우리는이 프로토콜을 개발하는 동안 그녀의 입력을위한 박사 막달레나 Götz가에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 관대 SOX2의 코딩 서열을 저희에게 제공하는 박사의 Marius Wernig (스탠포드 대학) 감사합니다. 우리는 또한 바이러스 생산을위한 박사 알렉산드라 Lepier에 매우 감사하고 있습니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (4182/2-2 BE)와 BMBF (01GN1009A) BB, 그리고 과학의 바이에른 주 정부, 연구 및 MK와 BBCS에 예술이 양국 SYSTHER-로부터받은 자금의 보조금에 의해 지원되었다 INREMOS 가상 연구소 (교육과 연구의 독일과 슬로베니아어 연방 부처) 및 DFG (SFB 824).

1. 분리 및 성인의 뇌 세포의 배양 인체 조직과 관련된 실험은 연구 목적으로 인간 재료의 사용에 관한 모든 관련 정부 기관 및 규정에 따라 수행되어야한다. 본 프로토콜은 LMU 뮌헨의 의료 학부의 윤리위원회와 모든 환자의 서면 동의서의 승인에 따라 개발되었다. 성인의 대뇌 피질의 준비 문화의이 프로토콜은 측두엽 간질 또는 기타 뿌리 깊은 비 외상성, 비 악성 병변으로 고통받는 남녀 환자의 검체를 사용하여 설립되었습니다. 따라서 뇌 병변 액세스 채널에서만 이루어지는 수술 방으로부터 얻은 조직은 건강한 여겨진다. 환자의 연령 범위는 19-70년했다. <ol><li> 열 - 불 활성화 소 태아 혈청을 첨가하여 성장 배지를 준비루타 가진 DMEM 고 글루코스 행 (FCS) 20 % FCS의 최종 농도를 얻었다. 500 ㎖의 성장 매체의 총 5 ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다. 이것과 적절한 층류 후드에서 무균 배양 조건을 요구하는 모든 후속 단계를 수행한다. </li><li> 염화칼슘 처리 될 때까지 얼음에 HEPES (10 mM의 최종 농도) 등의 MgCl2를 (HBSS) 매체와 행크스 &#39;균형 염 용액의 수술 방에서 얻은 성인의 뇌 생검을 유지합니다. 가능한 한 빨리 처리를 시작합니다. </li><li> 65mm 페트리 접시에 조직을 전송하고 두 멸균 일회용 메스를 사용하여 작은 조각으로 말하다, 단일 세포로 분리를 시작합니다. 소화 효소를 들어 15 ML 원뿔 튜브에 3-6 ML TrypLE를 사용하고 물을 욕조에 37 ° C에서 15 ~ 30 분 동안 품어. </li><li> 해리를 촉진하는 예비 가온 성장 배지의 1 부피를 추가하고 온화 우선하여 상하 조직 조각을 함유하는 용액을 씹다세포 현탁액을 균질화 될 때까지 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 다음 5 ㎖ 일회용 피펫. 일반적으로, 대부분 흰색 물질로 구성된 일부 잔여 조직의 조각, 서스펜션에 남아 있습니다. </li><li> 5 분 157 XG에 스핀 다운 및 성장 매체의 적절한 양 (코팅 T75 문화 플라스크 당 10 ml)에 펠렛을 재현 탁. 크기 5 ~ 10 mm 직경의 조직 검사에 대해 하나의 T75 문화 플라스크를 사용하여 더 큰 표본의 경우이에서 추정. </li><li> 5 % CO 2 5 % O 2와 37 ° C 배양기에 세포를 놓습니다. </li><li> 세포가 포화 상태에 도달 할 때까지 모든 3-4일 매체의 절반을 교체합니다. 이것은 일반적으로 (통로 0 [P0]라고 함) 최대 2 주가 소요됩니다. </li></ol> 성인의 뇌 세포의 2. 체외 확장 및 특성 <ol><li> 체외 확장의 : <ol><li> 문화 매체를 기음과 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 세척, 방 t에서 유지온도계 수, 3 ㎖의 TrypLE를 추가하기 전에. </li><li> 세포의 대부분이 분리 될 때까지 5 ~ 10 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 부드럽게 세포의 리프팅을 용이하게하기 위해 플라스크를 살짝; 성장 배지 중에서 볼륨을 첨가 한 다음, 15 ㎖의 원뿔형 튜브에 세포를 전송하고 5 분 동안 157 XG에 스핀 다운 및 성장 배지의 적절한 양으로 세포를 재현 탁. </li><li> 통로 새로운 T75 세포 배양 플라스크에 최적 수율 1:3 세포. 참고 :이 감소 프로그래밍 효율의 흔적없이 P5 때까지이 세포를 계대 배양했다. 문화가 내피 세포의 상당한 부분을 (CD34 발현에 의해 평가)가 포함 P0에있는 동안, 다음 구절에 자신의 번호가 무시됩니다. </li></ol></li><li> 성인의 뇌 문화의 특성 : <ol><li> 면역 세포 화학 : <ol><li> 폴리 - D - 라이신 코팅 커버 유리 위에 세포, 씨 ~ 60,000 세포의 특성을 500 ㎕의 신선한 성장 mediu에 미끄러 져24 잘 조직 배양 접시에있는 m와 5 % CO 2 5 % O 2와 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 배양 된 인간의 뇌 세포의 면역 세포 화학 분석 배지를 제거하고 PBS 1 ㎖로 3 회 세척 하였다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 PBS 중 4 % 파라 포름 알데히드 500 ㎕를 첨가하여 세포를 고정한다. </li><li> 커버 유리가 적절한 가습 염색 챔버에 미끄러 져 이동하고 80 ㎕의 PBS 실온에서 1 시간 동안 3 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.5 % 트리톤 X-100을 함유하는 블록. </li><li> 동일한 솔루션에 희석 차 항체 (희석 요인이 특정 시약 및 장비의 표를 참조하십시오) 추가하고 실온에서 4 ° C에서 또는 1 시간에서 밤새 품어. 주 : 배양이 단계에서 세포의 상당하지만, 다른 부분은 (PDGFRβ) 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β에 대한 면역 반응하고, 차별화 146 (CD146), NG2 콘드로이틴 황산 proteo의 클러스터글리 칸, 평활근 액틴 (SMA), 미세 혈관 관련 혈관 주위 세포의 특성 즉, 마커. 단지 소수 (&lt;1 %)이 astroglial 마커 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)과 S100β을 표현한다. 또한,이 단계에서의 문화는 신경 세포 마커 βIII-튜 불린을 표현하는 세포의 결여해야한다. 다른 마커의 공동 표시에 대해 여러 차 항체의 조합을 사용합니다. 아교 세포, 신경 세포, 내피 세포 및 혈관 주위 세포 마커의 발현의 추가의 확인은 역전사 (이 프로토콜에서 설명하지 않음) 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응에 의해 얻을 수있다. </li><li> 함께 배양 한 다음 차 항체는 1 ml의 PBS로 3 회 세척하고 염색 용액에 (적절한 희석에) 해당 보조 항체를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 1 시간을 품어. 세포를 PBS로 3 배 씻으십시오. 필요한 경우, 이전 설치에 방에서 5 분 DAPI로 염색을 포함온도. </li><li> 설치 매체를 antifading 사용하여 표면 형광 현미경이나 공 초점 현미경을 사용하여 커버 전표를 분석합니다. </li></ol></li><li> 유동 세포 계측법 : <ol><li> 유동 세포 계측법을 사용하여 표면 마커의 발현 분석을 위해, 코팅 T25이나 T75 세포 배양 플라스크에 포화 상태로 세포를 성장. </li><li> PBS + 0.5 % BSA로 구성된 염색 용액에 전후에 resuspend 바와 같이 TrypLE를 사용하여 세포를 분리. 염색 반응에 대해, 염색 용액 100 μL에 100,000-200,000 세포를 재현 탁. (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, 각각의 이소 제어 항체)를 사용 항체 당 하나의 염색 반응을 준비합니다. </li><li> 직접 세포 현탁액에 (희석 특정 시약 및 장비의 표를 참조하십시오) 각 염색 용액에 형광 색소 - 복합 항체를 추가하고 어둠 속에서 30 분 동안 4 ° C에서 알을 품다. </li><li> 500 ㎕의 PBS로 세포를 세 번 세척하고 각각의 사이에 스핀 다운5 분 157 XG에 세척 단계. </li><li> FACS 튜브에 세포 고사 (70 μM)를 통해 0.5 ml의 염색 액에 전사 세포에서 세포 펠렛을 재현 탁. 빛에 노출 샘플을 보호합니다. </li><li> 이전 FACS 악기에 배치에 소용돌이 샘플. </li><li> 살아있는 세포를 분석하고 파편과 세포 집합체, FSC-A에 대한 게이트와 SSC-A를 제외합니다. 휴대 duplets은 특히 FSC-A와 FSC-W에 의해 문이 있습니다. 각각의 형광 색소에 접합 이소 일치 항체 제어 게이트를 설정 세포 표면 마커에 대한 올바른 게이트 조건을 결정합니다. 그런 항체 바인딩 세포의 비율을 결정합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 정렬 형광 활성화 된 세포에 의한 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포 3. 심화 <ol><li> FACS는 70 μm의 노즐을 사용하여 선별을 통해 이전에 형질 도입 (성장 배지에 재현 탁) 주연 세포 세포 집단을 정제. C와 함께 CD34-APC를 사용D140b-PE와 CD146-FITC는 혈관 주위 세포에 선택합니다. CD34 음성, CD140b-, 및 CD146-양성 세포에 대한 정렬. </li><li> 24 잘 조직 배양 플레이트에서 미끄러 져 폴리 - D - 라이신 코팅 유리 덮개에 성장 매체와 플레이트에 정렬 된 세포를 수집하고 5 % CO 2 5 % O 2와 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 정렬 후 48 시간 신선한 성장 매체와 매체를 교체하고 프로토콜 4에 설명 된대로 전달을 수행합니다. </li></ol> 4. 레트로 바이러스 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 형질 도입 및 유도 신경 세포로 재 프로그램 참고 : 레트로 바이러스 입자를 처리하는 지역 바이오 안전성 지침을 참조하십시오. 독일에서는 여기에 사용되는 레트로 바이러스의 사용은 바이오 안전성 레벨 2가 필요합니다. 레트로 바이러스 입자의 생산이 프로토콜 6을 참조하십시오. 프로그래밍에 사용되는 레트로 바이러스 구조의 경우, Karow 등을 참조하십시오. (2012). 레트로 바이러스는 VSV-G (수 포성 구내염 바이러스-글리코와 pseudotyped했다단백질) 5. 생산 Gavrilescu 외 여러분 6을 참조하십시오. <ol><li> 이전의 폴리 - D - 라이신 코팅 커버 유리 위에 레트로 바이러스 전달 씨 ~ 60,000 세포에 24 시간은 24 잘 조직 배양 플레이트에 500 ㎕의 신선한 성장 매체에 미끄러 져와 5 % CO 2 5 % O 2와 37 ° C에서 알을 품다 . </li><li> 다음날, 500 ㎕의 신선한, 데워진 성장 매체로 성장 매체를 교체하고 레트로 바이러스 입자 (제어 pCAG-IRES-DsRed를, 특히 실험실에서 프로토콜을 설정하는 동안), pCAG-ascl1을 포함하는 각각의 집중 상층 액 1 μl를 추가 pCAG-SOX2-IRES-GFP-IRES-DsRed를. </li><li> 어느 날 후, 세포에서 바이러스 입자를 포함하는 매체를 제거하고 신선한 1 ㎖를 추가, 루타 49 ML DMEM 높은 포도당과 1 ㎖의 B27의 혈청 보충으로 구성, B27-분화 매체를 데워진. 5에서 37 ° C에서 문화의 세포를 유지% CO 2와 기능이 성숙 반복 매체의 변화는 유해 해짐에 따라 매체를 변경하지 않고 4-8주 5 %의 O 2. </li></ol> 면역 세포에 의해 유도 된 신경 세포의 5. 특성 <ol><li> 형질 세포의 세포 신원을 확인하기 위해 신경 세포의 표현형의 인수를 입증 할 특히, 특정 시약의 표를 참조 항체와 각각의 희석을 위해 (예 : 빌 - 튜 불린, MAP2 및 노이 앤 등의 신경 항원에 대한 면역 세포 화학을 수행하고 장비, 2.2.1에 표시된대로) 절차를 따릅니다. </li><li> E14 마우스 대뇌 피질에서 파생 된 신경 세포와 PdiNs, 공동 문화 이들 세포의 성숙을 개선하십시오. 이를 위해, 대뇌 피질을 해부 화재 광택 유리 파스퇴르 피펫으로 기계적으로 조직을 떼어 놓다. SOX2 및 ascl1 인코딩 다시 함께 전달 다음 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포 2~3주의 문화에 10,000-50,000 쥐의 뉴런을 추가troviruses 및 배양을 계속합니다. 형질 세포는 살아있는 표면 형광 또는 GFP와 DsRed를 위해 면역 세포를 다음 중 하나를 자신의 기자 (GFP와 DsRed를) 식으로 쥐의 뉴런과 구별 할 수 있습니다. </li><li> , 쥐의 뉴런에 의해 PdiNs에 시냅스의 형성을 평가하는 등의 기공을 갖는 글루타민산 염 트랜스 포터 1 (vGluT1) 등의 기공을 갖는 신경 전달 물질 수용체에 대한 면역 형광 염색법을 수행 할 수 있습니다. </li><li> 자신의 전기적 특성 (활동 전위를 생성 즉, 능력) 및 패치 - 클램프 전기 생리학 기능적인 시냅스의 설립을위한 형질 세포를 조사. 절차에 대한 자세한 내용은을 참조하십시오 하인리히 등. (2011).에게 </li></ol>

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본 프로토콜은 체외 확장과 농축 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 성인 인간의 대뇌 피질에서 분리 다음과 신경성 전사의 레트로 바이러스 매개로 표현하여 기능에 후속 변환 SOX2 및 Ascl1 요인에 대해 설명합니다. 이러한 프로토콜은 궁극적으로 성인 뇌의 생체 설정으로이 직접 변환 방식을 번역하는 마음에서 목표로, 잠재적으로 glia의 신경에 두뇌 상주 세포의 혈통 변환 등을 연...

다시 분화 가능성의 과다 부여하는 유도 만능 줄기 세포로 체세포 (유도 만능), 프로그래밍과 달리, 직접 프로그래밍은 다른에 하나의 특정 세포 유형의 연속 변환을 위해 목표로하고있다. 질병 모델링 및 잠재적 인 세포 기반 치료의 맥락에서 자신의 응용 프로그램에 대해, 모두 프로그래밍 방식은 특정 장점과 단점이 있습니다. 유도 만능 (I)에 프로그램을 다시 만들 것은 세포의 거의 무한한 소스를 제공한다; (II) 유전 공학을 허용한다; (III) 거의 무제한의 분화 가능성에 부여한다. 이러한 세포는 세포 기반 치료에 사용되어야하는 경우에는 유도 만능의 주요 단점은 미분화 세포 (생체 내에서 기형 종 형성)의 발암 및 생체 외 배양과 후속 이식을위한 필요성의 위험을 수반한다. 반대로, 직접 혈통 프로그래밍은 원하는 세포의 낮은 수율에 의해 제한됩니다출발 인구의 표적 세포의 수와 직접 관련이 있지만, 계통 - 리 프로그래밍 세포 이식 1,2에 제공된 발암 위험을 나타내지하지 나타나는 장점을 보유하는; 또한, 직접 프로그래밍도, 즉 이들 세포는 따라서 이식 필요성을 피하고, 필요한 것 장기 내에, 동일계에서 달성 될 수있다. 이 염두에두고, 우리의 실험실은 신경 퇴행성 질환의 세포 기반 치료법​​을 향한 새로운 접근 방식으로 기능에 혈통 재 프로그래밍 뇌 상주 세포의 가능성을 추구하고있다. 잠재적 혈통 프로그래밍 셀룰러 대상으로 고려 될 수있다 뇌 상주 세포는 다른 macroglia의 유형 (성상 세포, NG2 세포 및 희소 돌기 아교 세포), 미세 아교 세포 및 미세 혈관 관련 세포 (내피 세포와 혈관 주위 세포)를 포함한다. 우리는 광범위하게 대뇌 고전의 아스트로의 체외 프로그램을 다시 만들 가능성을 연구 한출생 초기 마우스 3-5 텍스. 성인의 뇌에 직접 혈통 프로그래밍에 대한 유사 적합한 세포 소스의 검색, 우리는 성공적으로 기능과 혈관 주위 세포의 전시 품질 증명으로 다시 프로그램 할 수있는 세포 인구가 발생했습니다. 여기에서 우리는 확장하고 체외에서이 세포를 풍부하게, 그리고 마지막으로 성공적으로 (25 ~ 30 % 범위)이 체외 확장 된 세포의 상당 부분을 재 프로그램하는, 성인의 뇌 조직 검사에서 이러한 세포를 수확하는 방법에 대한 프로토콜을 설명 기능. 리 프로그래밍은 두 개의 전사 인자, SOX2 및 ascl1 동시에 레트로 바이러스 - 매개의 공동 발현에 의해 달성 될 수있다. 이러한 PdiNs는 반복적 활동 전위 소성 능력을 취득하고 신경망으로 통합 그들의 능력을 나타내는 다른 뉴런뿐만 시냅스 대상 서브 밝혀졌다. 우리의 프로토콜은 기능에 성인의 뇌 혈관 주위 세포의 분리 및 혈통 전환을위한 간단한 절차를 제공합니다. </P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">anti-CD140b-PE</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">558821</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-CD146-FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">MCA2141FT</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-CD13-FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">MVA1270A488T</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">anti-CD34-APC</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">560940</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:80px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:80px;">3169S</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-CD146</td>
			<td style="width:80px;">Abcam</td>
			<td style="width:80px;">Ab75769</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-NG2</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">AB5320</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-SMA</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A2547</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">T8660</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-MAP2</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">M4403</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-GFAP</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">G3893</td>
			<td style="width:80px;">use 1:600</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-GFP</td>
			<td style="width:80px;">Aves Labs</td>
			<td style="width:80px;">GFP 10-20</td>
			<td style="width:80px;">use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-RFP</td>
			<td style="width:80px;">Chromotek</td>
			<td style="width:80px;">5F8</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-S100&#946;</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">S2532</td>
			<td style="width:80px;">use 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-NeuN</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">MAB377</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-GABA</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A2052</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-Calretinin</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">AB5054</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-vGluT1</td>
			<td style="width:80px;">SYnaptic SYstems</td>
			<td style="width:80px;">135511</td>
			<td style="width:80px;">use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">11-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control PE</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">12-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control APC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">17-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">TrypLE</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">12605-010</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">61965</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">B27 serum-free supplement</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">17504044</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">10106-169</td>
			<td style="width:80px;">perform heat inactivation by incubation at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">15140122</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:80px;">HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">24020-091</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="198">
			<td height="198" style="height:198px;width:80px;">Dulbecco&#39;s PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1&#215;; Invitrogen, cat. no. 14190)</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">14190</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">H3375</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">P0899</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">P1648</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A9418</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">T9284</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:80px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">042M4005</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Aqua-Poly/Mount</td>
			<td style="width:80px;">Polysciences</td>
			<td style="width:80px;">18606-20</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Polypropylene round-bottom tubes&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352063</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352235</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">24-well plates</td>
			<td style="width:80px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:80px;">5530305</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:80px;">75 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">658175</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:80px;">25 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">690175</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Disposable pipettes 10 ml</td>
			<td style="width:80px;">Sarstedt</td>
			<td align="center" style="width:80px;">#########</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Glass Pasteur pipettes (150 mm)</td>
			<td style="width:80px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:80px;">FB50251</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Glass coverslips 12 mm diameter</td>
			<td style="width:80px;">Menzel</td>
			<td style="width:80px;">CB00120RA1</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Surgical disposable scalpels&#160;</td>
			<td style="width:80px;">B. Braun</td>
			<td style="width:80px;">5518083</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Tissue culture dishes&#160;</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">633180</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Conical tubes 15ml</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352095</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:80px;">Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes</td>
			<td style="width:80px;">Hettich Lab Technology</td>
			<td style="width:80px;">1406</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Humified cell culture incubator</td>
			<td style="width:80px;">Eppendorf Galaxy 170R</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Wather bath at 37 &#176;C</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">FACSFlow sheath fluid&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">342003</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Epifluorescence microscope BX61</td>
			<td style="width:80px;">Olympus</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Confocal microscope LSM710</td>
			<td style="width:80px;">Zeiss</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage-reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neurons

유도 된 신경 세포 (INS)에 비 신경 세포의 직접 혈통 프로그래밍은 신경의 근간이되는 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 체외 모델링하거나 병에 걸린 뇌를 복구하기위한 새로운 전략을 가능하게 할 수있다. INS로 직접 변환 의무 식별 뇌 상주 비 신경 세포 유형은 손상된 뇌 조직 내에서, 즉, 현장에서 이러한 접근 방식을 실행을 허용 할 수 있습니다. 여기에서 우리는이 전제를 충족 성인의 뇌에서 파생 된 세포를 식별하는 시도에서 개발 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 수반 : 성인 인간의 뇌 생검 의한 대뇌 피질에서 인간 세포의 (1)를 배양; (2) 시험 관내 (약 2-4주 필요) 확장 및 면역 세포에 의해 문화의 특성 및 유동 세포 계측법; (3) 항 PDGF 수용체 β 및 안티 CD146 항체를 사용하여 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 농축;(4) 신경성 전사와 레트로 바이러스 매개 전달은 SOX2 및 ascl1 요인; (5) 마지막으로 면역 세포에 의해 생성 된 혈관 주위 세포 유래 유도 된 신경 세포 (PdiNs)의 특성 (8 주 14 일 레트로 바이러스 형질 도입에 따라). 이 단계에서, 인은 패치 클램프 녹음하여 전기적 특성에 대해 탐색 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 기능적인 인간의 기능에 뇌 상주 혈관 주위 세포의 체외 혈통 전환에 대한 높은 재현성 절차를 제공합니다.

이 프로토콜은 후 성공적으로 성인의 대뇌 피질의 표본에서 문화를 확립의 첫 번째 결과는 문화의 세포 성분의 식별로 구성되어 있습니다. 세포 유형의 특정 단백질에 대한 면역 세포 화학은 다른 환자 (그림 1A)의 표본에서 파생 된 문화 간의 이질성의 상당한 정도를 알 수있다. 흐름에 의해 정량화으로 세포 계측법 (평균 ~ 75 % 할인, 30에서 최대 99 %까지) PDGFRβ을 발현하는 세포의 상?...

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Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

직접 혈통 프로그래밍에 대한 뇌 상주 세포를 표적으로하는 것은 뇌 수리에 대한 새로운 관점을 제공합니다. 여기서 우리는 성인의 대뇌 피질에서 뇌에 상주하는 혈관 주위 세포에 풍부한 문화를 준비하고 SOX2 및 Ascl1 요인 전사의 레트로 바이러스 매개 식에 의해 유도 된 신경 세포로 이러한 변환하는 방법의 프로토콜을 설명합니다.

유도 된 신경 세포로 성숙한 인간 두뇌의 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 리니지 - 프로그래밍

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

lineage-reprogramming-pericyte-derived-cells-adult-human-brain-into

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K 조회수.  Ludwig Maximilians University Munich.  직접 혈통 프로그래밍에 대한 뇌 상주 세포를 표적으로하는 것은 뇌 수리에 대한 새로운 관점을 제공합니다. 여기서 우리는 성인의 대뇌 피질에서 뇌에 상주하는 혈관 주위 세포에 풍부한 문화를 준비하고 SOX2 및 Ascl1 요인 전사의 레트로 바이러스 매개 식에 의해 유도 된 신경 세포로 이러한 변환하는 방법의 프로토콜을 설명합니다. 

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Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

성인에서 태어난 뉴런의 통합을 공부

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

연구

신경과학

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

성인 인간의 뇌에서 단기 자유 부동 슬라이스 문화

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

성인 인간 뇌 조직에서 인간 마이크로글리아 획득

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 미세 혈관 내피 세포의 파생, 확장, 냉동 보존 및 특성화

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...