저자는 박사 부부의 실험실에서 과거와 현재 회원에게 감사의 말씀을 전합니다. 피터 Palese의와 NDV의 개발을위한 아돌 포 가르시아 - 사스 트레는 유전학 기술과 기술 지원을 역방향. NIAD이 R01AI088770를 부여하고 우수의 국토 안보부 과학 기술 센터의 부서에 의해 의해 AG-S 실험실에서 뉴캐슬 질병 바이러스의 연구는 부분적으로 재정 지원 신흥 및 동물 매개 동물의 질병 (CEEZAD, 보너스 번호 2010-ST-061-AG001). LM-S 실험실에서 연구는 NIH 보조금 RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, 인플루엔자 연구 및 감시 (HHSN266200700008C)에 대한 우수의 NIAID 센터, Biodefense에 면역 모델링을위한 로체스터 센터의 대학 (HHSN272201000055C)에 의해 자금 지원 .

1. 포유 동물 세포의 준비 (그림 4A, 1 일) 분할 HEP-2 또는 A549 세포를 6 - 웰 플레이트에 형질 전날. 세포의 밀도는 다음 날 80-90% 합류에 도달해야합니다. 일반적으로 합류 100mm 요리 8 우물에 (물론 당 6 ~ 10 x 1 주위 세포)를 분할 할 수 있습니다. 각각의 바이러스가 구출 될 때까지, 2-4 다른 우물이 포함되어야한다,뿐만 아니라 각각 형질 전환 및 MVA-T7 감염의 효율성을 모니터링하기위한 제어는 pCAGGS-GFP 및 pCITE-GFP 18 2 여분의 우물,,. 2. 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소 (MVA-T7)를 발현하는 재조합 수정 된 우두 앙카라 바이러스와 포유 동물 세포의 감염 (그림 4A, 2 일) <ol><li> 37 ° C에서 PBS 1x/BA/PS와 미디어를 따뜻하게 </li><li> PBS 1x/BA/PS 1 ㎖로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 감염의 다중성 (AT MVA-T7 바이러스로 배양 된 포유 동물 세포를 감염 모이1) 실온에서 1 시간 동안 PBS / BA / PS 200 μL의 최종 볼륨 PFU / 셀. </li><li> 3에 설명 된대로 바이러스 감염 배양하는 동안, 형질 믹스를 준비합니다. </li></ol> 3. 포유 동물 세포의 형질 (그림 4A, 2 일) <ol><li> 리포 펙 타민의 준비 : 구출 작전 당 티멤 250 ㎕ 씩 LPF2000 1-2 μg을 혼합하고 실온에서 5 분 동안 품어. </li><li> DNA의 준비 : 티멤 50 μL의 각 구조에 대한 플라스미드 칵테일을 확인합니다. 0.4 pTM1-NP ㎍의, pTM1-P 0.2 μg, 튜브 당 pTM1-L의 0.2 μg을 추가합니다. 각 튜브에 구출 할 NDV의 전체 길이의 cDNA 클론의 1 μg을 추가합니다. 또한 두 개의 제어 형질,는 pCAGGS-GFP의 2 μg 하나 (형질 전환 효율을 확인하기 위해) 및 (T7 효소가 MVA-T7에 의해 발현을 구동 확인) pCITE-GFP의 2 μg과 다른 준비를합니다. </li><li> LPF2000-티멤 용액을 5 분 (단계 3.1)에 대한 예비 인큐베이션 한 후, 추가 250DNA 튜브에 대한 해결책의 μL (3.2 단계) 및 실온에서 20 ~ 30 분 동안 품어. </li><li> MVA-T7과 부화 후, 흡인에 의해 바이러스 접종을 제거하고 DNA-LPF2000 형질 믹스 (단계 3.3)로 교체합니다. </li><li> 각 요리에 DMEM 10 % FBS / PS의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2에서 6 ~ 8 시간 (또는 야간)에 감염된 / 형질 전환 세포를 품어하고 신선한 DMEM 10 % FBS / PS 1.5 ㎖로 형질 미디어를 교체합니다. </li><li> 24 시간 후 형질에서 제어 우물은 형질 전환 효율 (는 pCAGGS-GFP) 및 T7 효소 활동 (pCITE-GFP) (그림 5A)을 평가하기 위해 형광 현미경으로 관찰 할 수있다. 아래에 설명 된대로 새 섬유 아 세포로 감염된 / 형질 전환 세포의 공 배양을 진행합니다. </li></ol> 4. 조류 세포와 포유 동물 세포의 공동 문화 (그림 4A, 3 일) 일반적으로 닭의 합류 100mm 조직 배양 접시 (CEFs) OR 오리 (인증 된 정의) 배아 섬유 아 세포는 두 개의 형질 우물 당 사용된다. 사전에 모든 구조 시도 당 조류 세포의 충분한 100mm 조직 문화 요리를 준비해야합니다. 바이러스의 효율적인 구조를 들어, DMEM 10 % FBS / PS 미디어는 막액 30 mM의 MgCl2를 5 %로 보충된다. 이 시점에서 24 시간 파이, 포유 동물 세포 인해 MVA-T7 감염,도 5a에 asevident에 세포 변성 효과 (CPE)를 보여주는 시작할 수 있습니다. <ol><li> 37 ° C.에 PBS의 1X 및 미디어 워밍업 </li><li> PBS 1X 1 ㎖로 2 배, 포유 동물 세포를 씻으십시오. </li><li> 그들은 분리 될 때까지 EDTA-트립신의 0.2 ml의 포유 동물 세포를 Trypsinize. DMEM 10 % FBS / PS 1 ㎖로 세포를 재현 탁 5 % 막액, 30 mM의 MgCl2를하고 100mm 조직 배양 접시로 전송. 동일한 매체의 3 ML을 추가합니다. </li><li> PBS 1X의 4 ㎖로, 두 번, 조류 세포를 씻으십시오. </li><li> 세포가 분리 될 때까지 1 EDTA-트립신 ㎖ 및과를 Trypsinize 조류 세포는 37 ° C에서 1 ~ 2 분 동안 품어. 재현 탁 일8 DMEM 10 % FBS / PS, 5 % 막액, 30 mM의 MgCl2를 2 ㎖ 및 8의 총 볼륨의 공 배양 100mm 조직 배양 접시에있는 포유 동물 세포에 트립신 세포 4 ㎖를 추가를 추가 전자 셀 ML (4 ML의 포유류, 4 ㎖의 조류 세포). </li><li> 부드럽게 균일 한 분포가 다음 3 ~ 4 일 37 ° C에서 인큐베이터에 배치하기 위해 손으로 100mm 접시에 공동 배양 된 세포를 흔들. 3 4 일 포유류 및 조류 세포의 공동 배양 후 계란을 감염에 대한 기준은 (세포 반올림, 죽음, 표면 박리 등이.) MVA-T7 바이러스 감염에서 관찰 얼마나 많은 세포 변성 효과에 따라 달라집니다. </li></ol> 5. 닭 유정란의 감염 (그림 4A, 일 6 ~ 7) <ol><li> 포유 동물 및 조류 세포의 공 배양 3-4 일 후, 조직 배양 상등액 1 ㎖를 제거하고 에펜 도르프 튜브에 추가한다. </li><li> 벤치에서 12,000 rpm에서 1 분 동안 조직 배양 상층 액을 원심 분리기세포 파편을 제거하는 최고 원심 분리기. </li><li> 공기 주머니와 뇨 공동 사이의 인터페이스를 확인하기 위해 빛을 불빛에 비춰 조사 상자를 사용하여 계란을 촛불. 인터페이스 테두리 혈관 지역화를 피하는 표시를합니다. 무균 조건을 확립하기 위해 계란을 통해 70 % 에탄올 스프레이. 부드럽게 표시된 자리에 달걀 껍질에 구멍을 뚫어 뇨 공동으로 수직으로 직접 바늘을 목표로, 인슐린 (1 ㎖)을 주사기를 사용하여 상층 액 500 μl를 접종. (그림 4B). </li><li> 녹은 왁스 나 파라핀 달걀 껍질에 흠을 봉인. </li><li> 37 ℃에서 2 ~ 3 일 계란을 품어 </li></ol> 6. 감염된 닭 유정란에서 뇨의 유체 (그림 4A, 8 ~ 10 일)의 수확 <ol><li> 닭 배아를 죽이고 피를 응고하기 위해 4 ° C에서 2-4 시간 또는 하룻​​밤 감염된 알을 품다. </li><li> 70 % 에탄올 (멸균 조건을 유지하기 위해)으로 스프레이 계란. </li><li> 조심스럽게 숟가락으로 공기 구멍을 통해 계란의 꼭대기 부분을, 누르십시오. 달걀 껍질에 균열이되면, 집게와 조각을 제거하고 완전히 뇨 막을 노출. </li><li> 혈관의 손상과 노른자를 피하고, 집게와 가위로 뇨 막을 절개하여 뇨 구멍을 노출합니다. </li><li> 조심스럽게 주걱으로 배아를 아래로 누르고 10 ㎖ 피펫으로 상향 유동 막액 (달걀 당 8 ~ 12 ㎖)에 수집합니다. 노른자 막 손상을 방지. 얼음에 15 ML의 원심 분리기 튜브 (달걀 당 하나의 튜브를 사용)에 막액을 전송합니다. </li><li> 1,500 rpm에서 5 분간 원심 분리하여 막액 명확화. 펠렛을 방해하지 않고 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 최대 1 주일 동안 4 ° C에서 저장 샘플, 혈구 응집 분석에 의해 NDV의 존재를 확인한까지. </li></ol> 7. 혈구 응집 (HA) 분석 allant에서 바이러스의 존재감염된 계란에서 OIC 유체는 칠면조 적혈구 (RBC)를 hemagglutinate 할 수있는 능력에 의해 육안으로 확인할 수 있습니다. NDV의 경우에는, 밀리리터 당 단위를 형성하는 약 10 6 플라크 (PFU)는 HA 분석에서 양성 신호를 제공하기 위해 요구된다. HA의 분석은 V-바닥 96 - 웰 플레이트에서 실시된다. 네거티브 (PBS 1X, 비감염 막액)뿐만 아니라 양극 (모든 NDV 바이러스로부터 막액) 컨트롤 샘플은 항상 검증을 어떤 HA 분석에 포함되어야한다. HA 분석을 수행하려면 : <ol><li> 피펫 V-바닥 96 - 웰 플레이트에 웰 당 PBS의 1X의 50 μL. </li><li> 피펫 판의 첫 ​​번째 열에서 우물에 막액 샘플 50 μL. 판의 나머지 부분을 통해 2 배 시리얼 희석을 수행하고 마지막 열에서 우물에서 마지막으로, 추가 50 μl를 폐기합니다. </li><li> 잘 당 PBS 1X 0.5 % 칠면조 RBC의 50 μl를 분배. 부드럽게 눌러 판을 흔들. </li><li> 4 ° C에서 (또는 얼음) F에서 접시를 품어또는 30 ~ 45 분 또는 클리어까지 펠릿은 음성 대조군 웰에 형성된다. </li></ol>

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Virol. 84, 781-788 (2003).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).</li><li>Calain, P., Roux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rule+of+six,+a+basic+feature+for+efficient+replication+of+Sendai+virus+defective+interfering+RNA.">The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.</a> J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).</li><li>Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-deficient+vaccinia+virus+encoding+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+for+transient+gene+expression+in+mammalian+cells.">Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells.</a> Virology. 210, 202-205 (1995).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review.+New+mammalian+expression+vectors.">Product review. New mammalian expression vectors.</a> Nature. 348, 91-92 (1990).</li><li>Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+of+mononegavirales.">Reverse genetics of mononegavirales.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).</li></ol>

아돌 포 가르시아 - 사스 트레는 시나이 산에서 의학의 아이칸 학교가 소유하고 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스에 대한 특허의 발명가이다.

몇몇 요인 NDV 구출하면서 좋은 결과를 달성하기 위해 고려되어야한다. 첫째, 사용되는 전장 cDNA 구조체는 NDV 게놈에 트랜스 진 새로운 / 수정 기능 내장 할 수 있도록 설계 될 필요가있다. (II)에는 추정 GE 또는 GS 시퀀스가​​ 외국에없는, 위에서 언급 한 바와 같이이 (I) 해당 유전자의 끝 (GE), intergenic (IG) 유전자의 시작 (GS) 시퀀스가​​ 필요한 경우 추가 할 수 있다는 것을, 의미 유전자, 그리고 (...

뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 Avulavirus 속 1에 속하는 조류 paramyxovirus은 심각하게 전 세계의 가금류에 영향을 미칠 수있는 경제 관련 때문에 널리 연구되고 감시를 받고 인수 공통 에이전트입니다. 아니 인간의 병원체이지만, NDV는 철저 모델 paramyxovirus로 인해 고도의 흥미, 자연, 온 콜리 틱 속성 6 모두 수의사 필드 이상으로 연구되고있다. NDV에 대한 연구는 크게 첫 번째 Conzelmann 및 coleagues 2로 광견병 바이러스에 대한 설명 단일 가닥이 아닌 분할 된 음의 센스 RNA 바이러스에 대한 역 유전학 기술의 개발 혜택. 외국 유전자 또는 야생형 유전자의 변형을 운반 유전자 변형 NDVs의 다양한 널리 그 이후로 연구되고있다. 이러한 재조합 바이러스로 작업은 NDV의뿐만 아니라 관련 구호 물자의뿐만 아니라 다른 독성 요소를 특성화하는 것이 중요했습니다N 인플루엔자 바이러스와 같은 병원체 7 - 나 응급 니파 바이러스 8. 또한, 서로 다른 다수의 연구는 주로 바이러스의 면역 자극 특성을 향상시킴으로써, NDV 6,9,10의 타고난 항 종양 활성을 개선하기 위해 이러한 기술을 사용하는 방법을 살펴 보았다. 재조합 NDVs에 대한 연구의 관련 영역이 인플루엔자 5,11,12와 같은 다른 바이러스 성 질병에 대한 백신 후보의 생성하고있다, HIV (13)는, SARS 15, 14 홍역, 또는 그 호흡 sincytial 바이러스 (RSV) (16)에 의해 발생합니다. NDV 의해 제공된 다양한 주목할만한 장점은 인간 개체군에서 기존 면역 결핍이다 사이에, 외래 유전자 삽입, recombinatory 활성의 결여와 전체적으로 전술 천연 면역 자극 특성 (17)과 결합 된 높은 안전성 프로파일의 안정성. 또한 P의 재조합 이가 백신의 잠재적 인 사용을 주목할oultry, NDV 모두에 대한 보호 및 고병원성 조류 인플루엔자는 11, 12를 바이러스. 이 때문에 또한 인간에 지칠대로 지친 조류 독감의 가능한 간 특정 점프를 방지하는 데 도움이, 길 들여진 동물을 야생에서 확산 후자의 가능성을 줄일 수있는 좋은 방법이 될 수 있습니다. 마지막으로, 리포터 발현 NDV은 선천성 면역 반응의 평가뿐만 아니라 여러 바이러스 18-27 의해 인코딩 인터페론 길항 물질의 식별을 위해 사용되었다. 재조합의 구조 과정은 비 분할, 음의 가닥 RNA 바이러스는 기본적으로 인위적으로 리보 또는 RNP로 알려진 최소한의 감염성 분자 기계, (그림 2)를 코딩하는 cDNA를 형질 전환에 의해 생산 세포에서 바이러스의 복제 사이클을 강제에 구성되어 있습니다. RNP들이 바이러스 중합 효소 (P와 L 단백질)로 구성되어, 핵 단백질 (NP)와 바이러스의 전체 길이 antigenomic RNA. 이 RNA + antigenome는 일입니다또한 바이러스 RNP의 단백질의 나머지 부분과 연관된 상보적인 RNA-게놈의 생성에 필요한 전자 서식, 천연 바이러스 감염시 세포의 세포질 (도 2A에 출시 것이라고 같은 감염성 복잡한 되풀이되었습니다 ). 이후이 단계에서 바이러스 성주기는 자연스럽게 진행하고 수정 된 게놈을 encapsidating 재조합 비리는 (그림 2B)를 생성됩니다. 현저하게, 대신 antigenomic의 cDNA 게놈 cDNA를 형질 크게 손상 또는 완전히 복구 효율 2,28-30을 폐지. antigenomic cDNA를 형질 감염이 되어도, 형질 감염된 세포에서 RNP들로 재조합 RNA의 이입의 효율은 아마도 매우 낮다. 이 때문에, NDV에 대한 구조 프로토콜은 종종 관대 한 세포 및 / 또는에 의해를 공동 배양하여 원래 형질 세포에서 방출되는 몇 가지 바이러스 입자의 증폭에 대해 서로 다른 단계를 포함유정란의 감염. 이전 구조로, cDNA를 원하는대로 수정을 생성하기 위해 표준 복제 절차에 의해 조작 할 수 있습니다. 다른 유전자 생성물 및 바이러스 조절 서열의 특정 돌연변이는 똑 바르게 이러한 방법을 달성 할 수 있지만, 재조합 NDV 관련된 발행 작업의 대부분은 NDV 게놈에 전사 단위의 새로운 첨가를 요구했다. paramyxovirus 제품군의 다른 제품과 마찬가지로, NDV 게놈 차등 바이러스의 생활주기 1 중요한 감소 그라데이션의 3 &#39;말단에 자신의 위치와 관련에 따라 표현되는 여섯 전사 단위로 8 개의 서로 다른 단백질을 인코딩합니다. 이 때문에, 게놈 내 새로운 전사 유닛의 위치는 신중 바이러스 복제의 형질 전환 유전자 및 장애의 발현 사이의 균형을 달성하도록 선택되어야한다. P와 M의 사이 유전자 삽입은 대부분, t를 사용되어왔다무릎 다른 사이트는 13,31을 테스트되었습니다. (I) NDV 게놈에 포함되는 새로운 유전자가 바이러스 성 RNA 의존-RNA에 해당하는 신호의 통제하에 있어야한다 : 무엇이든간에 삽입, NDV의 cDNA에 복제는 rescuable 구조를 생성하기 위해 몇 가지 규칙을 따라야합니다 중합 효소. 이러한 시퀀스는 새로운 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 상류에 추가되어야하므로 폴리머는 단일 염기 intergenic 서열 (IG)에 의해 이격 된, 이전의 유전자 (GE)과 새로운 형질 전환 유전자 (GS)의 시작 부분의 끝을 인식 할 수있다 . Paramyxoviridae 가족의 대부분의 회원으로 NDV의 (II)의 효율적인 복제, 게놈 길이의 여러 존재에 의존, 유효한 코작 (K) 진핵 생물의 리보솜의 번역을 개선하기 위해 일련의 추가는 또한 더 나은 외국 단백질 발현 32에 추천 여섯 (33)는, 따라서, NDV에 모든 삽입이 &quot;6의 규정&quot;에 따라해야합니다. 필요한 경우, REQuired 추가 뉴클레오티드 하류 새로운 ORF를 추가 할 수 있습니다, 그리고 (iii) 유전자의 순서가 찾아 확인해야 할 GE 및 구조의 효율성, 유전자 발현 및 / 또는 바이러스의 생존 능력에 지장을 줄 수있는 시퀀스 등 GS. 존재하는 경우,이 시퀀스는 침묵 돌연변이에 의해 제거해야합니다. 상술 한 규칙에 따라 재조합 전체 길이 cDNA를 효율적으로 생성 여기서 설명하는대로 유전자 재조합 NDV를 생성하기 위해 첫 번째 단계이다. 시스템의 모든 DNA 구조는 T7 RNA 중합 효소 프로모터 (그림 3)의 제어하에 있습니다. 이 세포질 효소는 재조합 수정 된 우두 앙카라 바이러스 (MVA-T7) (34)와 동시 감염에 의해 트랜스에 제공된다. 그림 3a는 전체 길이 antigenomic cDNA를 5 인코딩 pNDV-B1 플라스미드를 보여줍니다. 그림 3b는 pTM1 플라스미드는 NP를 인코딩을 보여줍니다, P와 L의 ORF. , U를 인코딩 플라스미드 pCITE-GFP,개 nder T7 프로모터, 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 닭 베타 액틴 프로모터 35에서 동일한 ORF를 암호화는 pCAGGS GFP (18)는, 컨트롤로 사용됩니다. 이 프로토콜에서 우리는 lentogenic NDV 변형 Hitchner의 B1 5 (그림 4)의 cDNA의에서 재조합 NDV를 구출하는 절차를 보여줍니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% Bovine Albumin (BA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232-936-2</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Cell lines 
			A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 &#176;C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. 
			Embryonated chicken eggs 
			Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 &#176;C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. 
			Turkey red blood cells (RBC) 
			Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 &#176;C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 &#176;C for several days. 
			Plasmids 
			Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer&#39;s instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 &#956;g/&#956;l and stored at -20 &#176;C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. 
			Viruses 
			The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. 
			Tissue culture media and solutions: 
			DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 &#176;C. 
			10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 
			1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 
			100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2&#8226;6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 
			1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4&#176;C.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant newcastle disease virus from cdna

뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV), 가족 Paramyxoviridae 1의 Avulavirus 속의 프로토 타입 멤버가 아닌 분할, 음의 의미는 단일 가닥, 예방 접종에 대한 벡터 잠재적 인 응용 프로그램과 RNA 바이러스 (그림 1)을 포위하고있다 인간의 질병의 치료. 이러한 응용 프로그램의 심층 탐사는 cDNA를 2-5로 자신의 완전한 게놈을 암호화하는 플라스미드로부터 재조합 바이러스를 구출하는 역 유전학 기술의 설립 후 수있게되었다. 바이러스 cDNA를 편리 바이러스의 유전자형을 변경 및 / 또는 새로운 전사 단위를 포함하는 표준 클로닝 절차를 사용하여 시험 관내에서 수정 될 수있다. 이러한 유 전적으로 변형 된 바이러스의 구조는 인자 감염의 여러 단계에 영향을 미치는뿐만 아니라 항원의 발현 및 전달을위한 벡터의 개발 및 개선을 허용을 이해하기 위해 유용한 도구를 제공한다예방 접종 및 치료를위한. 여기에서 우리는 재조합 NDVs의 구조에 대한 프로토콜을 설명합니다.

NDV의 구조는 정기적으로 바이러스의 전체 cDNA를 액세스 할 수있는 실험실에서 수행 잘 설립 절차입니다. 그러나, 본 방법의 본질적인 스토캐스틱 자연 어려운 100 % 복구 효율을 달성 할 수있다. 프로세스의 초기 단계, MVA-T7과 특수 형질 전환 효율과 감염을 모니터링 가능한 문제. 그림 5A 표준 형질 성공적인 NDV 구조에 대한 충분한 형질 전환 / 감염의 효율을 보여줍니다를 식별하는 데 ...

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Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 광범위 중에서도, 백신 및 치료를위한 새로운 벡터를 개발하기 위해 지난 몇 년 동안 연구되어왔다. 이 연구로 인해 이러한 우리가 여기에서 설명하는 것과의 cDNA에서 재조합 바이러스를 구출하는 기술로 가능했습니다.

의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

rescue-of-recombinant-newcastle-disease-virus-from-cdna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.2K 조회수.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV)는 광범위 중에서도, 백신 및 치료를위한 새로운 벡터를 개발하기 위해 지난 몇 년 동안 연구되어왔다. 이 연구로 인해 이러한 우리가 여기에서 설명하는 것과의 cDNA에서 재조합 바이러스를 구출하는 기술로 가능했습니다. 

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

연구

면역학 및 감염병학

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

코딩 및 비 코딩 RNA 클래스의 식별 표시 돼지에서 전 혈

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...