및 트라이 제도 줄기 세포 이니셔티브 (스타 재단)이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서와 NYSTEM (C026447 C026446)에서 교부금을 통해 고급 연구자를위한 친교에 의해 지원되었다.

1. 문화 미디어, 코팅 식기 hPSCs의 유지 보수의 제조 1.1 미디어 준비 참고 : 최대 2 주 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 살균 및 저장에 대한 모든 미디어를 필터링 할 수 있습니다. 시약 이름, 회사 및 카탈로그 번호는 자료 표에 나와 있습니다. <ol><li> DMEM/10 % FBS : 885 ml의 DMEM, 100 ㎖의 FBS, 10 ㎖ 펜 / Strep의 5 ML L-글루타민을 결합합니다. </li><li> HES - 중간 : 800 ml의 DMEM/F12, 200 ㎖의 KSR, 5 ㎖ L-글루타민, 5 ㎖ 펜 / Strep의, 10 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액 1 ㎖ β-메르 캅토 에탄올을 결합합니다. FGF-2 미디어를 필터링 한 후 10 NG / ㎖를 추가합니다. 주의 : β-메르 캅토 에탄올은 흡입, 섭취, 피부 접촉을 피할 것, 독성이다. </li><li> KSR-차별화 매체 : 820 ml의 녹아웃 DMEM, 150 ㎖의 KSR, 10 ㎖ L-글루타민, 10 ㎖ 펜 / Strep의, 10 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액 1 ㎖ β-메르 캅토 에탄올을 결합합니다. </li><li> N2-differentiati매체 : 980 ml의 dH보다 2 O에 12g의 DMEM/F12 분말을 녹여 1.55 g 포도당, 2g 중탄산 나트륨 100 mg의 APO 인간 트랜스페린을 추가합니다. 매체에 용해 된 솔루션을 추가, 25 mg의 인간 인슐린과 40 ㎕의 1 N NaOH로 2 ㎖ Dh를 2 O 혼합. 100 ㎕의 퓨 트레 디 히드로 클로라이드, 60 μL 셀렌, 100 ㎕의 프로게스테론을 추가하고 dH보다 2 O로 1 L까지의 볼륨을 일정하게 </li></ol> 문화 요리의 1.2 코팅 <ol><li> 리겔 코팅 : 해동 1 ㎖는 용해 될 때까지 나누어지는에 19 ㎖의 DMEM/F12를 피펫으로 리겔 나누어지는 냉동. 40 μm의 셀 스트레이너 및 판 (8) ml/10 cm 접시를 통과하여 덩어리를 제거합니다. 실온에서 1 시간 동안 요리를 품어. 즉시 세포를 도금하기 전에 리겔을 대기음. 참고 : 4 ° C 이상의 온도에서 응집 할 수 있기 때문에 리겔 빠르게 작업 </li><li> PO / 램 / FN 코팅 : 10cm 접시에 15 ㎍ / ㎖의 폴리-L Ornithin 브롬화 수소 산염을 포함하는 1X PBS의 10 ML을 추가. 37 ℃에서 밤새 요리를 품어 한 번 1X PBS로 접시를 씻고 2 ㎍ / ㎖의 마우스 라미닌-I 및 2 ㎍ / ml의 피브로넥틴을 포함하는 1X PBS의 10 ml/10 cm 접시를 추가합니다. 37 ℃에서 밤새 요리를 품다 세포를 도금하기 전에 완전히 솔루션을 제거하고 플레이트에 뚜껑없이 조직 문화 후드의 벽에 그들을 서서 15 ~ 20 분 동안 실온에서 건조시킵니다. 참고 : 요리는 하나 (눈에 보이는) 표면에 결정 구조를 볼 수 있습니다 때 완전히 건조 및 세포 도금을위한 준비가되어 있습니다. 번호판이 건조 상태에서 몇 시간 동안 RT에서 유지 될 수있다. PO / 램 / FN 요리 2 일간 미리 준비해야합니다. 비상 사태의 경우 램 / FN은 2 ~ 4 시간 동안 배양 할 수있다. 그러나, 이는 차선의 분화 / 생존 결과 위험있다. </li></ol> hPSCs 1.3 유지 참고 : hPSCs는 0.1 % 젤라틴 및 mitotically 불 활성화 된 마우스 배아 섬유 아 세포 (M에 유지HES 매체에서 EFS를) 보충 10 NG / ML FGF-2 이전에 10, 12 설명한대로. 세포는 6~8일마다 분할해야합니다. <ol><li> 5 분 동안 실온에서 (마그네슘이나 칼슘없이 1X PBS에서) 8 ㎖의 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 접시. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 신속하게 냉동 MEFs 해동. 10 ㎖ DMEM/10 % FBS에 1 백만 MEFs를 추가합니다. </li><li> 젤라틴을 기음과 세포를 접시. 최소 6 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 한 번 1X PBS로 접시를 씻고 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드로 보충 10 ㎖의 HES 매체를 추가, 준비된 MEF 플레이트에서 DMEM/10의 %의 FBS를 대기음. 매체는 20 분 동안 37 ° C로 예열합니다. 참고 : hPSCs 수동 분할하는 임베디드 현미경 층류 후드가 사용된다. 그러나, 세포는 적절한 대안적인 방법을 사용하여 계대 배양 할 수있다. </li><li> 임베디드 현미경으로 층류 후드에서 셀 리프터를 사용하여 별도의 식민지를 분리하고 그들을 떠 보자. </li><li> 을 사용하여부동 식민지를 대기음 신선하고 따뜻한 MEF 접시에 그들을 파견하는 1 ML의 주사기. 새 접시에 세포의 약 사분의를 전송합니다. 37 ° C에서 알을 품다 </li><li> 신선한 HES 매체 매일 세포를 피드. </li></ol> 차별화를위한 hPSCs 2. 도금 참고 : hPSCs (그림 1B 참조) 분할 또는 도금 차별화 식민지가 대형 인 경우에,하지만 여전히 자신의 테두리에서 가능한 차별화 된 세포와 같은 적은 날카로운 가장자리가되어야한다. 세포 계대 설명서를 사용하여 유지하는 경우 콜로니를 쉽게 눈으로 볼 수 있도록 충분히 커야한다. 이 시점에 맞는 느낌을 얻으려면 하나는 계대없이 2 주 동안 별도의 hPSC 요리를 유지하고 세포에 도달보고를 차별화 / 계대를위한 최적의 시점을 통과 할 수있다. <ol><li> 분화를 시작하기 전에 리겔 1 시간으로 10 센티미터 요리를 준비합니다. 성공적인 매트 리겔이 도포 될 수있다배의 배율로 확인. </li><li> hPSCs 분할 할 준비가되면, 매체를 기음과 세포에 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 ㎖를 추가합니다. </li><li> 하나 하나의 세포가 현미경으로 접시를 들기로 MEFs을 볼 수 있습니다 적극적으로 될 때까지 2 분 동안 수평으로 요리를 흔들어. hPSC 식민지는 식민지로 첨부 남아있다. </li><li> 즉시 철저하게, 트립신을 대기음 판은 2-4 분 동안 RT에 서 보자. </li><li> 플레이트에 HES - 중간 2 ML을 추가하고 P1000 피펫을 사용하여 세포를 분리. 주 : 세포가 쉽게 표면으로부터 들어 올려 질 수없는 경우에, 플레이트가 다른 2-3 분 동안 RT에서 비어 인큐베이션 될 수있다. </li><li> 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드 보충 8 ML의 HES-매체에 세포를 전송합니다. </li><li> 이전에 준비 10cm 접시에서 리겔을 대기음. 리겔 판에 (한 10cm 접시에서 세포가 2 개의 10 센티미터 요리로 분할됩니다 예를 들어) 1:1 또는 1:2의 세포를 접시. 37 ° 품다밤에 C. 참고 :이 도금은 약 10 만 셀 / ㎠가 발생한다. </li></ol> 신경 분화 3. 유도 참고 : 세포 90-100 % 년 합류 (그림 1C 참조), 일반적으로 다음과 같은 일 때 차별화 (0 일) 시작할 수 있습니다. 정확한 컨 플루가 아직 도달하지 않은 경우가 차별화를위한 준비가 될 때까지, 세포 HES 중간 매일 공급 될 수있다. 대안 적으로, 도금 셀의 초기 수는 증가 될 수있다. <ol><li> 3 0 일에, 0.1 μM의 LDN193189 및 10 μM SB431542를 포함 KSR-분화 매체를 접시 10 ml/10 cm 매일 세포를 공급. </li><li> 하루 4, 5 급지 75 % KSR-분화 매체 및 25 % N2-분화 배지로 세포 LDN193189와 SB431542을 포함 모두. </li><li> 6 일, 7 사료에 50 % KSR-분화 배지와 50 % N2-분화 배지로 세포 LDN193189 및 SB4를 포함 모두31542. </li><li> 하루에 8, 9 공급에 25 % KSR-분화 매체 75 % N2-분화 배지로 세포 LDN193189와 SB431542을 포함 모두. </li><li> 하루 11 세포의 replating 1.2.2에 표시된 날에 9와 10은 PO / 램 / FN 요리를 준비합니다. </li><li> 날 N2-분화 배지로 10 피드 세포 LDN193189와 SB431542를 포함. </li></ol> NC 사양의 물방울 4. Replating <ol><li> 하루 11 대기음 램 / FN의 이전 준비 판에서와 1.2.2에 설명 된대로 그들이, 20 ~ 30 분 동안 실온에서 완전히 건조 보자. </li><li> 분화 세포에서 매체를 제거 1X PBS로 한 번 세포를 씻어 8 ML의 accutase/10 센티미터 요리를 추가합니다. 37 ℃에서 20 분 동안 품어 </li><li> 셀 리프터를 사용하여 세포를 분리하고 5 ㎖ 피펫 accutase에이를 재현 탁. 15 ML 튜브에 현탁액을 전송합니다. </li><li> 1X PBS의 5 ML을 추가, 114 X g에서 5 분 동안 세포를 스핀. </li><li> 10 ㎖ 1 세포를 재현 탁X PBS. 단일 세포 현탁액을 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링 및 혈구 또는 이에 상응하는 기술을 사용하여 세포 수를 세는 방법을 보여줍니다. </li><li> 아래 세포를 스핀 100,000의 농도 200 μM 아스 코르 빈산 (AA), 20 NG / ML BDNF, 100 NG / ML FGF8, 20 NG / ML SHH, 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드를 포함하는 N2-분화 배지를 재현 탁 -150,000 cells/10 μL. </li><li> 그들이 건조 PO / 램 / FN 15cm 접시에 닿지 않고 서로 가까이 반복 - 피펫, 판 (10) μL 방울을 사용. 참고 : 분화 된 세포의 한 10cm 접시는 일반적으로 약 2 ~ 3 배 15cm 접시 또는 약 100 × 10 μL의 droplets/15 센티미터 요리를 초래한다. </li><li> 물방울 N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y 30 ㎖를 추가하고 37 ℃에서 부화 (방울을 방해하지 않는) 매우 신중하게 한 다음, 20 ~ 30 분 동안 실온에서 서 보자 </li><li> 하루에 12에서주의 깊게 20 ml/15 cm 접시 N2/AA/BDNF/FGF8/SHH으로 세포를 공급. </li><li> 다에서Y 14-17 N2/AA/BDNF/FGF8으로 모든 두 번째 또는 세 번째 날 세포를 공급. </li><li> 하루에 16, 17에 FACS 정렬 후 NC 세포를 replate하는 PO / 램 / FN 판을 준비합니다. </li></ol> 오. 형광 활성화 된 셀 NC 셀들 (FACS)를 정렬 참고 : FACS에 대한 세포의 준비는 약 2 시간이 필요합니다. <ol><li> 18 일째 제거 매체에서 접시에 1X PBS로 한 번 세포를 세척하고 12 ML의 accutase를 추가합니다. 37 ℃에서 20 분 동안 세포를 품어 </li><li> 셀 리프터를 사용하여, 표면으로부터 세포를 분리하고 그들을 플로트하자. 50 ML 튜브로 전송하고 1X PBS 30 ㎖를 추가, 5 ㎖ 피펫을 사용하여 현탁액에 세포를 피펫. 114 X g에서 5 분 동안 세포를 스핀. </li><li> P1000 피펫을 사용하여, 1 ㎖ 2 % FBS / HBSS (HBSS 15 mM의 HEPES를 포함)에있는 세포를 재현 탁. 2 % FBS / HBSS의 19 ML을 추가하고 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링 할 수 있습니다. 15m 얼음에 세포를 품어항체 블로킹에서 다음 혈구를 사용하여 계산합니다. </li><li> 아래 세포를 스핀 및 2 % FBS / HBSS에서 천만 세포 / ml의 농도로 재현 탁 그들을. </li><li> 컨트롤 만 (APC 만 및 488 만) FACS 염색 흠, 단일 염색 (HNK-1 만 만 P75) 및 이차 항체에 대한 1 백만 세포에게 별도로 각을 설정합니다. </li><li> 적절한 샘플을 1 ㎖ 정학 천만 셀 당 P75 차 항체의 HNK-1과 5 μL의 5 μl를 추가하고 얼음에 20 분 동안 품어. </li><li> 10 ㎖의 1X PBS (114 XG에 원심 분리기 5 분)에서 세포를 세척하고 1 ㎖ 2 % FBS / HBSS에있는 세포를 재현 탁. 적절한 샘플을 1 ㎖ 정학 APC의 2 μL 및 1,000 만 셀 당 488 차 항체의 1 μl를 추가하고 어둠 속에서 얼음에 20 분 동안 품어. 참고 : APC와 488은 각각 HNK-1, P75 염색 여기에 사용되는 이차 항체이다. </li><li> 10 ㎖의 1X PBS로 세포를 씻어 두 번, 500 ㎕의 1 천만 세포를 재현 탁DAPI (0.5에서 NG / μL) 또는 FACS 분석에서 죽은 세포를 제외 할 수있는 대체 라이브 셀 얼룩을 포함하는 2 % FBS / HBSS. </li><li> FACS 튜브를 충당하기 위해 샘플을 전송합니다. </li><li> 세포 수집에 0.5 ㎖의 2 % FBS / HBSS와 FACS 튜브를 준비합니다. 참고 : 세포 및 수집 튜브가 정렬 시간 동안 어둠 속에서 얼음에 보관됩니다. </li><li> DAPI, APC와 488 종류의 DAPI-/HNK-1 + / P75 + 더블 양성 세포를 검출 할 수있는 레이저와 셀 정렬 기계를 사용. 주 : 이들 세포가 정렬 된 모집단에서 제외하기위한 준비 시간 및 셀의 처리는 세포 사멸의 작은 비율에 이르게 DAPI 얼룩 사균에만 따라서 허용한다. 어떤 대안 죽은 / 라이브 얼룩은이 목적을 위해 동일하게 작동합니다. DAPI 자체는 살아있는 세포 인구의 세포 독성을 유발하지 않습니다. </li></ol> 6. 순위 세포의 Replating, NC 유지 보수 및 확장 참고 : FACS 분류 세포는 손이어야한다최적의 생존을 보장하기 위해 특별한주의와 함께했다. 그들을 replating까지 얼음에 있습니다. 와동 또는 가혹를 피펫하지 마십시오. 셀은 튜브를 가볍게 치면 재현 탁 될 수있다. <ol><li> FACS 정렬 한 후, 그 아래로 회전 한 후, NC 세포를 계산하고 N2-분화 배지에서 재현 탁 30,000 세포에서 그들을 replate에 해당하는 양의 10 NG / ML FGF2, 20 NG / ML EGF와 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드로 보충 / 10 μL 방울. </li><li> 완전히 건조 이전에 PO / 램 / FN 접시와 10cm 접시 당 플레이트 약 50 ~ 70 방울을 준비했다. 요리는 20 ~ 30 분 동안 실온에서 서 보자. </li><li> 매우 조심스럽게 방울을 방해하지 않고 N2/FGF2/EGF/Y-27632 20 ml/10 cm 요리를 추가합니다. 37 ° C에서 세포를 품어 </li><li> N2/FGF2/EGF으로 2-3 일마다 세포를 공급. 참고 : 그들은 방울 내에서 말뚝 박기 시작할 때 NC 세포가 확장 또는 계대마다 약 4 ~ 5 일이나된다. </li><li> 통로 NC 세포는 배지, WA 제거SH 세포는 한 번 1X PBS와 및 CM 요리 accutase/10 8 ML을 추가합니다. 37 ℃에서 20 분 동안 품어 </li><li> 5 ㎖ 피펫을 사용하여 플레이트 떨어져 세포를 피펫과 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. PBS 1X 6 ML을 추가합니다. </li><li> 114 X g에서 5 분 동안 세포를 스핀. </li><li> 물방울 μL 20,000 cells/10을 위해 10 NG / ML FGF2, 20 NG / ML EGF와 10 μM Y-27632 디 히드로 클로라이드 보충 N2-분화 배지에서 세포를 Resuspend. </li><li> 건조 PO / 램 / FN 판에 10 μL 방울의 세포를 Replate. 요리는 20 ~ 30 분 동안 실온에서 서 보자. </li><li> 조심스럽게 N2/FGF2/EGF/Y-27632 20 ml/10 cm 요리를 추가합니다. 37 ° C에서 알을 품다 참고 : NC 세포가 유지되거나 상대적으로 균일 한 전구 인구로 최대 2 주 동안 확장 할 수 있습니다. 더 이상 문화가 다양한 자손 세포 유형으로 분화하도록 발생할 수 있습니다. </li></ol>

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	<li>Lee, G., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+technology+for+the+study+of+human+disease.">Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease.</a> Nat Methods. 7, 25-27 (2010).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient.">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+using+familial+dysautonomia+induced+pluripotent+stem+cells+identifies+compounds+that+rescue+IKBKAP+expression.">Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression.</a> Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).</li><li>Zimmer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+developmental+toxicants+and+signaling+pathways+in+a+functional+test+based+on+the+migration+of+human+neural+crest+cells.">Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells.</a> Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).</li><li>Dupin, E., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+progenitors+and+stem+cells:+from+early+development+to+adulthood.">Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood.</a> Dev Biol. 366, 83-95 (2012).</li><li>McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease:+a+developmental+disorder+of+the+enteric+nervous+system.">Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).</li><li>Slaugenhaupt, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+a+splicing+mutation+in+the+IKBKAP+gene+causes+familial+dysautonomia.">Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia.</a> Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).</li><li>Cheung, N. K., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblastoma:+developmental+biology,+cancer+genomics+and+immunotherapy.">Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).</li><li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+establishment+of+hemopoietic+supportive+stromal+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow.</a> Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).</li><li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+subtype+specification+of+fertilization+and+nuclear+transfer+embryonic+stem+cells+and+application+in+parkinsonian+mice.">Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice.</a> Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).</li><li>Elkabetz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES+cell-derived+neural+rosettes+reveal+a+functionally+distinct+early+neural+stem+cell+stage.">Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage.</a> Genes Dev. 22, 152-165 (2008).</li><li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neural+crest+induction,+melanocyte+specification,+and+disease-related+pigmentation+defects+in+hESCs+and+patient-specific+iPSCs.">Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs.</a> Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).</li><li>Molofsky, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi-1+dependence+distinguishes+neural+stem+cell+self-renewal+from+progenitor+proliferation.">Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation.</a> Nature. 425, 962-967 (2003).</li></ol>

저자는 공개하는 이해 충돌이 없습니다.

hESC의 / hiPSCs에서 R-NC 세포의 성공적 분화를 들어 다음과 같은 고려 사항이되어야한다. 그것은 항상 무균 배양 조건에서 작동하는 것이 중요합니다. 특히,이 오염이 성공적 분화를 방해 할 것이기 때문에, 정기적으로 마이코 플라스마 오염 hPSC 배양 물을 시험하는 것이 중요하지만, 좀처럼 hPSC 배양 시각적 검출 될 수 없다. R-NC 차별화 90-100% 세포 밀도에서 시작되어야한다; 낮은 세포 밀도는 세포의...

인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC는) 좋은 동물 모델도 기본 조직이 모두 사용할 수있는 인간의 질병의 조사와 미래의 치료에 특히 엄청난 잠재력을 보여 주었다. hESC의 / hiPSC 기술의 적용 예는 다음과 같습니다 특히 관심의 세포는 무제한 수량 1에서 재생 의학에 hESC의 / hiPSCs에서 생성 할 수 있습니다. 세포는 특정 질환을 운반 환자에서 생산하고 시험 관내 질병 모델에서 2,3 확립하는데 사용될 수있다. 이러한 질병 모델은 신약 화합물 4에 대한 탐구뿐만 아니라 효능과 독성 5에 대한 기존의 약물 테스트에서 대규모 약물 검사를 위해 사용될 수있다. 체외 질병 모델이 새로운 질병 메커니즘의 식별로 이어질 수 있습니다. hESC의 / IPSC 기술의 모든 애플리케이션에 특정 작업을하는 것이 중요하다, 잘 정의그 질병에 영향을 D의 세포 유형. 따라서, 고체 및 재현 시험 관내 분화 프로토콜의 가용성은 hESC의 / hiPSC 기술의 모든 응용 프로그램에 대해 매우 중요합니다. 프로토콜의 hESC / hiPSC 라인과 다른 연구자들 사이 최소한의 변화, 시간 비용, 노력, 어려움과 비용뿐만 아니라 최대 재현성을 표시하는 것이 바람직하다. 신경 능선 (NC) 세포는 표피와 신경 상피 세포 사이의 척추 neurulation 동안 등장. 그들은 증식과 배아에 걸쳐 광범위하게 마이그레이션 및 뼈 / 연골, 두개 안면 골격, 감각 신경, 슈반 세포, 멜라닌 세포, 평활근 세포, 장내 신경, 자율 신경, 크롬 친화 세포를 포함, 자손 세포 유형의 인상적인 다양성을 일으키다 , 심장 중격 세포의 치아와 부신 / 갑상선 선의 세포 6. 따라서, NC 세포 매력적인 셀 줄기 세포들에 대한 분류 및 위해 중요이러한 Hirschsprung의 질병 7, 가족 성 자율 신경 8뿐만 아니라 신경 모세포종 9로 암과 같은 질병의 다양한 모델링. 또한, 그들은 체외에서 인간의 배아 발달의 양상을 연구 할 수있는 가능성을 제공합니다. 현재 널리 인간 배아 줄기 세포 (10, 11)에서 NC 세포의 유도에 대한 시험 관내 분화 프로토콜에 적용 분화 35 일까지 요구하고는 MS5 세포와 같은 기질 피더 세포에 신경 유도를 포함하고, 따라서 제대로 정의되지 않은 조건에서 수행된다. 이 NC 세포를 대량으로 생성하는 스케일 업 할 수 있지만, 높은 처리량 약물 스크리닝 4 필요한 예를 들어, 이는 노동 및 비용 집약적이다. 또한, 재현하기 어려울 수 있습니다 신경 근엽, 수동 계대을 포함하고는 hESC의 또는 hiPSC의 큰 다양성에 적용 할 경우, 따라서 특히 전반적인 변동성이 적용됩니다선. 여기서, 피더 세포의 자유 18 일간 ​​프로토콜 NC 세포의 단계적 유도가 도시된다. 이 방법은 현재 사용되는 프로토콜보다 더 짧고 더 정의된다. 또한, 다른 hiPSC 라인 구비 NC 세포 생성에 매우 강력하다. 중요한 것은이 두 프로토콜에 의해 산출 NC 세포가 신경 근엽 (이하 불리는 장미-NC 또는 R-NC)의 경계에서 나오는 것을 알 수있다. 이 프로토콜을 사용하여 유도 된 세포들은 동일한 NC 마커를 표현하고 마이크로 어레이 분석에 함께 클러스터 형태 학적으로 동일하게 보인다. 새로운 프로토콜 (R-NC)를 사용하여 유도 된 NC 세포들은 마이그레이션 및 상기 뉴런으로 분화 할 수 있도록 이전 프로토콜 (MS5-R-NC)를 사용하여 유도 된 NC 세포와 유사한 기능이다. 따라서 세포는 MS5-R-NC 세포와 동시에 사용될 수있다. hESC의 / IPSC에서 NC 세포의 유도를위한 R-NC 세포 프로토콜은 NC의 혈통을 포함 hESC의 / IPSC 기술의 모든 응용 프로그램에 도움이 될 것입니다. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:897px;" width="897">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Regents</td>
			<td style="width:219px;">company</td>
			<td style="width:160px;">cataloge number</td>
			<td style="width:165px;">comments</td>
		</tr>
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			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicinlin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM minimum essential amino acids solution&#160;</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant human FGF basic (FGF2)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-001MG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 powder&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12500-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">APO human transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Putriscine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L Ornithin hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse Laminin-I</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dispase in Hank&#39;s Balanced Salt Solution 5U/ml</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris-R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDN193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td>Tocris-R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ascorbic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BDNF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FGF8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>423-F8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>464SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>14170-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>1563-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human recombinant EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gelatin (PBS without Mg/Ca)</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6680-100TST</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)</td>
			<td>Advanced Targeting Systems</td>
			<td>AB-N07</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">APC rat anti-mIgM</td>
			<td>BD Parmingen</td>
			<td>550676</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5279</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Material/Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>GSC-6105M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,&#160; pipetts, pipet tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass hematocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture laminar flow hood with embedded microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture biosafety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell sorting machine, i.e. MoFlo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml TB syringe 27Gx1/2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell lifter Polyethylene</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeder-free derivation of neural crest progenitor cells from human pluripotent stem cells

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 접시에 인간의 질병을 모델링하고 질병이나 사고 후 재생 응용 프로그램에 이식 가능한 세포의 원천으로, 인간의 배아 발달을 연구하기위한 큰 잠재력이있다. 신경 능선 (NC) 세포는 말초 신경계 및 아교, 멜라닌 세포 및 간엽 세포에서 세포와 같은 성숙한 체세포 많은 다양한 대한 전구체이다. 그들은 세포의 운명 사양 및 마이그레이션을 포함하여 인간의 배아 발달의 측면을 연구하는 세포의 중요한 원천입니다. 말단 분화 세포 유형으로 NC 전구 세포의 분화는 또한, 시험 관내에서 인간의 질병을 모델링 질병 메커니즘을 조사하고 재생 의료용 세포를 생성 할 수있는 가능성을 제공한다. 이 문서 hPSCs에서 NC 세포의 유도에 대한 현재 사용할 수있는 체외 분화 프로토콜의 적응을 선물한다. 이 새로운 프로토콜은 diffe 18 일이 필요합니다rentiation는 장치가없는 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 라인뿐만 아니라 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 선 사이에서 쉽게 확장 가능하고 높은 재현성이다. 과거와 현재 프로토콜은 동일한 정체성 NC 세포를 얻을 수 있습니다.

MS5-R-NC 프로토콜 (11)를 통해 R-NC 프로토콜의 두 가지 가장 중요한 개선 피더가없는, 정의 분화 조건 및 시간 요건의 전체적인 단축이다. MS5 피더 셀 (13)는 인간 배아 줄기 세포 (14)로부터의 신경 분화를 지원하기 위해 표시되었습니다 쥐의 골수 유래 기질 세포이다. 인간 배아 줄기 세포 따라서 초기 인간 신경 발달을 흉내 낸, NC 세포가 10 등장하는의 주변에, 저밀도...

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Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC)에서 파생 된 신경 능선 (NC) 세포는 인간 발달과 질병 모델링을위한 세포 대체 요법에 대한 큰 가능성이있다. 여기에, 현재 널리 사용의 공급이없는 적응<em&gt; 시험관</em&gt; hPSCs에서 NC 세포의 유도를위한 분화 프로토콜이 제공됩니다.

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

feeder-free-derivation-neural-crest-progenitor-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K 조회수.  Sloan-Kettering Institute for Cancer Research. 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC)에서 파생 된 신경 능선 (NC) 세포는 인간 발달과 질병 모델링을위한 세포 대체 요법에 대한 큰 가능성이있다. 여기에, 현재 널리 사용의 공급이없는 적응 시험관 hPSCs에서 NC 세포의 유도를위한 분화 프로토콜이 제공됩니다.

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Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

세포 어세를 형성 신경 콜로니 : 신경 전구 세포로부터 타고난 신경 줄기 세포를 차별 어세이

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

연구

신경과학

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

인간의 모공에서 신경 크레스트 줄기 세포의 분리와 문화

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

인간의 신경의 집계의 cGMP-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Sialoglycan의 신진 대사 표지에 의하여 1 차적인 신경 줄기 및 전구 세포의 세포 표면 마커를 확인

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...