이 작품은 UCLA-치료 센터, Crohn의 및 미국 경력 개발 상 (# 2691)와 건강 NIDDK K01 국립 연구소 (DK084256) 혼 와이 쿤에 대한 자금의 대장염 재단의 파일럿 및 타당성 연구 기금의 지원을받는되었다. 골수 방사선 작업 버나드 레빈과 AIDS 연구 마우스 / 인간 키메라의 핵심 시설에 대한 UCLA 센터의 스콧 주방이 도움이되었습니다. 유동 세포 계측법 작업은 UCLA 벡터 핵심 시설의 지원을했습니다.

1. 전에 - 당신 - 시작 기술 고려 사항 <ol><li> 해당 CD 분자와 마우스가 주요 마우스 공급 업체에서 구입 할 수 있기 때문 우리는 실험을 위해 C57/BL6 야생 형 마우스 및 녹아웃 마우스를 모두 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 이 야생 타입 마우스와 골수 이식 후 기증자의 세포를 파생 녹아웃 마우스를 추적하기가 어렵습니다 때문에, 야생 형 생쥐를 표현하기 위해 CD45.1 마우스를 사용 할 필요가 있습니다. (CD45.1 C57/SJL WT 마우스 잭슨 연구소 주식 # 002014). </li><li> 대부분의 마우스 식민지가 CD45.2 있습니다. 우리 녹아웃 마우스는 CD45.2 유전자형 (: 잭슨 연구소 주식 # 000664 대안 CD45.2 WT 마우스 소스)에 속한다. CD45.1 또는 CD45.2 유전자형의 결정은이 프로토콜의 제 7에서 설명 드린 바와 같이 골수 및 말초 혈액의 유동 세포 계측법을 사용하여 수행 할 수 있습니다. </li><li> 조사 후 마우스 면역을 훼손하고있다. 병원체 무료 시설의 생쥐세요. </li><li> irradiator의 운영 특수 보안 clearanc가 필요합니다전자 및 교육. 교육 및 승인 과정에서 시간을 절약하기 위해, 그것은 irradiator를 작동 할 수 있습니다 자격을 갖춘 기술자와 실험실과 협력하는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 대부분의 기관은 경험이 풍부한 기술자와 유동 세포 계측법 실험실을 갖추고 있습니다. 유동 세포 계측법 운영 문제를 최소화하기 위해, 당신이 시작하기 전에 경험이 풍부한 기술자와 유동 세포 계측법 실험 계획을 논의하는 것이 더 나을 듯합니다. </li><li> 마우스가이 방식 (그룹 당 10 마우스)에 할당되었습니다 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 그룹 </td><td></td><td> 받는 사람에게 골수 기증 </td><td> 치료 </td></tr><tr><td> </td><td> BM 교환 </td><td> CD45.1 WT에 CD45.2 KO </td><td> DSS 대장염 </td></tr><tr><td> B </td><td></td><td></td><td> 물 정상적인 제어 </td></tr><tr><td> C </td><td> BM 교환 </td><td> CD45.1 WT에 CD45.2 KO </td><td> DSS 대장염 </td></tr><tr><td> 디 </td><td></td><td></td><td> 물 정상적인 제어 </td></tr><tr><td> E </td><td> 가짜 </td><td> CD45.1 WT에 CD45.1 WT </td><td> DSS 대장염 </td></tr><tr><td> 에프 </td><td></td><td></td><td> 물 정상적인 제어 </td></tr><tr><td> 지 </td><td> 가짜 </td><td> CD45.2 KO로 CD45.2 KO </td><td> DSS 대장염 </td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td> 물 정상적인 제어 </td></tr></tbody></table> 실험 프로토콜의 * 간단한 그림은 그림 1에 표시됩니다. 2. 받는 마우스의 조사 <ol><li> 마우스는 사육과 병원균이없는 시설에 보관됩니다. 필터 autoclaved 조사 파이의 장소는 마우스. 조사 파이의 각 슬롯에 하나의 마우스를 놓습니다. irradiator에 파이를 놓고 턴테이블 파이, 선회되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 공기 펌프를 켜십시오통풍을 위해. irradiator 문을 닫고 닫아. </li><li> 10 분 (방사선 소스와 반감기에 따라 다름) 주변 1,000 방사선 (10 GY 동일합니다)를 함께 쥐를 비추다. 이 시점에서 방사능 마우스 immuno-위험하고 감염에 대한 면역력 약한 있습니다. 조사 후, 파이를 꺼내와 동물 시설의 바이오 안전성 캐비넷 교통 멸균 용기에 넣습니다. 감염의 기회를 최소화하기 위해 외부 환경에 쥐를 노출하지 마십시오. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛에서 autoclaved 침구 (. - 100 ML 물을 당 3.12 ML을 케이지 당 4 쥐가 sulfatrim 정지와 함께 새로운 멸균 물을 추가)를 autoclaved 마우스 케이지에 쥐를 전송합니다. </li><li> 항생제는 빛에 민감한만큼 알루미늄 호일로 물 병을 넣어. 케이지에로드하기 전에 잘 sulfatrim 솔루션 병을 섞어 흔들어. </li></ol> 3. 기증자 골수에서 DNA를 추출하는 <ol><li> 이산화탄소 또는 isoflur있는 마우스를 희생ance 및 1:200 소독약 솔루션에 다음 잠그다. 피부에 오줌와 오픈 뼈를 해부하는 70 %의 에탄올과 쥐를 스프레이. </li><li> 살균에 대한 70 %의 에탄올에 절개 악기를 적시 게. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛에 절개를 수행합니다. 근육과 인대를 부착에서 무료로 상완골, 대퇴골, 경골과 비골 뼈를 노출 살균 분해 악기를 사용하십시오. </li><li> 붉은 골수을 보여 뼈의 양쪽 끝을 잘라 냈어. 집게로 뼈를 잡아. 페트리 접시 3 ML의 주사기와 바늘 25g까지로 차가운 PBS로 적색 골수를 플러시. 더 많은 골수 세포를 얻을 수 있도록 뼈의 양쪽 끝에서 플러시. </li><li> 반복 흡인과 배출에 의해 적색 골수 플러그를 깨고 6 ML 주사기와 18G1 / 2 바늘을 사용합니다. 50 ML 팔콘 튜브와 골수를 전송합니다. </li><li> 4에 5 분 ° C.에 1,800 RPM에서 골수를 스핀 다운 5-10 초에 vortexing하여 표면에 뜨는, resuspend 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 멸균 물 10X RBC의 용해 버퍼를 희석. 광고D 1X RBC 용해 버퍼 (기증자 마우스 당 5 ML), 5 초에 다시 한번 소용돌이, 룸 온도에서 정확히 3 분 유지. </li><li> 3 분 후, 용해 및 혼합을 중지 할 20 ML 차가운 PBS로 튜브를 채 웁니다. 직접 새로운 50 ML 팔콘 튜브에 40 μm 셀 스트레이너를 통해 콘텐츠를 넣어. </li><li> PBS의 5 ML을 원래 튜브를 씻어뿐만 아니라 셀 스트레이너에 전송할 수 있습니다. PBS와 혼합있는 50 ML까지 가기. </li></ol> 4. 골수 기증자 셀을 계산 <ol><li> Eppendorf 튜브 및 Eppendorf 튜브와 혼합에 골수 정지 100 μl에 Trypan 파랑의 100 μl를 추가합니다. hemocytometer에 스테인드 세포 혼합물을 피펫. </li><li> 셀의 금액은 매 튜브의 총 생활 골수 세포 수 = 흠없는 전화 번호 16 제곱에서 x 2 (Trypan 푸른 희석으로 인해) × 10,000 X 50 ML에 의해 계산됩니다 </li><li> 4에 5 분 ° C.에 2,000 rpm에서 50 ML 팔콘 튜브에 골수 세포를 스핀 다운 </li><li> 표면에 뜨는을 제거합니다. 기초전체 셀 개수에 ML 당 1 개 10 8 셀에 PBS로 펠릿을 resuspend </li></ol> 5. 받는 마우스에 주입 <ol><li> 열 패드에와 지구 온난화 램프 아래에있는받는 사람 쥐를 따뜻하게. restrainer에받는 사람 쥐를 놔. intravenously 100-200 μl에 마우스 당 1 개 10 7 세포를 주입. </li><li> 기증 골수의 주입은 조사 후 4-24 시간 사이에 수행되어야합니다. </li><li> 케이지 당 4 개의 주입 마우스를 올려. 병원체 무료 동물 시설의 처음 4 주 동안 항생제 - 처리 된 물과 autoclaved 케이지의 주입받는 쥐를 유지하고 쥐가 면역을 회복 보자. 변경 케이지, 항생제 - 처리 물과 음식은 4 일마다 위생을 유지합니다. </li></ol> 6. 대장염의 대장염 및 평가의 유도 <ol><li> 사주 조사 및 골수 이식 후 자신의 정상을 회복하기 위해 항생제없이 일반 물로 전환, 2보다 주 동안 쥐를 유지microflora를 약탈. </li><li> 육주 골수 주입 후 초기 체중을 측정합니다. 일부 마우스는 대장염을 유발 물 광고 libitum를 마시는 5 % dextran 황산 제공됩니다. 일부 마우스는 일반 제어 그룹으로 정기적으로 식수를 제공하고 있습니다. </li><li> 오일 후, 말초 혈을 인출 헤파린 코팅 튜브 (Vacutainer)에 전송하고 얼음에 유의하시기 바랍니다. 1 관에 4 마우스에서 혈액을 수영장을 보유하고 있습니다. 세포 염색 버퍼 = 600 μl를 300 μl를 혈액 300 μl 조화를 이루고 있습니다. 100 μl 5 개 Eppendorf 튜브, 각각 피를 나눈다. </li><li> 이산화탄소 또는 isoflurane과 쥐를 희생. 매크로 손상 점수를 (세부 1 다른 주피터 비디오 간행물을 참조하시기 바랍니다) 평가합니다. 체중의 변화를 측정합니다. 디지털 캘리퍼스로 측정 장 길이와 두께. 대변​​ 텍스처 (하드, 소프트 또는 피) 관찰. Hemooccult과 배설물에 잠혈를 결정합니다. 결장 조직을 해부하고 H &amp; E의 착색을위한 포르말린에 고정시킨다. </li><li> 한 대퇴골 흔적을 해부NE 당 마우스 골수를 추출하고 25g까지 바늘 1 ML의 주사기를 통해 차가운​​ PBS로 골수를 플러시. 풀 네 골수 1 관에 플러그와 얼음에 유의하시기 바랍니다. </li><li> 더 골수 플러그가 존재하지 않습니다 때까지 페트리 접시, 전단 18G 바늘, 5 ML의 주사기를 여러 번와 골수 플러그에 골수 하거라. </li><li> 4 ° C.에 5 분에 1,500 RPM과 스핀 다운 표면에 뜨는, 600 μl 세포 염색 버퍼와 resuspend 제거합니다. 100 μl 5 개 Eppendorf 튜브, 각에 resuspended 골수를 나눌 수 있습니다. </li></ol> 7. 유동 세포 계측법에 의한 골수 이식의 품질 검사 <ol><li> 혈액 또는 골수 # 1-5의 각 샘플 튜브를 레이블 : </li><li> 어둠 속에서 각각의 튜브에 대한 항체 혼합물을 준비합니다. </li></ol> # 1 없음 항체 # 2 30 μl FITC의 isotype 제어 + 30 μl PE isotype 제어 + 15 μl CD16/32 차단 # 3 30 μl FITC CD45.1 AB + 15 μl CD16/32 차단 # 4 30 μl PECD45.2 AB + 15 μl CD16/32 차단 # 5 30 μl FITC CD45.1 AB + 30 μl PE CD45.2 AB + 15 μl CD16/32 차단 <table border="1"><tbody><tr><td> 혈액 또는 골수 샘플 # 1 아무것도 추가하지 </td></tr><tr><td> 각 혈액 또는 골수 샘플 # 2 항체 혼합물 # 2의 5 μl를 추가합니다 </td></tr><tr><td> 각 혈액 또는 골수 샘플 # 3 항체 혼합물 # 3 3 μl를 추가합니다 </td></tr><tr><td> 각 혈액 또는 골수 샘플 # 4 항체 혼합물 # 4의 3 μl를 추가합니다 </td></tr><tr><td> 각 혈액 또는 골수 샘플 # 5 항체 혼합물 # 5의 5 μl를 추가합니다 </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 30 분에 얼음 어둠 속에서 보관. </li><li> 각 튜브에 두 ML 1X RBC의 용해 버퍼를 추가합니다. 15 분에 얼음에 어두운에 유의하십시오. </li><li> 4에 5 분 ° C. 1,500 rpm으로 세포를 스핀 다운 (GH 3.8 회 1,500 RPM = 350 XG) 표면에 뜨는 제거합니다. 어두운 다음, 소용돌이 간략 500 μl 세포 염색 버퍼로 펠렛을 Resuspend. </리&gt; <li> 유동 세포 계측법에 의한 immunostained 혈액과 골수 샘플에 CD45.1 (WT을 대표)와 CD45.2을 (KO를 대표하는) 확인합니다. KO CD45.2을 표현하기 위해 WT CD45.1와 PE를 표현하기 위해 FITC를 선택합니다. </li><li> FlowJo 소프트웨어 유동 세포 계측법 결과를 분석합니다. PE 비율이나 PE : FITC의 비율을 계산 FITC 비율은 기증 유전자형 피가 골수에서 지배적 인 유전자형인지 여부를 확인합니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 골수 이식 접근 방식은 면역학의 대장염의 연구, 감염, 암, 비만 및 기타 질병에 적합합니다. 이 골수 이식 실험은 유전자 수준의 관심은 모두 파생 골수와 비 골수 파생 세포와 유전자 수준의 관심이 어느 인구의 세포에 의해 병을 중재 것으로 의심되는 표현 할 때 필요합니다. 예를 들어, 항균 펩타이드 cathelicidin은 급성 대장염을 조절하기 위해 표시됩니다. 그러나 그것은 상피 세포와 면역 세...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 세포 염색 버퍼 </td><td> Biolegend </td><td> # 420201 </td></tr><tr><td> 10X 적혈구 용해 버퍼 </td><td> Biolegend </td><td> # 420301 </td></tr><tr><td> FITC 마우스 isotype 제어 </td><td> Biolegend </td><td> # 400207 </td></tr><tr><td> PE 마우스 isotype 제어 </td><td> Biolegend </td><td> # 400211 </td></tr><tr><td> PE 안티 - 마우스 CD45.2 </td><td> Biolegend </td><td> # 109807 </td></tr><tr><td> FITC 안티 - 마우스 CD45.1 </td><td> Biolegend </td><td> # 110705 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 CD16/32 차단 </td><td> Biolegend </td><td> # 101301 </td></tr><tr><td> 40 μm 셀 스트레이너 </td><td> Fisherbrand </td><td> # 22363547 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><tD&gt; MP의 biomedicals </td><td> # 1860454 </td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> Fisherbrand </td><td> # BP2425 </td></tr><tr><td> Sulfatrim (SMZ) </td><td> Qualitest </td><td> NC9242720 (어부) </td></tr><tr><td> 소독약 IC </td><td> Andwin 과학 </td><td> NC9745686 (어부) </td></tr><tr><td> Vaccutainer </td><td> BD </td><td> # 8000813 </td></tr><tr><td> 마우스 restrainer </td><td> Braintree 과학 </td><td> # TV-150 </td></tr><tr><td> Irradiator </td><td> JL 목자 사 </td><td> 제가 68A 표시 </td></tr><tr><td> 흐름 cytometer </td><td> BD </td><td> BD FACSCanto II </td></tr><tr><td> 흐름 cytometer 테스트 튜브 </td><td> 매 </td><td> # 352052 </td></tr><tr><td> 디지털 캘리퍼스 </td><td> Fisherbrand </td><td> 14-648-17 </td></tr><tr><td> Hemoccult ICT </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> G0328QW </td></tR&gt; </tbody></table>

differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation

대장염의 개발에 유전자의 역할을 이해하기 위해, 우리는 야생 타입 마우스 및 대장염에 대한 유전자 수준의 관심 결함 녹아웃 마우스의 반응을 비교했다. 유전자 수준의 관심은 골수 파생 세포와 호스트의 비 골수 유래 세포 모두에 표시되어있는 경우, 그러나, 골수 유래 세포 및 비 골수의 관심 유전자의 역할을 차별화 할 수 있습니다 골수 이식 기술에 의해 파생 된 세포. 마우스의 골수 유래 세포 유전자형을 변경하려면받는 마우스의 원래 골수는 방사선에 의해 파괴하고 다른 유전자형의 새로운 기증 골수로 대체되었습니다. 야생 형 쥐 기증 골수가 녹아웃 마우스에 이식되었을 때, 우리는 골수 유래 세포의 야생 형 유전자 발현과 녹아웃 마우스를 생성 수 있습니다. 또한,시 녹아웃 마우스 기증 골수는 유전자 수준의 관심을 표현하지 않고 야생 타입받는 마우스, 야생 형 생쥐에 이식 된골수에서 파생 된 세포가 생산되었다. 그러나, 골수 이식이 100 % 완료되지 않을 수 있습니다. 따라서, 우리는받는 마우스 및 골수 이식의 성공에 기증 골수 유래 세포의 비율을 추적하기 위해 기증자와받는 사람 세포의 마커로 차별화 (CD) 분자의 클러스터를 (CD45.1 및 CD45.2) 이용. CD45.2 유전자형과 CD45.1 유전자형과 녹아웃 쥐 야생 형 생쥐가 사용되었습니다. 받는 마우스 조사 후, 다른 genotypes의 기증 골수 세포가받는 마우스에 주입했다. 새로운 골수는 면역을 물려 생성하면, 생쥐는 대장염을 유발하는 화학 물질 에이전트 (dextran 나트륨 황산, DSS 5 %)에 의해 도전되었다. 여기 우리는 또한 마우스로 대장염을 유발하고 뼈 골수 유래 세포에서 표현의 관심 유전자의 역할을 평가하는 방법을 보여 주었다. 뼈 파생 된 세포에서 유전자 수준의 관심은 질병의 발전에 중요한 역할을 (예 : 대장균과 같은 재생되면살은), 골수 이식과 함께받는 생쥐의 표현형이 크게 변경 될 수 있습니다. 대장염 실험의 끝에서, 골수 혈액과 골수의 세포 CD45.1 및 CD45.2에 대한 항체와 라벨이 붙지 만, 존재의의 양적 비율은 유동 세포 계측법에 의한 골수 이식의 성공 여부를 평가하는 데 사용할 수 파생. 성공적인 골수 이식받는 사람 마우스의 골수와 혈액 모두에서받는 사람 유전자형 이상 기증 유전자형 (CD 분자 마커의 기간에)의 대부분을 표시합니다.

유전자 수준의 관심이 대장염의 개발 기간 동안 면역 세포에서 중요한 역할을 담당하는 경우, 쥐가 골수 이식 (WT KO 또는 WT에 KO로)를 통해 서로 다른 유전자형의 골수를받는 것은 DSS 대장염에 변경된 응답이 있어야합니다. 대장염의 심각도를 결정하기위한 가장 중요한 매개 변수 중 하나는 colonic 조직의 H &amp; E 염색입니다. Colonic 조직 구조 변화와 염증의 징후는 양적 H &amp; E 조직학 점수 시스템?...

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Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

골수 이식은 골수 유래 세포의 유전자형을 변경하는 방법을 제공합니다. 관심 유전자는 골수 유래 세포 및 비 골수 유래 세포 모두에 표현되어있는 경우, 골수 이식이 아닌 골수 유래 세포 유전자형을 변경하지 않고 다른 유전자형에 골수 유래 세포를 변경할 수 있습니다.

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K 조회수.  The University of California Los Angeles, Los Angeles. 골수 이식은 골수 유래 세포의 유전자형을 변경하는 방법을 제공합니다. 관심 유전자는 골수 유래 세포 및 비 골수 유래 세포 모두에 표현되어있는 경우, 골수 이식이 아닌 골수 유래 세포 유전자형을 변경하지 않고 다른 유전자형에 골수 유래 세포를 변경할 수 있습니다.

비디오: Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

심장 기능 면역 세포의 분리

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장에서 라미나 프로프리아 단핵 세포의 분리

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to eradicate tumors. However, its application is limited by the development of graft-versus-host disease (GVHD), a major complication of BMT. GVHD is evoked when T-cells in the donor grafts recognizealloantigen expressed by recipient cells and mount unwanted immunological attacks against recipient healthy tissues. Thus, traditional therapies are designed to suppress donor T-cell alloreactivity. However, these approaches substantially impair the GVL effect so that the recipient&#39;s survival is not improved. Understanding the effects of therapeutic approaches on BMT, GVL, and GVHD, is thus essential. Due to the antigen-presenting and cytokine-secreting capacities to stimulate donor T-cells, recipient dendritic cells (DCs) play a significant role in the induction of GVHD. Therefore, targeting recipient DCs becomes a potential approach for controlling GVHD. This work provides a description of a novel BMT platform to investigate how host DCs regulate GVH and GVL responses after transplantation. Also presented is an effective BMT model to study the biology of GVHD and GVL after transplantation.

Graft-versus-host disease is a major complication after allogeneic bone marrow transplantation. Dendritic cells play a critical role in the pathogenesis of graft-versus-host disease. The current article describes a novel bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in the development of graft-versus-host disease and the graft-versus-leukemia effect.

이식대 숙주 질환에서 수지상 세포의 역할을 조사하는 골수 이식 플랫폼

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Mutations in driver genes, that confer cellular fitness, can lead to the development of expanding HSPC clones that increasingly give rise to progeny leukocytes harboring the somatic mutation. Because clonal hematopoiesis has been associated with heart disease, stroke, and mortality, the development of experimental systems that model these processes is key to understanding the mechanisms that underly this new risk factor. Bone marrow transplantation procedures involving myeloablative conditioning in mice, such as total-body irradiation (TBI), are commonly employed to study the role of immune cells in cardiovascular diseases. However, simultaneous damage to the bone marrow niche and other sites of interest, such as the heart and brain, is unavoidable with these procedures. Thus, our lab has developed two alternative methods to minimize or avoid possible side effects caused by TBI: 1) bone marrow transplantation with irradiation shielding and 2) adoptive BMT to non-conditioned mice. In shielded organs, the local environment is preserved allowing for the analysis of clonal hematopoiesis while the function of resident immune cells is unperturbed. In contrast, the adoptive BMT to non-conditioned mice has the additional advantage that both the local environments of the organs and the hematopoietic niche are preserved. Here, we compare three different hematopoietic cell reconstitution approaches and discuss their strengths and limitations for studies of clonal hematopoiesis in cardiovascular disease.

We describe three methods of bone marrow transplantation (BMT): BMT with total-body irradiation, BMT with shielded irradiation, and BMT method with no pre-conditioning (adoptive BMT) for the study of clonal hematopoiesis in mouse models.

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to proteins of interest. Identification of gene functions in cell line models is important for gene discovery and exploration of cell-intrinsic mechanisms. However, genetic manipulations of immune cells such as T cells and macrophage cell lines using CRISPR/Cas9-mediated knock-in are difficult because of the low transfection efficiency of these cells, especially in a quiescent state. To modify genes in immune cells, drug-resistance selection and viral vectors are typically used to enrich for cells expressing the CRIPSR/Cas9 system, which inevitably results in undesirable intervention of the cells. In a previous study, we designed dual fluorescent reporters coupled to CRISPR/Cas9 that were transiently expressed after electroporation. This technical solution leads to rapid gene deletion in immune cells; however, gene knock-in in immune cells such as T cells and macrophages without the use of drug-resistance selection or viral vectors is even more challenging. In this article, we show that by using cell sorting to aid selection of cells transiently expressing CRISPR/Cas9 constructs targeting the Rosa26 locus in combination with a donor plasmid, gene knock-in can be achieved in both T cells and macrophages without drug-resistance enrichment. As an example, we show how to express human ACE2, a receptor of SARS-Cov-2, which is responsible for the current Covid-19 pandemic, in RAW264.7 macrophages by performing knock-in experiments. Such gene knock-in cells can be widely used for mechanistic studies.

This protocol uses fluorescent reporters and cell sorting to simplify knock-in experiments in macrophage and T cell lines. Two plasmids are used for these simplified knock-in experiments, namely a CRISPR/Cas9- and DsRed2-expressing plasmid and a homologous recombination donor plasmid expressing EBFP2, which is permanently integrated at the Rosa26 locus in immune cells.

CRISPR/Cas9 및 대식세포 및 T 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...