そしてトライ制度幹細胞イニシアチブ（スター財団）;この作品は、スイス国立科学財団からNYSTEM（C026447 C026446）からの補助金を通じて先進的な研究者のためのフェローシップでサポートされていました。

1。培養培地、コーティングされた料理とhPSCsのメンテナンスの調製 1.1メディアの準備注：最大2週間、暗所で4℃で殺菌し、ストアのすべてのメディアをフィルタリングします。試薬名、会社とカタログ番号は、 資料の表に記載されている。 <ol><li> DMEM/10％FBS：DMEM 885ミリリットル、100ミリリットルのFBS 10mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび5mlのL-グルタミンを組み合わせる。 </li><li> HES-培地：DMEM/F12 800ミリリットル、200ミリリットルKSR 5mlのL-グルタミン5mlのペニシリン/ストレプトマイシンを10mlのMEM、最小必須アミノ酸溶液1mlのβ-メルカプトエタノールを組み合わせる。メディアをフィルタリングした後に10 ng / mlのFGF-2を追加します。 注意：β-メルカプトエタノールは毒性が、吸入、経口摂取、皮膚接触を避ける。 </li><li> KSR-分化培地：820ミリリットルノックアウトDMEM 150mlのKSR 10mlのL-グルタミンを10mlのペニシリン/ストレプトマイシンを10mlのMEM、最小必須アミノ酸溶液、1mlのβ-メルカプトエタノールを組み合わせる。 </li><li> N2-differentiati培地上：1.55グラムのグルコース、2グラム重炭酸ナトリウムおよび100mg APOヒトトランスフェリンを追加、980ミリリットルのdH 2 Oに12グラムのDMEM/F12粉末を溶かす。 25 mgのヒトインスリンおよび40μlの1N NaOHで2ミリリットルのdH 2 Oを混ぜて、媒体に溶解した溶液を加える。 100μlのプトレシン二塩酸塩を追加し、60μlの亜セレン、100μlのプロゲステロンとDH 2 Oで1リットルにボリュームを持ち出す</li></ol>培養皿の1.2コーティング<ol><li>マトリゲルコーティング：雪解け1ミリリットルは、それが溶解するまで一定分量以上の19ミリリットルのDMEM/F12をピペットでマトリゲルのアリコートを凍結した。 40μmのセルストレーナーとプレート8エルフテックスcmディッシュに通して塊を除去します。室温で1時間の料理をインキュベートする。細胞を播種する直前にマトリゲルを吸引する。 注：それは4℃以上の温度で凝集することができますので、マトリゲルで素早く作業</li><li> PO /ラム/ FNコーティング：10cmの皿に15μg/ mlのポリ-Lオルニチン臭化水素酸塩を含む1×PBSを10ミリリットルを追加します。。 37℃で一晩の料理をインキュベート一回1X PBSでプレートを洗浄し、2μg/ mlのマウスラミニン-I及び2μg/ mlのフィブロネクチンを含む1×PBSを10エルフテックスcmディッシュを追加します。 37℃で一晩の料理をインキュベート細胞を播種する前に、完全に溶液を除去し、プレートを蓋なしで組織培養フードの壁にそれらを放置して15〜20分間、室温で完全に乾燥させます。 注：1は、表面の結晶構造を見ることができる料理は（目で見える）完全に乾燥し、細胞播種の準備ができている。プレートを、この乾燥した状態で、数時間室温に保つことができる。 PO /ラム/ FN料理は2日間、事前に準備する必要があります。緊急の場合、ラム/ FNは2〜4時間インキュベートすることができます。しかし、これは次善の分化/生存結果を危険にさらすことができる。 </li></ol> hPSCsの1.3メンテナンス注意：hPSCsは0.1％ゼラチンと、有糸分裂不活性化されたマウス胚性線維芽細胞上で維持されている（MHES培地中でのEF）を補充した10 ng / mlのFGF-2先に記載したよう10,12。細胞は6-8日ごとに分割する必要があります。 <ol><li>室温で5分間（マグネシウム又はカルシウムのない1×PBS中）1 mlの0.1％ゼラチンで被覆10cmディッシュ。 </li><li> 37℃の水浴中で迅速に凍結したMEFを解凍する。 10ミリリットルのDMEM/10％FBSに百万のMEFを追加します。 </li><li>ゼラチンを吸引し、細胞をプレート。少なくとも6時間、37℃でインキュベートする。 </li><li>一回1X PBSでプレートを洗浄し、10μMのY-27632二塩酸塩を補充した10ミリリットルのHES-培地を追加し、準備されたMEFプレートからDMEM/10％のFBSを吸引除去する。培地は20分間37℃でウォームアップすることができます。 注意：hPSCsの手動分割のために埋め込まれた顕微鏡を用いて、層流フードが使用されている。しかし、細胞は、適切な代替方法を使用して継代することができる。 </li><li>埋め込まれた顕微鏡で、層流フードの下で、セルリフターを使用して別々のコロニーを切り離し、それらをフロートしてみましょう。 </li><li>使用浮遊コロニーを吸引し、新鮮な、暖かいMEFプレートにそれらをディスパッチする1ミリリットルの注射器。新しい皿に細胞の約四分の一を転送します。 37℃でインキュベート</li><li>新鮮なHES培地で毎日細胞を養う。 </li></ol>差別化hPSCsの2。メッキ注意：コロニーが大きいが、それでも（ 図1（b）参照 ）、その境界での差別できるだけ少ない細胞とシャープなエッジを持っているときhPSCsは、分化のために分割またはめっきされるべきである。細胞がコロニーを継代マニュアル使用して維持されると簡単に目で見ることができる大きさでなければなりません。この時点での権利感触を得るために1を継代することなく、2週間ごとに個別のHPSCディッシュを維持し、細胞が到達見て、継代/それらを区別するための理想的な時点を渡すことができます。 <ol><li>分化を開始する前に、マトリゲル1時間で10cmの皿を準備します。成功したマトリゲルコーティングは可能4倍の倍率で検証した。 </li><li> hPSCsを分割する準備ができたら、メディアを吸引し、細胞を0.05％トリプシン-EDTAの4ミリリットルを追加。 </li><li> 1は、単一の細胞が顕微鏡下でプレートをリフトオフなどのMEFを見ることができます積極的になるまで2分間水平に料理を振る。 HPSCコロニーはコロニーとして取り付けられたまま。 </li><li>すぐに、徹底的に、トリプシンを吸引し、プレートを2-4分間、室温で放置。 </li><li>板にHES-培地2mlを加え、P1000ピペットを用いて、細胞を剥離。 注：細胞は、容易に表面から持ち上げることができない場合は、プレートをさらに2〜3分間RTで空にインキュベートすることができる。 </li><li> 10μMのY-27632二塩酸塩を補充した8ミリリットルHES-培地に細胞を移す。 </li><li>先に調製した10cmの皿からマトリゲルを吸引。マトリゲルプレートに：（1つの10 cmディッシュから細胞を二つ10cmの皿に分割される例えば）1:1または1:2の割合で細胞をプレート。 37℃でインキュベートする一晩のC。 注：このメッキは約10万個/ cm 2になる必 ​​要があります。 </li></ol>神経分化の3。誘導注：細胞は、90〜100％コンフルエント（ 図1Cを参照）、通常翌日である場合は分化（0日目）に開始することができる。正確な集密度がまだ達していない場合、それらが分化のための準備が整うまで、細胞を、HES培地を毎日供給することができる。代替的に、播種した細胞の最初の数を増加させることができる。 <ol><li> 〜3 0日目に、0.1μMLDN193189および10μMSB431542を含む10エルフテックスCMディッシュKSR-分化培地を毎日細胞を養う。 </li><li> 4日目と5飼料75％KSR-分化培地および25％N2-分化培地で細胞がLDN193189とSB431542を含む両方。 </li><li> 6日目と7飼料に50％KSR-分化培地で細胞を、50％N2-分化培地は両方LDN193189とSB4を含む31542。 </li><li> 8日目と9飼料に25％KSR-分化培地および75％N-分化培地で細胞がLDN193189とSB431542を含む両方。 </li><li> 9日目と10日の11上の細胞の再プレーティングのために1.2.2に示すように、PO /ラム/ FNの料理を準備。 </li><li> LDN193189およびSB431542を含むN2-分化培地で一日に10フィード細胞。 </li></ol> NC仕様の液滴中に4。再プレー<ol><li> 11日目吸引·ラム/ FN上で予め用意され、プレートからと1.2.2で説明したように彼らは、20〜30分室温で完全に乾燥させます。 </li><li> 、分化する細胞から培地を除去1X PBSで細胞を1回洗浄し、cmディッシュaccutase/10 8ミリリットルを追加します。 37℃で20分間インキュベートする。 </li><li>セルリフターを使用して、細胞を剥離し、5ミリリットルピペットでをAccutaseで再懸濁します。 15mlチューブにサスペンションを転送します。 </li><li> 1X PBSを5ミリリットルを加え、114 X gで5分間細胞をスピン。 </li><li> 10ミリリットル1で細胞を再懸濁X PBS。単一細胞懸濁液を確保するために、40μmのセルストレーナーを介してそれらをフィルタリングし、血球計又は等価な技術を用いて細胞を数える。 </li><li>ダウン細胞をスピン100,000の濃度で200μMのアスコルビン酸（AA）、20 ng / mlのBDNF、100 ng / mlのFGF8、20 ng / mlのSHH、10μMのY-27632二塩酸塩を含むN2-分化培地で再懸濁します-150000 cells/10μL。 </li><li>彼らは乾燥したPO /ラム/ FN 15cmの皿に触れることなく、互いに近接リピートピペッター、プレート10μlの液滴を使用して。 注：分化した細胞の1つの10 cmディッシュは、通常約2〜3倍の15cmディッシュや、約100×10μLdroplets/15のcmディッシュになる。 </li><li> N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Yの30ミリリットルを加え、37℃でインキュベート（液滴を乱さない）を非常に慎重に、液滴は、20〜30分間、室温で放置</li><li> 12日目に、慎重に20 ml/15 cmディッシュのN2/AA/BDNF/FGF8/SHHで細胞を養う。 </li><li> DAからY 14-17 N2/AA/BDNF/FGF8で2日または3日ごとに細胞を養う。 </li><li> 16日目と17日にFACS選別した後、NC細胞をreplateするPO /ラム/ FNプレートを準備します。 </li></ol> NC細胞の5。蛍光活性化細胞選別（FACS） 注意：FACSのための細胞の調製は、約2時間を必要とします。 <ol><li> 18日目に、培地を除去皿に1×PBSで細胞を1回洗浄し、12ミリリットルをAccutaseを追加。 37℃で20分間、細胞をインキュベート</li><li>セルリフターを使用して、表面から細胞を剥離し、それらをフロートしてみましょう。 50mlチューブに転送し、1×PBS 30mlの投稿を5mlピペットを用いて懸濁液中に細胞をピペット。 114×gで5分間細胞をスピン。 </li><li> P1000ピペットを使用して、（HBSSを15mMのHEPESを含有する）を2％FBS / HBSS 1ml中に細胞を再懸濁。 2％FBS / HBSSの19ミリリットルを追加し、単一細胞懸濁液を確保するために40μmのセルストレーナーを通して細胞をフィルタリング。 15メートルのために氷上で細胞をインキュベート抗体ブロッキングのために、次に血球計数器を用いて、それらを数える。 </li><li>細胞をスピンダウンし、2％FBS / HBSS中千万細胞/ mlの濃度で再懸濁します。 </li><li>のみを制御（APCのみと488のみ）、FACS染色染色されていない、単一染色（HNK-1のみしかP75）および二次抗体のために100万個の細胞を取って、それぞれを設定します。 </li><li>適切なサンプルに1ミリリットル懸濁液中の1000万個の細胞あたりのP75次抗体のHNK-1および5μLの5μLを加え、氷上で20分間インキュベートする。 </li><li> 10ミリリットル1X PBS（114×gで遠心分離器5分）で細胞を洗浄し、1ミリリットルの2％FBS / HBSS中で細胞を再懸濁。適切なサンプルに、APCの2μLと1ミリリットル懸濁液中の1000万個の細胞あたり488の二次抗体の1μlを加え、暗所で氷上で20分間インキュベートする。 注：APCおよび488は、それぞれ、HNK-1およびp75染色のためにここで使用した二次抗体である。 </li><li> 10ミリリットル1X PBS中に細胞を洗浄二回、500μlの1000万個の細胞を再懸濁DAPI（0.5でのNG /μL）またはFACS分析から、死細胞を排除するために、代替の適切な生細胞染色を含む2％FBS / HBSS。 </li><li> FACSチューブを適切にサンプルを転送します。 </li><li>細胞採取のために0.5ミリリットルの2％FBS / HBSSでFACSチューブを準備します。 注意：細胞とコレクションチューブは、ソート時間の間に暗闇の中で氷の上に保持されます。 </li><li> DAPIは、APCと488並べDAPI-/HNK-1 + / P75 +二重陽性細胞を検出することができ、レーザを用いて、細胞選別機を使用した。 注：これらの細胞は、ソートされた母集団から除外するための準備時間、細胞の処理は、細胞死のわずかな割合をもたらす、DAPI染色剤死細胞は、従って、可能にする。任意の代替生/死染色は、この目的のためにも同様に動作します。 DAPI自体が生きた細胞集団における細胞毒性を引き起こすことはありません。 </li></ol> 6。選別された細胞の再プレート、ノースカロライナ維持·拡大注意：FACS選別した細胞は、手でなければなりません最適な生存を確保するために特別な注意を払って導いた。それらを再プレートまで氷上に保管してください。厳しく、それらをボルテックスまたはピペットないでください。細胞は、チューブをタッピングして再懸濁することができる。 <ol><li> FACSソーティングした後、それらをスピンダウンして、NC細胞をカウントし、N2-分化培地に再懸濁は、30,000細胞でそれらをreplateするために、適切な量の10 ng / mLのFGF2、20 ng / mlのEGFおよび10μMのY-27632二塩酸塩を補っ/ 10μlの滴。 </li><li>徹底的に10cmの皿当たり約50〜70滴のPO /ラム/ FNプレートとプレート予め用意して乾燥させます。料理は、20〜30分間、室温で放置。 </li><li>非常に慎重に滴を乱すことなくN2/FGF2/EGF/Y-27632の20エルフテックスcmディッシュを追加します。 37℃で細胞をインキュベート</li><li> N2/FGF2/EGFで2〜3日ごとに細胞を養う。 注：これらは液滴内積み上げ起動したときのNC細胞が膨張、継代し、約4〜5日毎に、またはされています。 </li><li>通路にNC細胞は、中、ワシントンを削除SH細胞を1回1X PBSでcmディッシュaccutase/10 8ミリリットルを追加します。 37℃で20分間インキュベートする。 </li><li> 5ミリリットルピペットを用いてプレートから細胞をピペット15mlチューブに転送。 6ミリリットル1X PBSを追加します。 </li><li> 114×gで5分間細胞をスピン。 </li><li>液滴μlの2万cells/10を有するために、10 ng / mlのFGF2、20 ng / mlのEGFおよび10μMY-27632二塩酸塩を補充したN2-分化培地で細胞を再懸濁する。 </li><li>乾燥したPO /ラム/ FNプレートに10μlの液滴中の細胞をReplate。料理は、20〜30分間、室温で放置。 </li><li>慎重にN2/FGF2/EGF/Y-27632の20エルフテックスcmディッシュを追加します。 37℃でインキュベート 注：NC細胞は、比較的均質な前駆細胞集団として維持又は2週間まで拡張することができる。長い文化は、様々な子孫細胞型に分化するためにそれらをもたらす可能性がある。 </li></ol>

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M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neural+crest+induction,+melanocyte+specification,+and+disease-related+pigmentation+defects+in+hESCs+and+patient-specific+iPSCs.">Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs.</a> Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).</li><li>Molofsky, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi-1+dependence+distinguishes+neural+stem+cell+self-renewal+from+progenitor+proliferation.">Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation.</a> Nature. 425, 962-967 (2003).</li></ol>

著者らは、開示することなく、競合する利害関係はありません。

ヒトES細胞/ hiPSCsからのR-NC細胞の正常な分化のために、次の点に注意して行ってください。これは、常に無菌培養条件の下で動作することが重要である。特に、この汚染が成功分化の妨げになることから、定期的にマイコプラズマ汚染のためHPSC培養をテストすることが重要ですが、容易にHPSC培養で視覚的に検出することができません。 R-NC分化が90〜100％の細胞密度で開始されるべきである;?...

ヒト胚性幹細胞（hESC）およびヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）は、良好な動物モデルでも、一次組織のいずれもが利用可能なヒト疾患の研究および将来の治療のための、特に、巨大な可能性を示している。ヒトES細胞/ hiPSC技術の応用例としては、以下の通りである：特定の目的の細胞は無制限数量1で、再生医療のためのhESC / hiPSCsから生成することができます。細胞は、特定の疾患を有する患者から製造し、インビトロ疾患モデル2,3 に確立するために使用することができる。このような疾患モデルは、新しい薬剤化合物の探求4並びに有効性および毒性5のための既存の薬物の試験に大規模な薬物スクリーニングに用いることができる。 インビトロ疾患モデルは、新規な病気のメカニズムの同定につながる可能性がある。ヒトES細胞/ IPSC技術のすべてのアプリケーションに対して、特定と連携することが重要で、よく定義関心対象の疾患において影響d個の細胞タイプ。このように、固体で再現性のin vitroでの分化プロトコルの利用可能性は、ヒトES細胞/ hiPSC技術のすべてのアプリケーションのために重要である。プロトコルは、ヒトES細胞/ hiPSCラインと異なる研究者間の最小の変動、時間費用、労力、難しさやコストだけでなく、最大の再現性を示すことが望ましい。 神経冠（NC）細胞は、表皮と神経上皮間脊椎動物神経胚形成の間に出現する。それらは増殖し、胚全体に広範囲に移動し、骨/軟骨、頭蓋顔面骨格、感覚神経細胞、シュワン細胞、メラニン細胞、平滑筋細胞、腸、ニューロン、自律ニューロン、クロム親和細胞を含む、子孫細胞型の印象的な多様性を生じさせる、心臓中隔細胞、歯および副腎/甲状腺腺細胞6。このため、NC細胞が魅力的な、細胞幹細胞のフィールドの型とするために重要であるこのようなヒルシュスプルング病7、家族性自律神経失調症8などの疾患、ならびに神経芽細胞腫9のような種々の癌のモデル化。さらに、それらは、 インビトロでヒト胚発生の局面を研究する可能性を提供する。 現在利用可能な、広くhESCの10,11からNC細胞の誘導のためにインビトロで分化プロトコルにおいて適用分化の35日まで必要とし、例えば、MS5細胞などの間質フィーダー細胞上で神経誘導を伴い、従って、あまり明確でない条件下で行われる。それはNC細胞を大量に生成するためにアップスケールすることができるが、ハイスループット薬剤スクリーニング4に必要な、例えば、これは、手間とコスト集約的である。さらに、再現が困難であることができる、神経ロゼットの手動継代を伴うので、それはのhESCまたはhiPSCの多種多様に適用する場合、特に、全体的な変動を受けるライン。ここでは、フィーダー細胞を含まない18日間プロトコルにおけるNC細胞の段階的な導出を示す。このメソッドは、現在使用されているプロトコルよりも短く、より定義されています。さらに、異なるhiPSC系統のうちNC細胞を生成する際に非常に堅牢である。重要なのは、それが両方のプロトコルによって得られたNC細胞は、神経ロゼット（以下と呼ばれるロゼット-NCまたはR-NC）の境界に出現することが示されている。 2つのプロトコルのうちいずれかを使用して得られた細胞は、同じNCマーカーを発現し、マイクロアレイ解析で一緒にクラスター化、形態学的に同じに見える。新しいプロトコル（R-NC）を用いてNC由来細胞は、それらが移動し、さらに神経細胞に分化することができるように古いプロトコル（MS5-R-NC）を用いてNC由来細胞と同様の機能である。したがって、細胞は、MS5-R-NC細胞と併用して用いることができる。ヒトES細胞/ IPSCからNC細胞の誘導のために、R-NCセルプロトコルは、NC系統が関与するヒトES細胞/ IPSC技術のすべてのアプリケーションに有用である。&lt;/ pの&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:897px;" width="897">
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		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicinlin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM minimum essential amino acids solution&#160;</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant human FGF basic (FGF2)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-001MG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 powder&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12500-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">APO human transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Putriscine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L Ornithin hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse Laminin-I</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dispase in Hank&#39;s Balanced Salt Solution 5U/ml</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris-R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDN193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td>Tocris-R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ascorbic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BDNF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FGF8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>423-F8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>464SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>14170-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>1563-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human recombinant EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gelatin (PBS without Mg/Ca)</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6680-100TST</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)</td>
			<td>Advanced Targeting Systems</td>
			<td>AB-N07</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">APC rat anti-mIgM</td>
			<td>BD Parmingen</td>
			<td>550676</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5279</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Material/Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>GSC-6105M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,&#160; pipetts, pipet tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass hematocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture laminar flow hood with embedded microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture biosafety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell sorting machine, i.e. MoFlo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml TB syringe 27Gx1/2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell lifter Polyethylene</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeder-free derivation of neural crest progenitor cells from human pluripotent stem cells

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は皿にヒト疾患をモデル化するためと病気や事故後の再生アプリケーション用の移植可能な細胞の供給源として、人間の胚発生を研究するための大きな可能性を秘めている。神経冠（NC）細胞は、末梢神経系およびグリア、メラノサイトおよび間葉細胞からの細胞などの成体の体細胞の多種多様のための前駆体である。彼らは、細胞運命の仕様および移行を含むヒト胚発生の側面を研究する細胞の貴重な情報源である。最終分化した細胞型へNC前駆細胞のさらなる分化は、 インビトロでのヒト疾患をモデル化する病気のメカニズムを調査し、再生医療用の細胞を生成する可能性を提供する。この記事ではhPSCsからNC細胞の誘導のために現在利用可能なin vitroでの分化プロトコルの適応を提示します。この新しいプロトコルは、diffeの18日間を必要とするrentiationは、フィーダーを含まない、ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）ラインだけでなく、人間の人工多能性幹細胞（hiPSC）ラインのうち、容易に拡張性の高い再現性がある。新旧両方のプロトコルが同じアイデンティティのNC細胞を得る。

MS5-R-NCプロトコル11上のR-NCプロトコルの二つの最も重要な改善は、フィーダーを含まない、定義された分化条 ​​件と時間の要件の全体的な短縮である。 MS5フィーダー細胞13は hESCの14から神経分化を支持することが示されているマウス骨髄由来間質細胞である。 hESCを従って、初期のヒト神経発生を模倣する、NC細胞を、10現れるそれらの周囲に、低密度フォ...

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Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

神経堤ヒト多能性幹細胞に由来する（NC）細胞（HPSC）は、ヒトの発生および疾患をモデル化し、細胞置換療法のための大きな可能性を有する。ここでは、現在広く使用されているのフィーダーフリー適応<em&gt; in vitroで</em&gt; hPSCsからNC細胞の誘導のための分化プロトコルが提示される。

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

feeder-free-derivation-neural-crest-progenitor-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K ビュー.  Sloan-Kettering Institute for Cancer Research. 神経堤ヒト多能性幹細胞に由来する（NC）細胞（HPSC）は、ヒトの発生および疾患をモデル化し、細胞置換療法のための大きな可能性を有する。ここでは、現在広く使用されているのフィーダーフリー適応 in vitroで hPSCsからNC細胞の誘導のための分化プロトコルが提示される。

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Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

人間の毛包から神経堤幹細胞の単離および培養

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

神経科学

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

シアログリカンの代謝標識による原発神経幹および前駆細胞の細胞表面マーカーの同定

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

インビボ子宮内電気ポレーションによるフェレット新皮質における神経前駆細胞の標的化

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...