저자는 인플루엔자 역방향 유전학 기술과 plasmids의 발전을위한 아돌포 가르시아 - 사스 트레와 피터 Palese 실험실에서 과거와 현재 회원을 감사드립니다. AG - S 실험실의 연구는 부분적으로 CRIP, 인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수의 NIAID 투자 센터 (HHSN266200700010C)와 NIAD 보조금 R01AI046954, U01AI070469 및 P01AI058113으로 후원됩니다. LM - S 실험실 연구는 부분적으로 NIAID 부여 RO1AI077719에 의해 후원됩니다.

1. 인플루엔자 바이러스 구조 transfection 인플루엔자 바이러스는 부정적 - 표류하는 RNA 싸여 바이러스의 Orthomyxoviridae 제품군에 속한다. 인플루엔자 바이러스 게놈은 적어도 11 바이러스성 단백질 (그림 1) 4 인코딩 부정 극성의 8 개의 RNA의 유전자로 구성되어 있습니다. 우리는 (8 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 세그먼트를 포함하는 ambisense의 plasmids (pDZ)를 사용하여 가장 일반적인 실험실 변형, 인플루엔자 A/PR/8/34 5 중 하나의 구조에서,이 보고서에서, 초점을 맞출 것이다 그림 2). 플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 구조를 위해, 우리는 각각의 재조합 바이러스 당 3 독립 transfections을 권장합니다. 하나 이상의 재조합 바이러스의 구조를 시도하는 경우, 구조를 바이러스의 수에 accordantly 다음 단계를 수행 규모. 다음 transfection 및 감염 프로토콜은 6 - 잘 접시를 위해 설정됩니다. 프로토콜의 구조 표현은 그림 3에서 그림입니다. <ol><li> OptiMEM - Lipofectamine 2000 (LPF2000) 혼합 : OptiMEM 미디어 250 μl와 LPF2000 당 transfection 6-8 μl를 준비합니다. 실온 (RT)에서 50~10분에 대한 부화. 한편, 플라스미드 transfection 혼합물을 준비합니다. </li><li> 플라스미드 transfection 혼합물 : OptiMEM 미디어 50 μl의 플라스미드 transfection 칵테일을 준비합니다. 우리는 일반적으로 구조마다 각각의 플라스미드 인플루엔자 DNA 1 μg을 사용합니다. OptiMEM 미디어 50 μl를 포함하는 튜브에 1 pDZ plasmids의 μl (1 μg / μl에서) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, 그리고 NS를 추가합니다. </li><li> OptiMEM - LPF2000 - DNA 플라스미드 혼합 : 인플루엔자 DNA 플라스미드 transfection 혼합물 (단계 1.2)로 1.1 단계에서 250 μl를 추가합니다. RT에서 20~30분이 혼합물을 품어. 한편, transfection에 대한 293T 및 MDCK 세포의 suspensions을 준비합니다. </li><li> 293T/MDCK 공동 문화의 준비 : 시작하기 전에, 37에 PBS 1X, DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 미디어, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 트립신 혼합물을 가지고 ° C. 세포의 밀도가 80-90%의 합류에 transfection의 날이 될 것입니다. 보통 293T 및 MDCK 세포 중 하나가 합류 100mm 요리 중 하나가 합류 100mm 요리는 구출 10-12 사용할 수 있습니다. 우리는 잘 당 셀 250 μl를 사용하려고합니다. 두 셀 라인 DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 3 ML의 총 resuspended 것입니다. <ul><li> 조심스럽게 15 ML의 원심 분리기 튜브의 DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 10 ML 각 세포 라인을 resuspend. 당신은 MDCK 세포에 대한 293T 세포 하나 하나의 튜브 튜브를해야합니다. </li><li> DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 3 ML에있는 293T 세포를 Resuspend하고 resuspended 때, 그 세포를 resuspend하는 MD​​CK 세포에 3 ML을 제공합니다. 이것은 귀하의 공동 문화 사용할 수 293T 및 MDCK 세포의 혼합물을 제공합니다. </li><li> 물론 당 293T/MDCK 전지 (6월 10일에서 12일까지 - 음 웰스) 250 μl를 추가합니다. </li></ul></li><li> 20-30분 RT 보육 (1.3 단계) 후 OptiMEM - LPF2000 - 독감 DNA 플라스미드 혼합하는 DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 1 ML를 추가합니다. </li><li> 293T/MDCK 세포의 250 μl (1.4 단계)와 우물에 1.3 ML (1.5 단계)을 추가합니다. </li><li> 37 부드럽게 6 잘 판을 흔들 배양기에서 (ON) 야간 transfection의 부화를하게 ° C와 5% CO 2. </li><li> 다음날, 약 16~24시간 포스트 transfection은 transfection 미디어를 변경하고 48 시간 TPCK - 트립신 1 μg / ML를 포함한 DMEM PS 0.3 % BA 1 % 안에 transfected 세포를 품어. </li><li> 미디어를 변경 48 시간 후 microcentrifuge 관에 transfected 세포의 표면에 뜨는를 전송합니다. </li><li> 1~2분, 13,000 RPM의 microcentrifuge의 조직 문화 뜨는을 원심 분리기. </li><li> 6 - 잘 접시 (전날 도금) 또는 단계를 1.10에서 centrifuged 조직 문화 supernatants 200 μl 10 일 된 닭 embryonated 달걀 신선한 MDCK 세포를 감염. 2-3 일동안은 37 세포 및 / 또는 계란 ° C를 품어. <ol><li> 10 일 된 닭 embryonated 계란의 감염 : 닭고기 embryonated 달걀을 감염 모든 절차는 무균 조건 하에서 수행됩니다. <ol><li> 공기 색과 allantoic 캐비티 사이의 인터페이스를 보시려면 빛을 candling 상자를 사용하여 10 일간 된 달걀 양초. 인터페이스 테두리에 연필 마크를 확인하십시오. </li><li> 5 ML의 주사기 바늘로 달걀 껍질에 구멍을합니다. </li><li> 1 ML의 주사기를 통해 단계를 1.10에서 조직 문화 supernatants 200 μl 각 계란을 감염. </li><li> 면봉을 사용하여 녹인 왁스와 달걀 껍질에 구멍을 커버. </li><li> 2-3 일동안은 37οC에 감염된 알을 품어. </li></ol></li><li> 신선한 MDCK 세포의 감염 : 통과 전날 사전, 공동 문화 293T/MDCK에서 조직 문화 뜨는MDCK 세포와 정지 6 - 웰 플레이트 요리 다음날 80-90%의 합류에 도달합니다. 보통 합류 100mm 조직 문화 판은 6-8 우물로 분할 수 있습니다. 세포를 씻어 두 번, PBS 1X와 trypsinize 및 6 자 번호판을 준비합니다. 부드럽게 세포의 군복을 입은 배포를하기 위해 손으로 접시를 흔들. 문화 전지, ON, 37 ° C 배양기 5 % CO 2. 감염 전에 monolayer을 확인하기 위해 현미경으로 세포를 확인, 다음, 감염 진행 : <ul><li> PBS 1X 1 ML과 함께 두 번, 세포를 씻으십시오. </li><li> RT에서 1 시간 동안 centrifuged 조직 문화 supernatants의 200 μl로 감염. 세포가 건조시키지 마십시오. 6 잘 판 매 10 분 록. </li><li> 바이러스 흡수 1 시간 후, MDCK 세포에서 감염 미디어를 제거하고 TPCK - 트립신 1 μg / ML를 포함한 DMEM PS 0.3 % BA 1 % 2 ML를 추가합니다. </li><li> 48-72시간에서 통과 후, cytopathic 효과 (CPE)는 MDCK 감염된 세포의 관찰, transfection 효율과 바이러스 부하에 따라 것입니다. CPE는 성공적인 구조를 제안합니다. 그러나, HA 분석 (제 2)은 아직도 조직 문화 supernatants에서 바이러스의 존재를 확인하기 위해 수행되어야합니다. </li></ul></li></ol></li><li> 감염된 닭고기 embryonated 계란에서 수확 allantoic 액 : 감염된 계란에서 allantoic 유체를 수확하기 위해 모든 절차는 무균 조건 하에서 수행됩니다. allantoic 유체의 약 8-12 ML 각 10 일간 된에 감염된 계란에서 수확 수 있습니다. 전에 allantoic 유체를 수확하기 위해, 4에서 2 시간 동안 닭 계란 (또는 ON) 부화 ° C는 닭 배아를 죽이고 혈액을 응고합니다. <ul><li> 멸균 조건을 확립하기 위해 70 %의 에탄올과 eggshells 씻으십시오. </li><li> 스푼으로 감청하여 공기 구멍을 통해 조심스럽게, 계란을 엽니다. 포셉의 도움으로 깨진 달걀 껍질을 제거합니다. </li><li> 1 ML의 바늘로, 계란의 노른자를 한방울 흘리지 않고 all​​antoic 멤브레인를 제거합니다. </li><li> 당신이 allantoic 유체에 10 ML의 피펫을 가이드로 주걱으로 닭 배아를 안정화. 속보 또는 달걀 노른자의의를 수집하지 않고 얼음 양동이에 얼음에 15 ML의 원심 관에 가능한 한 많은 allantoic 유체로 수집합니다. 각각의 달걀에 대한 15 ML의 원심 분리기 튜브를 사용하십시오. </li><li> 4 5 분 원심 분리기 ° C 및 신선한 15 ML의 원심 분리기 튜브에 allantoic 유체 (pelleted 적혈구를 복용하지 않고) 전송. </li><li> 4 centrifuged allantoic 유체가 들어있는 튜브를 저장 ° C들은 hemagglutination (HA) 분석과 구조 바이러스의 존재에 대한 확인까지. </li></ul></li></ol> 2. 재조합 독감 바이러스의 구조를 확인하는 HA 분석 Hemagglutination 분석 (HA)는 정기적으로 MDCK 조직 문화 supernatants 및 / 또는 수확한 계란의 allantoic 유체의 구조 바이러스의 존재를 감지하는 데 사용됩니다. 또는, immunofluorescence assays (IFA)도 수행할 수 있습니다. 분석은 구조 바이러스의 존재를 식별되면, 바이러스는 플라크가 정화 및 바이러스의 유전자 구성이 RT - PCR 및 시퀀싱에 의해 확인됩니다되어야합니다. MDCK 조직 문화 supernatants 및 / 또는 감염된 계란에서 allantoic 액체에서 바이러스의 존재는 macroscopically 닭고기의 HA (또는 다른 소스) 적혈구 (RBC)를 사용하여 결정하실 수 있습니다. 바이러스의 부재가 잘 하단에 빨간색 펠릿 (그림 4)의 형성을 허용하면서 바이러스의 존재는 RBC의 hemagglutination을 유도. 인플루엔자 바이러스의 경우, 그것은 약 10 3 -10 4 플라크 형성 단위 (PFU)이 HA 분석에 긍정적인 신호를 제공하는 데 필요한 것으로 생각되며 따라서 IFA가 확인하는 HA 분석과 병행하여 수행할 수 진정한 부정적인 결과. 이하 103-104 바이러스가이 기술을 감지할 수 있기 때문에 기본 백신 독감 항체와 IFA는 HA 분석보다 더 민감합니다. 그것은 IFA에서 긍정적인 HA - 아무것도 없습니다 supernatants 또는 allantoic 체액보다 수 있습니다. 이 경우 바이러스가 MDCK 세포 또는 달걀에서 다시 passaging으로 증폭한다. Allantoic 유체 및 / 또는 두 번째 통로에서 조직 문화 supernatants 이제 HA 분석에서 분명 긍정해야합니다. HA의 assays은 V - 바닥 96 - 웰 플레이트에서 실시하고 있습니다. 부정적인 (예를 들어, PBS 1X)와 긍정적인 (조직 문화 supernatants 및 / 또는 독감 바이러스 감염에서 allantoic 액체) 컨트롤 샘플은 항상 그것을 확인할 수있는 HA 분석에 포함되어야합니다. <ul><li> V - 하단의 각 잘 96 - 웰 플레이트에 PBS 1X의 50 μl를 분배. </li><li> 50 μl 추가감염된 최초의 잘하는 계란에서 MDCK 조직 문화 supernatants 및 / 또는 allantoic 유체는 다음과 우물 2 배 직렬 dilutions합니다. 마지막 우물에서 추가 50 μl를 폐기하십시오. </li><li> 0.5 % 각각 잘하는 -1.0 %의 닭 적혈구 (PBS 1X에서 준비) 50 μl를 추가합니다. </li><li> 얼음 V - 하단 96 자 30-45분에 대한 번호판을 (빨간색 점이 부정적인 제어 PBS 샘플의 하단에서 볼 수 있습니다까지) 알을 품다. 로 그림 4에 표시된 결과를 읽고 interpretate. </li></ul> 3. 조직 문화 supernatants의 통로 HA의 분석에 부정적인 결과는 조직 문화 supernatants 및 / 또는 allantoic 유체에서 바이러스되는 현재의 낮은 수준 낮은 transfection 효율의 결과 수 있습니다. 신선한 MDCK 및 / 또는 embryonated 계란에서 이러한 샘플 통로 감염증는 이전에 다음 섹션 1.11.2에 설명되어있는대로 수행됩니다 (그림 3에 표시된) 바이러스의 증폭을 허용합니다. 4. 대표 결과 성공적인 독감 바이러스의 구조는 긍정적인 HA 분석 (그림 4)의 존재에 의해 확인됩니다. 또한, 조직 문화 supernatants 또는 계란에서 allantoic 유체에 감염된 세포에서 CPE의 존재는 긍정적인 바이러스 구조를 제안합니다. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 인플루엔자 바이러스 구조 : 인플루엔자 바이러스는 두 가지 바이러스 glycoproteins (HA, NA)와를 포함하는 지질 이중층에 둘러싸여 또한, 이온 채널 단백질, M2. HA는 sialic에 바인딩 산성 함유 수용체를 담당하는 바이러스 첨부 단백질입니다. NA 호스트 세포에서 바이러스의 릴리스에 대한 책임이 있습니다. 지질 이중층 밑에, virion 조립 및 신진 및 바이러스 ribonucleocapsids의 원자력 수출에 필요한 핵 수출 단백질 (NEP)의 역할을 안쪽 표면 봉투 매트릭스 단백질 1, M1, 구성된 단백질 층입니다. 바이러스의 핵심은 바이러스 핵 단백질, NP하여 encapsidated 8 단일 좌초 부정적인 RNA 바이러스의 유전자로 구성된, ribonucleoprotein (RNP) 복합 구성되어 있습니다. RNP 복합과 관련된 바이러스 RNA 의존 RNA 중합 효소 subunits PA, PB1, PB2하고 있습니다. 각각 RNA 세그먼트 NS와 PB1로 인코딩되지 않은 구조 단백질 NS1과 PB1 - F2는, virion 구조의 일부가되지 않습니다. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 인플루엔자 바이러스 구조 plasmids : ambisense 플라스미드 pDZ에 복제된 8 개의 독감 바이러스 유전자가 표시됩니다. pCAGGs 7 플라스미드 단백질 표현에서 파생된 플라스미드 pDZ 6, 인간의 RNA 효소 나는 발기인과 부정적인 감각의 게놈의 RNA를 인코딩 마우스 터미네이터 순서와 양방향 플라스미드 벡터이며 반대 방향으로 난 연합 효소로 효소 II 전사 카세트 (닭고기 β - 굴지의 발기인 및 polyA)이 같은 바이러스 유전자에서 바이러스 단백질을 인코딩합니다. 각 바이러스 세그먼트의 cDNAs는 SAPI 제한 endonuclease 사이트 및 각 세그먼트 (바이러스 유전자의 끝에 블랙 박스)의 noncoding 영역을 포함하는 순방향 및 역방향 primers와 RT - PCR에 의해 생성됩니다. PCR 제품은 삽 - I와 소화 pDZ로 복제된 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 에이트 - 플라스미드 기반의 독감 구조 시스템 : 8 인플루엔자 바이러스의 유전자를 포함하는 pDZ의 plasmids가 공동 문화 (1 일) 293T - MDCK 세포에서 정지, 공동 transfected 있습니다. 스물 네 시간 FBS없이 포스트 transfection, 미디어지만 TPCK / 트립신을 포함 (제 2 일) 대체됩니다. 마흔 여덟 시간 미디어를 변경한 후, 조직 문화 뜨는은 수확과 MDCK 또는 10 일 된 embryonated 닭고기 달걀 (일 4) 감염하는 데 사용됩니다. 48-72시간 포스트 증폭, 계란에서 감염 MDCK 세포 또는 allantoic 유체의 조직 문화 supernatants는 HA (6 일)에서 수확 및 바이러스의 존재에 대한 assayed 있습니다. 어떤 바이러스가 감지되지 않으면, 같은 supernatants 및 / 또는 allantoic 유체는 신선한 MDCK 세포 및 / 또는 embryonated 계란에 다시 passaged 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 적혈구응집소 분석 (HA) : 바이러스 입자에 의해 RBC의 Hemagglutination은 macroscopically 볼 수 있으며, 조직 문화 supernatants 또는 / 및 allantoic 체액에서 바이러스 입자를 감지하는 기준이됩니다. HA 분석 바이러스는 전염성 아르 입자와 타락한과 세포를 감염시킬 수있는 더 이상의 입자 사이에 차별하지 않습니다 있지만, 분석은 샘플에서 바이러스의 존재의 좋은 지표입니다. A) 생물 학적 샘플에서 바이러스의 존재 (하단)의 부재는 (위) 접시의 바닥이나 부재, resp에서 RBC의 존재에 의해 결정됩니다ectively. B)없이 바이러스 감지 수준 (위) 또는 바이러스의 존재 (아래)과 HA 분석의 대표적인 결과가 표시됩니다.

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	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

의학의 마운트시나이 학교는 재조합 독감 바이러스의 영역에서 지적 재산권을 가지고 있으며, AG - S는 지적 재산권의 발명가이다.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 구조는 프로토콜이 정기적으로 실험실에서 수행되면 간단하고 간단하게,하지만 처음에 여러 일이 잘못 이동할 수 있습니다. 바이러스를 생성하는 좋은 플라스미드 준비를하기 위해 필수적인 그것을 것입니다. 세포 라인 (293T 및 MDCK)의 적절한 유지 관리는 성공적인 바이러스 구조를 위해 중요합니다. 전통적으로, 유전자 태그는 침묵 돌연변이 유발에 의?...

셀 라인 293T (카탈로그 번호 CRL - 11268) 및 MDCK는 (카탈로그 번호 CCL - 34) 세포 라인 DMEM 10% FBS, 1 % PS에서 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 유지됩니다. 세포는 미국 유형 문화 수집 (ATCC, 10801 유니버 시티대로, 머내서스, VA. 20110-2209 미국) 제공 형태입니다. Embryonated 닭고기 계란 Embryonated 10 일 된 닭 계란은 찰스 리버 연구소 무균 요금 조류 공급 장치 (SPAFAS) 조류 제품 및 서비스에서 얻을 수 있습니다. 프랭클린 커먼스, 106 루트 32, 노스 프랭클린, CT 06254 미국. 계란은 37 ° C 이전에서, 바이러스 감염 후 incubated 수 있습니다. 바이러스 감염 전후, 계란은 배아의 생존을 결정하는 candled 있습니다. 그것은 바이러스 감염 전후에 죽은 알을 찾기 위해 매우 중요합니다. 감염 전에 죽은 계란은 쉽게 혈관의 부재뿐만 아니라 배아 이동성의 부재에 의해 발견하실 수 있습니다. candled 때, 라이브 배아가 이동합니다. 바이러스 감염 후 죽은 계란은 (아마도 독감 바이러스 감염에 관한) 쉽게 allantoic 유체의 작고 피묻은 볼륨으로 볼 수로 계란의 나쁜 모습으로 발견됩니다. 감염 - 달걀은 두 autoclavable 봉투에 삭제 및 표준 절차에 따라 autoclaved 있습니다. 치킨 적혈구 (RBC) 치킨 RBC는 트러 슬로 팜, 201 밸리로드, 체스터, MD 21620에서 구입할 수 있습니다. 4 스토어 ° C. HA의 assays 들어, 50 ML의 원심 분리기 튜브의 PBS 1X 45 ML과 닭고기 RBC 5 ML 씻는다. 1,000 RPM으로, RT에서 5 분 원심 분리기. 신중하게 뜨는을 취소하고 PBS 1X의 pelleted RBC의 1:1000 희석 (0.5-1.0 % RBC의 최종 농도)를 사용합니다. 조직 문화 supernatants 및 allantoic 유체 , 조직 문화 supernatants 및 allantoic 체액 모두 4 ° C 짧은 기간 동안 저장할 수 있습니다. 바이러스 구조를 확인 후, 세포 supernatants 또는 allantoic 유체의 바이러스는 -80 ° C.에 저장됩니다 Plasmids 모든 plasmids은 플라스미드 맥시 키트의 다음 제조 업체의 권장 사항을 사용하여 준비가되어 있습니다. 모든 plasmids은 ddH 2 O 1 μg / ML의 농도에서 나누어지는되며 -20 ° C.에 저장된 단기 스토리지, 플라스미드는 4 유지할 수 있습니다 ° C.를 플라스미드 정화 DNA의 농도는 순도가 260:280 NM 비율을 사용하여 예상되는, 260 NM에서 분광 광도법에 의해 결정됩니다. 1.8-2.0 NM 260:280 비율로 준비가 바이러스 구조 목적 appropriated 간주됩니다. 또한 플라스미드 농도와 순도는 아가로 오스 겔 크로마 토그래피로 확인되어야합니다. Ambisense pDZ plasmids (6) 8 인플루엔자 바이러스 유전자 A/PR/8/34 (7)이있는 그림 2 그림입니다. 바이러스 독감 A/PR/8/34을 구해준 것에 대해 설명하는 프로토콜은 biosafety 수준 (BSL) 2 조건 하에서 수행할 수 있습니다. 조직 문화 supernatants 및 embryonated 계란을 포함한 오염 물질은, 폐기하기 전에 소독한다. 다른 인플루엔자 바이러스의 구조는 높은 BSL 조건 및, 따라서, 특수 조건 / 보안 측정을 소집해야합니다 필요할 수 있습니다. 조직 문화 미디어 및 솔루션 DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS : 445 ML Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM), 태아 소 혈청 (FBS) 50 ML 및 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PS) 5 ML. 4 스토어 ° C. 이 미디어는 transfections에 대한 293T 및 MDCK 세포뿐만 아니라 유지하는 데 사용됩니다. DMEM 0.3 % BA 1퍼센트 PS : DMEM의 495.7 ML, 35% 보빈 알부민 (BA) 4.3 ML. 4 스토어 ° C. 그냥 사용하기 전에, 1 μg / ML의 최종 농도 TPCK 처리 트립신을 추가합니다. 전염성 미디어. NaCl 80 G, KCl 2 G, 나 2 HPO 4 0.7 H 2 O, KH 2 2g PO 4 11.5 g : 10X 인산은 호수 (PBS)를 버퍼. 최대 1리터에 ddH 2 O를 추가합니다. 7.3으로 산도를 조정합니다. 압력솥으로 소독. 상온에서 보관하십시오. 1X PBS : ddH 2 O.로 희석 10X PBS 1시 10분 상온에서 압력솥과 저장에 의해 소독.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

독감 연구 그룹의 숫자로 노력은 인플루엔자 바이러스 역방향 유전학의 개발과 개선에 중요한되었습니다. 원래 1999 년에 설립<sup&gt; 1,2</sup특정 질문이 유전자 조작, 전염성, 재조합 독감 바이러스에 의해 답변 되었기 때문에 재조합 바이러스를 생성하는&gt; 플라스미드 기반의 리버스 유전자 기술은 인플루엔자 연구 분야를 혁명있다. 이러한 연구는 바이러스 복제, 바이러스 단백질의 기능, 바이러스 복제 및 / 또는 pathogenesis에서 바이러스 단백질의 특정 변이의 기여하고, 또한 바이러스성 벡터 외국인 단백질을 표현하는 재조합 독감 바이러스를 사용하여 포함<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

플라스미드 DNA의 인플루엔자 바이러스의 구조는 독감 연구자 인플루엔자 바이러스의 생물학의 여러 측면을 연구하는 재조합 바이러스를 생성하고, 잠재적인 벡터 또는 백신으로 사용할 수있는 기본적인 필수 실험 기법입니다.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

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Immunology and Infection

30.2K 조회수.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. 플라스미드 DNA의 인플루엔자 바이러스의 구조는 독감 연구자 인플루엔자 바이러스의 생물학의 여러 측면을 연구하는 재조합 바이러스를 생성하고, 잠재적인 벡터 또는 백신으로 사용할 수있는 기본적인 필수 실험 기법입니다.

비디오: Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

연구

면역학 및 감염병학

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

의 cDNA에서 재조합 뉴캐슬 질병 바이러스의 구조

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

인간 백신 닭 계란에 인플루엔자 바이러스 전파

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질과 마우스 MX1 단백질의 공동 면역 침전

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...