 앞으로 인플루엔자 실험실에서 연구를 촉진 할 수 있습니다. 우리는 인플루엔자 바이러스의 표면 당 단백질에 초점 여기 있지만,이 방법은 또한 다른 바이러스 및 세포 표면 단백질을 생산하는 데 사용될 수있다.

A/Shanghai/1/13 및 A/Anhui/1/13에서 HA 분자는 약 20 ㎎ / L 문화의 수율을 잘 표현했다. 두 균주의 NA 분자는 A/Shanghai/1/13 0.2 ㎎ / L의 문화에서 A/Anhui/1/13 0.7 ㎎ / L에 이르기까지 적당한 표현 수준을 보여 주었다. 네 개의 단백질 제제는 발현 수준에 의해 설명 될 수의 NA보다 높은 순도의 복지가와 (그림 8a 및 B) 불순물이없는 매우 작은이 있었다. A/Shanghai/1/13 HA 더욱 광범위 중화 스토...

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Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

여기에서 우리는 곤충 세포에 새로운 중국어 H7N9 바이러스에서 파생 제대로 접혀 기능 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 표현하는 방법에 대해 설명합니다. 기술은 어떤 바이러스 성 또는 세포 표면 단백질의 ectodomains을 표현하도록 할 수있다.

배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.8K 조회수.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  여기에서 우리는 곤충 세포에 새로운 중국어 H7N9 바이러스에서 파생 제대로 접혀 기능 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 표현하는 방법에 대해 설명합니다. 기술은 어떤 바이러스 성 또는 세포 표면 단백질의 ectodomains을 표현하도록 할 수있다. 

비디오: Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

연구

면역학 및 감염병학

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질과 마우스 MX1 단백질의 공동 면역 침전

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

형광 기반의 뉴 라미니다 아제 억제 분석은 항 바이러스제의 뉴 라미니다 아제 억제제 클래스에 인플루엔자 바이러스의 감수성을 평가하기 위해

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...