유도성 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인으로 줄기 세포 및 그 자손을 마킹하는 것은 생체내에서 뇌에서 성체 줄기 세포의 활성화, 증식, 이동 및/또는 분화에 대한 공간적 및 시간적 분석을 가능하게 한다. 계보 추적은 계보 헌신, 개입에 대한 반응 및 다중 효능에 대한 새로운 정보를 나타낼 수 있습니다. 트랜스제닉 계보 추적 접근법의 장점은 특정 세포 계보 추적의 특이성, 세포 회전율 또는 분화에 관계없이 형광 단백질의 지울 수 없는 발현, 독시실린의 낮은 독성, 조건부 활성화, 및 면역염색 및 면역형광을 포함하는 혈통 미량 조직에 대한 일반적인 하류 분석과 함께 사용의 용이성을 포함한다.
성인 뇌의 가소성과 세포의 광범위한 함의로 인해 성체 줄기 세포의 특성화 및 분석은 신경 퇴행성 질환, 뇌 가소성에 대한 대사 영향, 노화 및 기타 관련 조건에 대한 연구를 알리는 데 도움이됩니다. 시작하려면 슬라이드를 실온으로 따뜻하게하고 얼음처럼 차가운 아세톤으로 15 분 동안 고정하십시오. 슬라이드를 1X 헹굼 버퍼에서 5분 동안 세척하고, 각 단계 사이의 실온에서 분당 60회 회전으로 진탕한다.
핵 항원을 실온에서 10분 동안 0.3%Triton X-100으로 방치하여 투과시킨다. 세포질 항원을 0.3%Tween-20으로 실온에서 10분 동안 방치하여 투과시킨다. 1x DAKO 항원 검색 용액의 50 내지 100 밀리리터에서 10분 동안 마이크로웨이빙 슬라이드를 10분 동안 두 번 미세 흔들어서 항원 검색을 수행한다.
다음으로, 실온에서 다섯 분 동안 완충액으로 헹구십시오. 실온에서 20분 동안 70%에탄올 중의 0.3%Typogen Black에서 슬라이드를 인큐베이션한 다음, 헹굼 완충액으로 세척한다. 조직 주위에 소수성 장벽을 그립니다.
차단 시약으로 섭씨 37도에서 20 분 동안 차단하십시오. 항체 희석액에 희석된 일차 항체와 함께 섭씨 네 도에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다. 실온에서 10 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.
다음날, 알렉사 플루오르 이차 항체의 절편을 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 슬라이드를 10 분 동안 헹굼 완충액에서 두 번 씻으십시오. AlexaFluor 488에 컨쥬게이트된 1 내지 500개의 항-GFP 항체의 100 마이크로리터로 뇌 절편을 표지하고, 섭씨 4도에서 밤새 인큐베이션하여 내인성 Fluor4를 부스트하여, 추적된 세포를 표시한다.
다음날 헹굼 버퍼로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 실행 중인 DI 물에서 다섯 분 동안 세척한다. 밀리리터 당 100 나노그램의 4'6-디아미디노-2-페닐인돌로 5분 동안 카운터염색한다.
그런 다음 실행 DI 물에서 다섯 분 동안 씻으십시오. 각 조직 섹션 위에 형광 안전 장착 매체 한 방울을 추가하고 22mm x 22mm 커버슬립으로 밀봉합니다. 최적의 신호를 보장하기 위해 장착 당일에 이미징을 권장합니다.
섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 4 % PFA에서 심질 관류 후 뇌를 고정시키고 절편화하기 시작합니다. 그리고 다시 실온에서 한 시간 동안. 실온에서 두 번 1x PBS로 한 시간 동안 뇌를 세척하십시오.
시상 뇌 블록을 사용하여 뇌를 1 밀리미터 두께의 섹션으로 자르고 1x PBS가 들어있는 다섯 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 메탄올 전처리를 위해, 실온에서 1시간 동안 1x PBS로 두 번 세척하여 시작한다. 실온에서 한 시간 동안 50 % 메탄올로 씻으십시오.
실온에서 한 시간 동안 80 % 메탄올로 씻으십시오. 실온에서 한 시간, 두 번 100 % 메탄올로 씻으십시오. 표백제 샘플은 20% 디메틸설폭사이드와 메탄올 중 5% 과산화수소를 섭씨 네 도에서 밤새 처리한다.
표백 후, 실온에서 두 번 메탄올로 샘플을 한 시간 동안 세척한다. 실온에서 한 시간 동안 20 % 디메틸 설폭사이드와 메탄올로 두 번 씻으십시오. 실온에서 한 시간 동안 80 % 메탄올로 씻으십시오.
실온에서 한 시간 동안 50 % 메탄올로 씻으십시오. 실온에서 한 시간 동안 PBS로 두 번 세척한다. PBS 0.2%Triton X-100으로 실온에서 1시간 2회 세척한다.
뇌를 맑게 하는 면역염색을 위해, 샘플을 오비탈 진탕기에서 밤새 섭씨 37도에서 1x PBS, 0.2%Triton X-100, 20%DMSO, 0.3몰 글리신으로 인큐베이션하여 시작하십시오. 1x PBS, 0.2%Triton X-100, 10%DMSO, 6%염소 혈청을 섭씨 37도에서 오비탈 쉐이커에서 3일 동안 차단한다. 샘플을 1x PBS, 0.2 % Tween-20, 10 마이크로 그램 / 밀리리터 헤파린 나트륨 염으로 섭씨 37도에서 1 시간 동안 두 번 씻으십시오.
다음에, 1x PBS, 0.2%Tween-20, 밀리리터 당 10 마이크로그램의 헤파린, 5%DMSO, 3%염소 혈청을 함유하는 1 내지 500 농도의 토끼 항GFP 알렉사플루오르 488을 섭씨 37도에서 2일 동안 안비진탕기에서 인큐베이션한다. 샘플을 1x PBS, 0.2%Tween-20에서 밀리리터 헤파린 당 10마이크로그램으로 오비탈 쉐이커에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 세척한 다음 이틀 동안 하루에 한 번 세척합니다. 샘플을 50% 테트라하이드로퓨란과 물의 한 밀리리터에서 하룻밤 동안 배양한다.
샘플을 80%THF 테트라하이드로퓨란과 물의 한 밀리리터에서 한 시간 동안 인큐베이션한다. 샘플을 100% 테트라하이드로퓨란에서 한 시간 동안 두 번 인큐베이션한다. 멸균 닦아내기로 샘플을 건조시키고 바이알 바닥에 가라 앉을 때까지 디클로로메탄에서 배양하십시오.
60 분 이상 배양하지 마십시오. 샘플이 맑아질 때까지 한 밀리리터의 디벤질 에테르에서 인큐베이션한다. 이미지를 준비할 때까지 실온에서 디벤질 에테르에 샘플을 보관하십시오.
면역염색된 뇌 절편을 이미지화하려면 여러 항체의 동시 발현을 확인할 수 있는 공초점 현미경을 통해 슬라이드를 분석합니다. 우리는 라이카 스텔라리스 다섯 현미경을 HyD S 하이브리드 검출기와 함께 사용합니다. 맑은 뇌를 이미지화하려면 자동화 된 단계와 자동화 된 타일링 기능이있는 거꾸로 된 공초점 현미경을 사용하십시오.
먼저 디벤질 에테르에 잠겨있는 유리 바닥 접시에 평평한 뇌 섹션을 놓으십시오. 상이한 뇌 영역과 다양한 세포 유형에 걸친 형광 강도의 현저한 차이가 혈통 추적 뇌에서 펄스 추격 기간 이후에 관찰되었다. 맥락막 신경총에서 맥락막 상피 세포는 두꺼운 세포막과 강한 녹색 형광 신호를 가졌는데, 이는 주변 세포와 쉽게 구별할 수 있는 Tert 양성 세포로부터 유래되었음을 나타낸다.
맥락막 신경총에서 다른 더 작은 세포 유형은 더 약한 GFP 신호를 가졌다. 소뇌에서, 베르그만 신경교 세포는 바스켓 세포보다 더 높은 수준의 GFP를 발현했고, GFP 발현의 변화는 또한 개별 바스켓 세포 사이에 존재했다. 공장 감각 뉴런 축색돌기의 경우 후각전구의 사구체층 내에서도 높은 수준의 GFP 후각구근의 사구체층을 채우는 감각신경색돌기를 발현하여 토마토막을 높은 수준으로 발현하거나, 대부분의 다른 뇌 영역과 비교했을 때 적색 형광이 동일한 뉴런이 GFP 양성인 경우에도 일부 세포가 계보 추적 중에 mTomato 신호를 더 느리게 잃는 것으로 나타났음을 나타낸다.
대조적으로, 맥락막 신경총에서 GFP 양성 세포는 낮은 mTomato를 발현하였다. 대부분의 다른 뇌 영역에서, 토마토 신호는 대부분의 세포 유형에서 낮은 수준으로 발현되며, 내피 세포는 뇌 조직의 적색 형광 배경에서 뚜렷하게 눈에 띄기에 충분히 밝은 형광 신호가 유일한 세포 중 일부입니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 맑은 뇌의 형광 신호가 대부분의 다른 면역 분석법보다 빨리 퇴색한다는 것입니다.
가능한 한 빨리 그리고 칠일 이내에 샘플을 이미지화하는 것을 잊지 마십시오. 다음으로, 뇌 조각 또는 맑은 뇌의 이미징, GFP 신호로 마커의 착색 및 불소의 정량화는 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행 할 수 있습니다.
