우리는 환자 피부 섬유아세포에서 신경 전구세포를 만들고 신경및 신경퇴행성 질병을 연구하기 위하여 이 프로토콜을 이용합니다. 우리는 이 프로토콜이 속도를 포함하여 고전적인 IPS 기술에 비해 많은 장점을 가지고 있지만, 또한 특정 경우에 더 심각한 질병 표현형을 얻는 것 같습니다. 우리는 신경학상 및 신경 퇴행성 질병을 공부하고 피부 견본을 사용하여 우리가 환자의 다양성을 실제로 평가하는 것을 실제로 허용합니다.
내 실험실은 질병에 있는 성상 세포의 역할에 특히 관심이 있고 우리는 우리가 약물을 시험하고 또한 질병 기계장치를 공부하기 위하여 NPC에서 만드는 성상 세포를 사용합니다, 뿐 아니라 인간과 마우스 뉴런과 공동 배양에서. 이 프로토콜이 유익할 수 있기를 바라며 질문이 있으시면 연락주시기 바랍니다. 감사합니다.
세포 은행 이나 피부 생검에서 얻을 수 있는 1 차적인 인간 피부 섬유 아 세포를 사용. 배양 세포에서 37 섭씨 5% CO2 조직 배양 배양. 적어도 1~2개의 구절을 위한 통로 세포는 실험에서 사용하기 전에 해동을 게시한다.
세포가 준비되면, 15~20분 동안 실온에서 PBS에서 희석된 1:200 농도로 인간 섬유네틴으로 6웰 플레이트를 코팅합니다. 표 1에 표시된 것처럼 섬유아세포 미디어를 준비합니다. 세포가 도금 될 준비가되면, 접시에서 fibronectin을 제거하고 즉시 세포 용액 또는 섬유 아세포 미디어의 두 밀을 추가합니다.
미디어를 추가하기 전에 접시를 건조시키지 마십시오. 세포가 얼마나 빨리 자라는지에 따라, 인간 섬유넥틴 코팅 6웰 플레이트의 두 우물에서 플레이트 150, 000 ~ 200, 000 섬유아세포. 배양 세포에서 37 섭씨 5% CO2 조직 배양 배양.
파종 후 날, 현미경의 밑에 섬유아세포를 확인하고 세포 밀도가 4개의 레트로바이러스 벡터를 가진 잘 70 에서 85% Transduce 1 사이인지 확인합니다: Oct3/4, Klf4, Sox2 및 c-Myc. 빠르게 성장하는 10의 감염의 복합성을 사용하거나 느린 성장 섬유 아세포에 대한 15. 트랜스유도 효율은 각 벡터에 대해 70% 이상의 양수 셀을 초과해야 합니다.
일반 섬유아세포 배지를 바이러스 성 믹스에 추가하여 1 마일당 총 부피를 차지합니다. 두 번째 잘 치료되지 않고 하룻밤 동안 배양하는 조직 배양 인큐베이터에 세포를 반환합니다. 트랜스듀션 다음날 PBS로 세포를 한 번 씻고 신선한 섬유아세포 미디어 1개를 추가합니다.
배양 세포에서 37 섭씨 5% CO2 조직 배양 배양. 다음 날, 표에 표시된 바와 같이 변환 매체를 준비하고 PBS로 한 번 세척하여 잔류 섬유아세포 배지를 제거한 다음 변환 배지 1마일을 추가합니다. 처리되지 않은 미디어의 미디어를 변환 매체로 변경합니다.
현미경의 밑에 세포를 관찰하고 형태학에 있는 변경을 감시하십시오. 셀 미디어는 변환 프로세스 전반에 걸쳐 변환 미디어의 1~2마일과 후속 iNPC 배양으로 매일 교체해야 합니다. 세포가 나머지 30%의 미디어에서 커버되도록 하면서 우물에서 70%의 미디어를 신중하게 제거하여 미디어를 변경합니다.
세포를 계속 관찰하고 변환 미디어의 1~ 2마일로 매일 미디어를 변경합니다. 변환 매체에서 약 5 6 일 후에 또는 세포가 매우 조밀해질 때, 그(것)들을 1 개에서 2 또는 최대 1 - 3을 통과합니다. Accutase를 따뜻하게하고 실온에서 15~20분 동안 PBS에서 1밀리 총 섬유네틴1을 희석한 6웰 플레이트에 적절한 수의 우물을 코팅합니다.
세포를 분리하지 않고 PBS로 조심스럽게 셀을 씻으시다. 우물의 벽을 사용하여 PBS를 세포에 부드럽게 적용하십시오. 파이펫이나 흡입으로 PBS를 조심스럽게 제거하십시오.
500 마이크로리터 Accutase를 추가하고 조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2~ 3분 동안 배양합니다. 현미경의 밑에 대부분의 세포가 분리되어 있는지 확인하십시오. 세포가 벗겨진 경우, 신선한 변환 매체의 두 마일을 추가하고 덩어리를 해리하기 위해 2 ~ 3 번 위아래로 부드럽게 파이펫을 넣습니다.
15 밀 튜브에서 세포를 수집하고 Accutase를 더 희석시키기 위해 3 개의 밀 미디어를 추가합니다. 원심분리기는 실온에서 200G에서 4분간 원심분리기. 세포 펠릿에서 상체를 제거하고 신선한 배지의 한 밀에서 세포를 다시 중단합니다.
셀 덩어리를 해결하기 위해 2~3회 위아래로 부드럽게 파이펫을 만듭니다. 코팅 된 여섯 우물에서 섬유 네틴을 제거하고 즉시 각 잘 각 에 하나의 마일 신선한 미디어를 추가합니다. 1:2의 분할 비율을 위해, 셀 서스펜션의 500 마이크로리터를 하나의 우물에 넣고 다른 500을 두 번째로 잘 넣습니다.
동남서 방향에서 6개의 우물을 부드럽게 흔들어 세포를 분배하고 37도 조직 배양 배양배인 배양기를 넣습니다. 현미경의 밑에 세포를 관찰하고 1-2 mils로 매체를 변경합니다. 세포가 다시 분할 될 준비가 될 때까지 매일 미디어를 변경합니다.
표 에서 볼 수 있듯이 EGF 또는 헤파린 없이 증가 된 농도에서 FGF를 포함 하는 NPC 미디어를 준비. 이 새로운 분할에서 변환 미디어에서 셀의 우물을 시드하고 다른 하나는 NPC 미디어에서 잘. NPC 미디어의 1~2마일로 매일 iNPc의 미디어를 계속 변경하십시오.
표 하나에 따라 성상세포 매체를 준비한다. 신선한 iNPc에서 성상 세포를 만들기 위해, 씨앗 iNPC는 10 센티미터 fibronectin 코팅 플레이트에 있는 성상 세포 질의 10 밀에 직접 다음 날 약 10 %의 합류입니다. 배양 세포에서 37 섭씨 5% CO2 조직 배양 배양.
도금 후 3일 후에 성상세포 배지 10mils로 배지를 변경합니다. 5~7일 동안 세포를 분화하십시오. 실험을 위해 시드하려면 2단계에서 2.6단계에서 설명된 바와 같이 트립신 또는 Accutase를 사용하여 성상세포를 분할합니다.
권장 시딩 밀도는 표 2에 포함되어 있습니다. 유도된 성상세포를 생성하기 위해 iNNp를 분화하는 방법에 대한 지침은 표 3에 있습니다. 냉동 iNPC 주식에서 성상 세포를 만들려면 액체 질소 저장 탱크에서 부분 재고 파일을 제거하고 섭씨 37도에서 신속하게 해동하십시오.
세포가 해동되자마자, 성상세포 의 5개의 밀을 포함하는 15 mil 관에 있는 파이펫 세포 용액. 200G 실온에서 4분 간 원심분리기. 상체를 제거하고 1 마일 신선한 성상 세포 매체에서 다시 중단하십시오.
9개의 밀을 섬유네틴 코팅 10센티미터 접시에 넣고 밀 세포 용액 1개를 추가하여 동남-서압의 세포를 부드럽게 분배합니다. 배양 세포에서 37 섭씨 5% CO2 조직 배양 배양. 이 프로토콜은 야마나카 인자를 포함하는 레트로 바이러스를 사용하여 인간의 피부 섬유 아세포에서 직접 iNPC의 신속하고 쉬운 생성을 허용합니다.
이 방법은 줄기 세포 상태와 클로날 선택의 필요성을 우회하여 복제 변화를 피할 수 있게 한다. 세포가 변환 과정을 겪고있는 동안 명심해야 하는 중요한 단계는 섬유아세포 파종 밀도, 미디어 pH 및 세포를 최적의 인플루언서로 유지하는 것입니다. 변환 프로세스 중 최적의 연결성 및 형태 변화의 예는 그림 하나에서 찾을 수 있습니다.
변환 프로세스가 완료되면 NPC는 섬유아세포 마커 및 형태의 발현이 강하게 감소하거나 발현이 없음을 나타내며 NPC 특이적 세포 마커를 발현합니다. 더욱이, 그들은 또한 유도된 뉴런 같이 다른 세포주를 생성하기 위해 사용될 수 있습니다, oligodendrocytes, 및 성상 세포. 우리의 경험에서, 유도된 성상세포는 재현가능한 다수에 있는 순수한 인구에서 생성될 수 있기 때문에 특히 약 과 질병 기계장치 시험을 위해 아주 귀중합니다.
유도된 성상세포는 분할 시 세포의 작은 알리쿼트를 복용하거나 이전에 냉동된 iNPC 부분과 성상세포 매체에서 직접 도금을 복용함으로써 iNPc로부터 분화될 수 있다. 이 과정에서 중요한 고려 사항은 iNPc의 초기 종자 밀도를 낮게 유지하여 분화 과정을 저해하는 것으로 나타났으며, 산성화가 건강한 성상세포도 활성화할 수 있기 때문에 미디어 pH에 추가적인 주의를 기울이고 있다. 요약하자면, 직접 변환 프로토콜은 환자 피부 샘플로부터 신경 전구 세포를 만들 수 있는 매우 빠른 방법입니다.
이것은 동시에 세포 견본의 더 많은 수를 공부하고 질병 문맥에 있는 다양성을 실제로 보는 것을 허용합니다. 우리는 이것이 신경 전구 세포, 뉴런뿐만 아니라 공동 배양또는 약물 테스트 또는 기계학 연구에 스스로 사용할 수있는 성상 세포를 만드는 데 사용할 수있는 매우 강력한 분석이라고 생각합니다.
