건강의 국립 연구소에서 지원하고 이너스 화상 병원 (GM092804, DE019938을 부여합니다.)

1. 미세 유체 디바이스 제조 <ol><li> 표준 포토 리소그래피 기술을 이용하여, 클래스 1000 청정실 마스터 몰드 웨이퍼를 제조. 본 제조자의 지시에 따른 이동 채널을 정의하는 제 3 μm의 얇은 에폭시 계 네거티브 포토 레지스트 층. 패턴 셀 로딩 및 케모카인 챔버를 정의하는 두 번째 50 μm의 두꺼운 층. </li><li> 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 장치를 캐스팅 패턴 웨이퍼를 사용합니다. 적극적 큰 플라스틱 무게 트레이에 플라스틱 포크를 사용하여 5 분 동안 개시 (2g)와 PDMS (19 g)을 혼합. </li><li> 조심스럽게 금형에 PDMS를 붓는다. </li><li> 1 시간 동안 진공 데시 케이 부어 PDMS와 금형을 배치하여 PDMS를 탈기. </li><li> 빵을 65 ° C로 설정 오븐에서 적어도 3 시간 동안 PDMS 마이크로 유체 장치 치료 </li><li> 1.5 mm의 선단 직경 펀칭기를 사용하여 중앙 WBLCs 펀치 아웃. </li><li> punc를 사용하여 전체 도넛 모양의 장치를 펀치5.0 mm의 팁 직경을 가진 그녀. </li><li> 접착 테이프를 사용하여 도넛 장치에서 입자를 제거합니다. </li><li> 탈 물과 질소로 다음 건조로 12 - 웰 플레이트를 씻어. 5 분 60 ° C 오븐에서 접시를 놓습니다. </li><li> 산소 플라즈마는 두 번 12 - 웰 플레이트를 치료; 한 번 단독으로 35 초 후 다시 다른 35 초 동안 도넛 장치. </li><li> 조심스럽게 핀셋을 사용하여 판의 우물에 장치를 배치합니다. </li><li> 10 분 동안 80 ° C로 설정 핫 플레이트에 결합 장치와 빵 접시. </li></ol> 2. 미세 유체 분석 준비 <ol><li> 즉, 산소 플라즈마 처리 후 프라임 미세 유동 장치 장치가 친수성 ​​모세관 효과 장치에서 작은 채널 프라이밍을 촉진 할 수있을 때. </li><li> 5 ㎕의 피브로넥틴 [원액을 1 ㎎ / ㎖] 490 ㎕의 HBSS에 5 μL fMLP [원액 10 μM]을 혼합하여 화학 유인 물질 솔루션을 만듭니다. </li><li> 천천히 피펫 &amp; #160; WBLC에 화학 유인 물질 용액, 젤 로딩 팁 (그림 1A)를 사용하여. 장치의 외부 주변 화학 유인 물질의 피펫은 추가적인 20 μL. </li><li> 15 분 동안 건조기에서 접시를 놓습니다. 장치에 진공을 적용하여, 용액 장치와 PDMS 통해 확산 된 공기의 사이드 채널로 주입된다. </li><li> 데시 케이 터에서 접시를 제거하고 현미경 장치 채널의 습윤을 확인합니다. 화학 유인 물질 용액 챔버를 입력으로 거품이 작아짐 손목 시계. 아무 거품은 진공 처리 후 장치 내에서 본 제품을 장착 할 수 없습니다. </li><li> WBLC 세척 장치의 외부에 철저를 초과하는 화학 유인 물질 솔루션을 제거 할 수 있습니다. 이 단계는 디바이스 중심 초점 화학 주성 챔버 (FCCS) 각각으로부터 화학 유인 물질의 구배를 생성한다. <ol><li> 주사기에 30 G 무딘 바늘 팁을 추가, PBS로 1 ML의 주사기를 채우십시오. 온화있는 주사기의 바늘 끝을 삽입도넛 구멍의 중심에. 조심스럽게 구멍에 PBS 100 μl를 밀어 있도록 장치의 상단에 PBS 형태의 물방울. </li><li> 장치 주변의 PBS의 경사판 피펫 1 ㎖ 액체 웰의 바닥에 수집되도록. 대기음 (분리 된 호중구가 미디어에로드 할 경우 대신 버퍼의 사용 미디어) 신선한 완충 용액을 사용하여 3 배의 총 액체 반복 과정 9. </li></ol></li><li> 장치의 정상 액체에서 침수 될 때까지 미디어와 잘 각을 입력합니다. 장치가 그라데이션이 안정 될 수 있도록 15 분 동안 앉아 보자. 실험 결과와 유한 요소 시뮬레이션 이론적 데이터는 이러한 장치의 그라데이션이 작은 분자 (예를 들면, fMLP)과 큰 분자량 (예를 들어, IL8)에 대한 몇 가지 일 최대 24 시간까지 안정되어 있음을 보여줍니다. </li><li> 젤 로딩 팁을 사용하여, 천천히 각 전혈 LOA에 2 ㎕의 혈액 (또는 고립 된 호중구를) 피펫딩 챔버 (WBLC) (그림 1A). </li></ol> 3. 샘플 준비 모세관 혈액에서 인간의 호중구 <ol><li> 아니 면역 억제제에 건강한 자원 봉사의 손가락 찌르기에서 모세관 혈액을 수집합니다. 모든 환자의 샘플을 작성 동의서를 얻을, 그리고 MGH와 라이너스 기관 검토 보드의 승인 절차를 통해되었습니다. <ol><li> 손가락 찌르기 혈액 수집을 위해, 물과 비누로 손을 씻어 피부를 건조. 혈액 수집 관 (1.65 USP/50 ㎕의 혈액을) 헤파린에 1 ㎖의 HBSS + 0.2 % HSA 10 μL 훽스트 얼룩 (32.4 μM)를 추가하여 anti-coagulant/stain 주식 솔루션을 준비합니다. 혈액의 첫 번째 드롭을 닦아 부드럽게 주식 항응고제 및 훽스트 형광 염색 용액 (10 μL) 등을 포함하는 에펜 도르프 튜브에 혈액의 50 μl를 수집, SurgiLance 안전 바소 (2.2-mm의 깊이, 22 G)를 사용하여 손가락을 찔러 혼합. </li></ol></li&gt; <li> 핵 형광 염색 수 있도록 10 분 동안 혈액과 훽스트 얼룩을 품어. 혈액 수집의 1 시간 이내에 샘플을 실행합니다. </li></ol> 정맥 혈액에서 인간의 호중구 <ol start="3"><li> 33 USP 헤파린을 포함하는 튜브에 말초 정맥 혈액 10 ㎖를 그립니다. </li><li> 전술 한 바와 같이 미디어와 헥스 얼룩에 정맥 혈액의 50 μl를 추가합니다. 핵 형광 염색 수 있도록 10 분 동안 혈액과 훽스트 얼룩을 품어. 혈액 수집의 1 시간 이내에 샘플을 실행합니다. </li></ol> 전체 혈액에서 호중구의 분리 - 긍정적 인 제어 <ol start="5"><li> , 호중구를 분리 헤 타스 타치를 사용하여 10 ㎖ 정맥 전체 혈액 샘플에서 호중구를 분리하기 위해 무균 기술을 사용하려면 (6 % W / V) 제조 업체의 프로토콜을 다음과 같은 음의 선택 자기 비드 분리 키트 다음에 밀도 구배. </li><li> concentr에서 호중구의 최종 나누어지는 재현 탁1X HBSS + 0.2 % 인간 혈청 알부민 / μL 4,000 세포의 ATION. 실험을 실행할 준비가 될 때까지 37 ° C에서 세포를 유지합니다. </li></ol> 호중구 화성 측정을위한 4. 현미경 및 이미지 분석 <ol><li> 5 %에서 37 ° C, 80 %의 습도 및 CO 2 biochamber 온도를 설정합니다. </li><li> 현미경 (10 배 이상 확대)에 시간 경과 이미징을 사용하여 즉시 이미징 시작합니다. </li></ol> 5. 통계 분석 <ol><li> 수동으로 각 샘플의 적어도 50 호중구를 추적 할 수 있습니다. </li><li> 시간이 지남에 따라 FCC들이 세포 (도 2)를 카운트. </li><li> ImageJ에 (NIH) (그림 2)를 사용하여 WBLC 및 FCC 사이의 채널에서 호중구의 속도를 계산합니다. </li><li> 분기점을 전달 세포의 수를 카운트하고 종료 번째 FCC와 세포를 향해 회전하는 셀의 수 사이의 비율을 계산하여 호중구의 방향성을 정량화전자 장치. 방향없는 세포는 화성의 기울기를 따라 때문에 FCC 및 출구 채널 (그림 2)을 향해 동일한 개수의 마이그레이션되지 않습니다. </li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+injury+reduces+neutrophil+directional+migration+speed+in+microfluidic+devices.">Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices.</a> PloS one. 5, (2010).</li><li>Lavrentieva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+markers+in+patients+with+severe+burn+injury.+What+is+the+best+indicator+of+sepsis.">Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis.</a> Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).</li><li>De Filippo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+and+macrophage+chemokines+CXCL1/CXCL2+control+the+early+stage+of+neutrophil+recruitment+during+tissue+inflammation.">Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation.</a> Blood. 121, 4930-4937 (2013).</li><li>Mankovich, A. R., Lee, C. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+neutrophil+speed+and+directionality+during+chemotaxis,+directly+from+a+droplet+of+whole+blood.">Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood.</a> Technology. , 1-9 (2013).</li><li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvin+D2+restores+neutrophil+directionality+and+improves+survival+after+burns.">Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).</li><li>Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+surgical+patients.+Relationship+to+adequate+bacterial+defenses.">Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses.</a> Arch Surg. 119, 39-43 (1984).</li><li>Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+inhibition+of+chemotaxis+in+human+plasma.">Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).</li></ol>

공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

이 작품에서 우리는 혈액의 액체 방울 (2 μL)에서 호중구의 화학 주성을 측정 할 수있는 미세 유체 플랫폼을 개발했다. 적극적으로 호중구를 마이그레이션에서 적혈구의 온 - 칩 기계적 여과는 호중구를 활성화하여 유물을 소개하는 경향이 이러한 밀도가 10 그라디언트 등의 번거로운 세포 분리 방법, 긍정적 인 선택 (11), 또는 음의 선택 (12)에 대한 필요성을 우회. 적혈구?...

<html> 호중구의 인신 매매는 죽상 경화증 1, 세균 감염이나 패혈증 2을 (를) 포함하여 많은 염증성 질환의 진행과 해상도를 결정하는 중요한 역할을하고, 부상 3을 구울 수 있습니다. 건강과 질병 상태에 대한 그들의 큰 기여를 들어, 호중구는 종종 임상과 연구 실험실에서 고려 된 표준 혈액 분석의 일부입니다. 그러나, 대부분의 유비쿼터스 테스트 중 하나, 감염과 패혈증의 진단에 호중구의 가치에도 불구하고 자주 4 의문을 제기하고있다. 예를 들어, 화상 환자의 호중구의 한 연구는 호중구 수와 호중구 마이그레이션 기능은 상관 관계가없는 것으로 나타났습니다; 그 호중구 혼자 계산 의미하는 것은 면역 상태 3의 정확한 표시되지 않습니다. 측정하기 더 어렵게되지만, 호중구 기능적 능력 조건의 넓은 범위에서보다 가치로서 제안되었다. t는 &quot;&gt; 중요한 것은, 호중구 결함의 대부분은 일시적이며 영구적 인 유전 적 결함, 대부분 최근까지 병원에서 간과 된 차이에 의해 실행되지 않습니다. 화상 부상의 맥락에서, 호중구 이주의 과정을 모니터링 할 수 염증 상태 또는 감염 3의 지표로서 환자의 치료는 혈액의 대용량을 필요로하기 때문이다. 현재 실험실 (보이 덴 챔버 던 챔버, 마이크로 피펫 분석)에 사용 된 전통적인 이동 분석법은 임상로 변환 할 수없는 번거로운 시간 소모적 호중구의 분리에 필요한 혈액의 양이 하나의 샘플 수 및 종종 심지어 풀링 필요하기 때문에 호중구의 분리 기법 (표 1). 이러한 분석법은 또한, 예컨대 생쥐 같은 작은 실험실 동물의 호중구 화학 주성에서 일시적인 변화를 모니터링하기 위해 사용될 수 없다 하나의 분석에 대해 여러 동물의 피. 예를 들어, 관련된 연구는 M여러 시간 지점에 ultiple 조건과 치료는 잠재적으로 현재 화성 분석을 사용하여 마우스의 수천을 필요로 할 수 있습니다. 이 부상, 감염의 맥락에서 면역 기능의 복잡한 역학을 이해하거나 자주 쥐 모델 5에서 공부를 레코딩 할 수있는 기본적인 생물학 연구를 제한합니다. 최소한의 혈액량을 요구하면서, 급속한 견고 호중구 기능적 분석을위한 필요성을 해결하기 위해, 우리는 전체 혈액의 작은 방울로부터 직접 호중구 주 화성을 측정 미세 유동 장치를 개발했다. 그것은 혈청 6 혈소판 7을 포함하여 전체 혈액에있는 많은 요인이, 호중구의 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 그것은 전혈 미세 분석은 시험 관내 분석으로 8 주 화성의 변동을 측정 할 때 호중구의 생체 내 미세 환경을 유지하는 시료 처리를 최소화하는 것이되므로 유리하다. 이 방법혈액 컬렉션에서 기존의 기술을 사용하여 시간에서 호중구 마이그레이션 분석에 시간이 줄어 듭니다 단지 분 (표 1)에. 전체 혈액의 미세 유체 플랫폼은 실험의 길이 안정적인 선형 화학 유인 물질 구배를 생성 움직이는 부분이 없으며, 외부 압력 소스 (즉, 주사기 펌프)를 필요로하지 않습니다. 전혈 마이크로 유체 장치의 디자인에서 중요한 특징은 기계적 장치의 이주 채널 입력에서 적혈구를 필터링 적혈구 (RBC) 여과 빗의 혼입이다. 이 여과 빗 우회전 가능성 적혈구 의해 막히는 것 크기 배제 여과의 필요성을 방지하고, 따라서 WB에서 적극적 마이그레이션 호중구 도달 화학 유인 물질 그라데이션 블록. 12 또는 24 - 웰 플레이트의 전체 혈액의 미세 유체 장치의 결합은 인간이나 쥐의 호중구의 화학 주성시의 여러 매개 물질의 검사를 용이하게로 섞고.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:179px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:191px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Device Fabrication</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">SU8&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Microchem</td>
			<td style="width:179px;">Y131273</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:191px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:179px;">Sylgard 184 1.1 lb. Kit</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Standard glass slides</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">125495</td>
			<td style="width:191px;">1 X 3 inches</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Glass-bottom plate</td>
			<td style="width:191px;">MatTek</td>
			<td style="width:179px;">P12G-1.5-14-F</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm</td>
			<td style="width:191px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:179px;">15081</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm</td>
			<td style="width:191px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:179px;">15072</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Microfluidic Assay Preparation and Analysis</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Gel-loading pipet tip</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">02-707-139</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Syringe</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientfic</td>
			<td style="width:179px;">309602</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Blunt tip needle, 30g &#189; in.</td>
			<td style="width:191px;">Brico Medical Supply</td>
			<td style="width:179px;">BN3005</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Vacutainer, Heparin</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Human serum albumin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">A5843-5G</td>
			<td style="width:191px;">0.2% final concentration in HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">F0895-1MG</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">fMLP</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">F3506-10MG</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;">SLN240</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Hoescht stain</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:179px;">H3570</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Positive Control&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">HetaSep</td>
			<td style="width:191px;">STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td style="width:179px;">7906</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit</td>
			<td style="width:191px;">STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td style="width:179px;">19257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Equipment</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Plasma Asher</td>
			<td style="width:191px;">March Instruments</td>
			<td style="width:179px;">P-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Lindberg/Blue M Oven</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:179px;">13-258-30C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Stainless Steel Precision Tweezers</td>
			<td style="width:191px;">Techni Tool</td>
			<td style="width:179px;">758TW458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">08-594-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Dataplate Digital Hot Plate</td>
			<td style="width:191px;">Alpha Multiservices</td>
			<td style="width:179px;">PMC 720&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Nikon TiE inverted microscope</td>
			<td style="width:191px;">Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective</td>
			<td style="width:191px;">Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">MRH20101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon</td>
			<td style="width:191px;">Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">500-L200NI2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:211px;">DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters - 25mm Emitters</td>
			<td style="width:191px;">Chroma - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">31013v2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600x1200 pixels</td>
			<td style="width:191px;">Qimaging - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td>RET-2000R-F-M-12-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed whole blood

호중구가 혈액 감염과 그들의 숫자에 대한 보호에 필수적인 역할을 자주 병원에서 측정됩니다. 낮은 호중구 카운트 감염에 대한 높은 위험에 대한 경고 표시하는 동안 혈액에있는 높은 호중구의 수는 일반적으로 지속적인 감염의 지표입니다. 자신의 기능을 수행하기 위해, 호중구는 감염이 발생 조직으로, 그들의 생활의 대부분을 보내는 혈액에서 효율적으로 움직일 수있다. 따라서, 마이그레이션하는 호중구의 기능에 결함이 호중구가 혈액에 해당 번호에 존재하는 경우에도, 감염에 대한 위험을 증가시킬 수있다. 그러나, 병원에서 호중구의 이동 능력을 측정하는 것은, 시간이 소요되는 어려운 작업이며 많은 혈액의 양 및 전문 지식이 필요합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 circum, 처리되지 않은 혈액 한 방울을 요구하는 호중구의 이동에 대한 강력한 마이크로 유체 분석 설계호중구의 분리의 필요성을 통풍구 및 간단한 현미경 정량화하기 쉽다. 이 분석에서, 호중구 화학 주성의 소스를 향해 작은 경로를 통하여 혈액 방울에서 직접 이동한다. 같은 채널을 통해 적혈구의 세부적인 흐름을 방지하기 위해, 우리는 선택적으로 적혈구의 진행을 차단하는 것이집니다 직각으로 기계적인 필터를 구현했습니다. 우리는 손가락 찌르기와 정맥 혈액에서 수집 된 혈액 방울에서 호중구의 이동을 비교하여 분석을 확인. 우리는 또한 정제 된 호중구의 샘플에서 호중구의 마이그레이션이 전혈 (WB) 소스를 비교 세 가지 소스에 일관된 속도와 방향성을 발견했다. 이 미세 유체 플랫폼은 건강과 질병에서 호중구의 기능에 대한 우리의 이해를 발전에 도움이되는 병원과 연구 환경에서 인간의 호중구 이주의 연구를 가능하게 할 것이다.

전혈 (WB) 호중구 주 화성 분석은 fMLP 구배 (동영상 S1)쪽으로 호중구의 축적을 측정함으로써 입증 하였다. 결과는 호중구 (파란색)이 적극적으로 전혈 (그림 3a 및 영화 S1) 중 마이그레이션 할 수있는 동안 적혈구가 여과 빗에 의해 갇혀 있는지 확인합니다. 전혈 미세 유동 장치에 의해 형성된 안정 화학 유인 물질 선형 구배 (그린)를 FITC-표지 된 덱스 트란 <strong...

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Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

이 프로토콜은 강력한 재현성 전체 혈액 한 방울에서 인간 호중구의 화학 주성을 측정하기위한 분석을 자세히 설명합니다. 이 접근법은 호중구의 분리의 필요성을 우회하고 분석 준비 시간의 몇 분을 필요로한다. 마이크로 유체 칩은 유아 또는 샘플의 양이 제한되어 작은 포유 동물에 시간이 지남에 따라 호중구의 화학 주성의 반복 측정을 가능하게합니다.

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

microfluidic-platform-for-measuring-neutrophil-chemotaxis-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K 조회수.  Massachusetts General Hospital.  이 프로토콜은 강력한 재현성 전체 혈액 한 방울에서 인간 호중구의 화학 주성을 측정하기위한 분석을 자세히 설명합니다. 이 접근법은 호중구의 분리의 필요성을 우회하고 분석 준비 시간의 몇 분을 필요로한다. 마이크로 유체 칩은 유아 또는 샘플의 양이 제한되어 작은 포유 동물에 시간이 지남에 따라 호중구의 화학 주성의 반복 측정을 가능하게합니다. 

비디오: Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

연구

생체공학

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

멀티 장기 칩 - 장기 멀티 조직 공 배양을위한 미세 유체 플랫폼

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white blood cells and platelets that are suspended in blood plasma. Due to the abundance of the RBCs (40% to 45% of the blood volume), their behavior dictates the rheological behavior of blood especially in the microcirculation. At very low shear rates, RBCs are seen to assemble and form entities called aggregates, which causes the non-Newtonian behavior of blood. It is important to understand the conditions of the aggregates formation to comprehend the blood rheology in microcirculation. The protocol described here details the experimental procedure to determine quantitatively the RBC aggregates in microcirculation under constant shear rate, based on image processing. For this purpose, RBC-suspensions are tested and analyzed in 120 x 60 &#181;m poly-dimethyl-siloxane (PDMS) microchannels. The RBC-suspensions are entrained using a second fluid in order to obtain a linear velocity profile within the blood layer and thus achieve a wide range of constant shear rates. The shear rate is determined using a micro Particle Image Velocimetry (&#181;PIV) system, while RBC aggregates are visualized using a high speed camera. The videos captured of the RBC aggregates are analyzed using image processing techniques in order to determine the aggregate sizes based on the images intensities.

The protocol described details an experimental procedure to quantify Red Blood Cell (RBC) aggregates under a controlled and constant shear rate, based on image processing techniques. The goal of this protocol is to relate RBC aggregate sizes to the corresponding shear rate in a controlled microfluidic environment.

적혈구 집계 동적 조사를위한 미세 유체 제어 환경

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

전혈에서 고감도 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

입자의 공간 추적을위한 멀티 플렉스 전자 감지와 미세 유체 플랫폼

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

2 층 미세 플랫폼에서 애기 모종의 루트 머리 형태를 이미징

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...