We would like to acknowledge and thank Tom Goddard at University of California San Francisco for his endless help with Chimera, Joel Mancuso and Chris Booth at Gatan, Inc. for their help with SBF-SEM data collection of bacteria dataset, Doug Wei at Zeiss, Inc. for his help with the FIB-SEM data collection of epithelial cell dataset, Kent McDonald at University of California Berkeley Electron Microscopy Lab for advice on sample preparation, TEM imaging and tomography, Roseann Csencsits at Lawrence Berkeley National Laboratory for her help taking the cryo-TEM image, Elena Bosneaga for cryo-sectioning of the plant dataset, Jocelyn Krey at Oregon Health and Science University for the dissection of utricle tissue, David Skinner at National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Jitendra Malik at University of California Berkeley for their advice in software infrastructure, and Pablo Arbelaez at&#160;University of California Berkeley&#160;for his codes contributions to the custom-tailored script presented in this article. 
Research was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Science under contract No. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], as well as U.S. National Institutes of Health (NIH) grant No. P01 GM051487 [M.A.] for the inner ear hair cell project and microscopy instrumentation use.

1 수동 추상화 된 모델 생성 주 : 방법의 상세에 대하여 설명 키메라 특정하지만, 다른 소프트웨어 패키지 대신에 사용될 수있다. 유일한 목적은 오히려 물체의 체적 형상을 표시하는 것보다, 형상 측정을하기 위해 기하학적 모델 (예를 들어, 공 및 스틱 모델)을 생성 할 때이 방법을 사용한다. <ol><li> 수동 추상화 모델 생성을위한 프로그램에 적합한 데이터 볼륨을 가져. <ol><li> 파일&gt; 열기를 선택지도 파일 열기 대화 상자를 당겨. 원하는 맵의 파일 위치로 이동합니다. </li><li> 다른 렌더링 스타일 데이터를 표시 할 수있는 볼륨 뷰어 (도구&gt; 볼륨 데이터&gt; 볼륨 뷰어) 선택 기능&gt; 표시 스타일을 당깁니다. </li><li> 볼륨 뷰어에서 히스토그램에 수직 막대를 드래그하여 디스플레이에 대한 임계 값을 조정창. </li></ol></li><li> 3D 볼륨을 통해 이동 (예를 들어, 슬라이스 의한 슬라이스) 세그멘테이션에 대한 관심 영역을 선택하고, 필요한 경우 더 작은 서브 - 볼륨을 자르한다. <ol><li> 볼륨 뷰어 대화 상자에서 축을 클릭 한 다음 X, Y, 또는 Z를 선택합니다. </li><li> 볼륨 뷰어 대화 상자에서&gt; 비행기를 기능을 선택합니다. 왼쪽 상자의 번호에 해당하는 평면을 표시 깊이를 설정 하나를 클릭 한 모든 평면을 표시하려면 모두를 클릭합니다. </li><li> 볼륨 뷰어 대화 상자에서 선택 기능&gt; 아구를 선택합니다. <ol><li> 클릭하여 관심 영역 주위에 사각형 상자를 만들 끕니다. </li></ol></li></ol></li><li> 관심의 기능을 따라 마커를 놓고 모델이 완료 될 때까지 (종종 프로그램에 의해 자동으로 수행) 적절한 링커로 연결합니다. <ol><li> 볼륨 뷰어 메뉴 바에서 Tools (도구)&gt;볼륨 추적기 대화 상자가 볼륨 추적기 대화 상자를 엽니 다. 볼륨 추적기 대화 상자에서&gt; 새 마커 세트 파일을 선택합니다. </li><li> 볼륨 추적기 대화 상자에서 데이터 평면에 마우스&gt; 높은 품질에 장소 표시, 장소 마커를 확인으로 이동하고 마커의 크기를 조정, 링크 새로운 마커를 선택 마커 및 링크는 연속적으로 표시를 선택했습니다. </li><li> 마커 색상 견본을 클릭하고 색상을 선택합니다. 링크 색상에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 마커 및 링크 모델 건물 요소에 대한 반경을 입력합니다. </li><li> 볼륨 추적기 창에서 [오른쪽] 마우스 버튼을 사용하여 장소 마커를 선택하고 마커와 링크 반경을 삽입합니다. </li><li> 오른쪽 마커를 내려 놓고 시작 볼륨 데이터를 클릭합니다. 마커가 자동으로 연결됩니다. </li><li> 볼륨 추적기 대화 상자에서 파일&gt; 현재 마커 세트를 저장 한 다음&gt; 닫기 마커 세트를 파일. </li></ol></리&gt; <li> 관심의 초 원하는 기능으로 모델을 구축하기 위해 새로운 마커 세트 (단계 1.3.1)를 엽니 다. 기능의 차이를 강조하기 위해 마커 세트 사이의 색상 대비를 이용한다. </li></ol> 관심의 특징 2 수동 추적 주 : 방법의 상세에 대하여 설명 아미라 특정하지만, 다른 소프트웨어 패키지 대신에 사용될 수있다. 인구 밀도가 상대적으로 작고, 피쳐 추출의 정확성이 가장 중요 할 때, 수동으로 추적 시간이 소요되는 방식 인 경우이 방법을 사용한다. <ol><li> 수동 추적 옵션이있는 프로그램으로 가져 오기 볼륨 데이터. 이 기능을 가진 소프트웨어는 일반적으로 적어도 기본 페인트 브러시 도구를 제공합니다. <ol><li> 큰 볼륨이나 단층 촬영의 경우 (예를 들어, 16 비트 2048 X 2048 이상 .rec 또는 IMOD에 .mrc 생성 된 단층 촬영) : 열기를 선택 데이터&gt; filename.rec&gt;에서 마우스 오른쪽을 클릭 ...&gt; LargeDiskData로 원료를 선택 </i&gt;&gt; 옥&gt;로드. 옥&gt; 헤더 정보의 적절한 원시 데이터 매개 변수를 선택합니다. 새로운으로 전환하고 저장 <a href="http://filename.am/">filename.am의</a> 다음 단계에 사용하기위한 파일입니다. </li><li> 작은 3D 이미지 스택 파일의 경우 (예를 들어, 차원이 .tif 또는 .mrc 또는 .rec) : 오픈 데이터&gt;를 선택 filename.tif 또는 filename.mrc. 전환하고 이름으로 저장을 마우스 오른쪽 클릭&gt; <a href="http://filename.am/">filename.am</a> . 오류가 발생하거나 프로그램이 응답하지 않는 경우, 파일이 너무 클 수 있고, 단계 2.1.1에 따라 개방 될 수있다. </li></ol></li><li> 분할을위한 3D 서브 볼륨을 선택 조각을 통해 이동 한 다음 관심이 지역에 자릅니다. <ol><li> 3D 뷰어 창에서 이미지 파일을 열 수 Orthoslice을 선택합니다. 조각을 탐색 할 수 하단에 슬라이더를 사용합니다. </li><li> &gt; 풀 창에서 파일 이름 토글, LargeDiskData으로 열립니다 큰 데이터를 자르려면 마우스 오른쪽&gt; LatticeAccess을 클릭합니다. 강한 게 아니R은 원하는 상자 크기&gt; 적용합니다. 새 파일을 저장합니다. </li></ol></li><li> 분할 파일을 만듭니다. <ol><li> 우측&gt; 라벨&gt; 레이블 필드를 클릭&gt; 풀 창에서 파일을 움직입니다. 새 파일이 생성되고 자동 분할 편집기 탭에로드됩니다. </li></ol></li><li> 관심 장편의 테두리를 추적 한 다음 손으로 사용되는 소프트웨어 또는 특정 명령을 사용하여 트레이스를 채운다. 모든 조각을 통해 관심의 기능에 따라 수동 추적 세그먼트를 반복합니다. 아미라를 사용하여 다음 명령을 사용하여 <ol><li> 그림판 도구를 사용하기 위해, 필요에 따라, 다음 관심 피처의 경계를 추적하기 위해 마우스 포인터를 사용하여 브러시 크기를 변경. </li><li> 바로 가기 &quot;F&quot;로 추적 영역을 채 웁니다. 더하기 기호 또는 바로 가기 &quot;&quot;로 버튼을 클릭하여 선택을 추가합니다. 필요한 경우, &quot;U&quot;는 취소하고, 빼기 또는 삭제하는 &quot;S&quot;. </li></oL&gt; </li><li> 시각화 및 기본 질적 또는 소프트웨어 사용자 설명서 명령어 당 정량 분석​​을위한 표면 렌더링을 생성합니다. <ol><li> 개체 풀 탭에서 마우스 오른쪽&gt; SurfaceGen 클릭&gt; 풀 창에서 파일 이름 - labels.am 움직입니다. </li><li> 적용&gt; 원하는 표면 특성을 선택합니다. 새 파일 filename.surf은 풀에 작성됩니다. </li><li> &gt; 마우스 오른쪽 클릭&gt; 풀 창에서 filename.surf 토글, 서피스 뷰 SurfaceView를 분할 볼륨을 시각화합니다. </li><li> , 이동, 회전, 3D 볼륨을 확대하기 위해 3DViewer 창에서 도구를 사용합니다. </li></ol></li><li> 정확한 밀도를 추출하고 볼륨 또는 표면 영역으로 측정 값을 결정합니다. 고급 디스플레이, 분석 및 시뮬레이션을위한 다른 프로그램으로 내보내기. <ol><li> 3DViewer 창에서 적절한 옵션 (2D 길이와 2D 각도 측정을위한 하나의 2D 평면에 3 차원의 길이와 3D 각도를 선택&gt; 측정 도구를 클릭합니다3D 볼륨에서 측정). </li><li> 원하는 길이, 거리 및 각도를 측정하는 메쉬면을 클릭합니다. 값은 속성 창에 표시됩니다. </li></ol></li></ol> 3 자동 밀도 기반의 분할 주 : 방법의 상세에 대하여 설명 아미라 특정하지만, 다른 소프트웨어 패키지 대신에 사용될 수있다. <ol><li> 관심의 밀도를 철회 대비, 선명도, 또는 혼잡의 다양한 데이터 세트에이 방법을 사용합니다. </li><li> 자동 분할을위한 임계 마술 지팡이 나 다른 밀도 기반 툴 장착 프로그램에 오기 볼륨 데이터. 수동 추적을위한 방향으로 2.1-2.1.2에 설명 된 단계를 수행합니다. </li><li> 조각을 탐색 및 분할에 대한 영역을 선택합니다. 필요한 경우, 분할에 대한 작은 3D 서브 볼륨을 자릅니다. 수동 추적을위한 방향으로 2.2-2.2.2에 설명 된 단계를 수행합니다. </li><li> 의 농도를 선택관심의 기능, 일반적으로 클릭하거나 기능을 마크 또는 앵커 지점을 배치하여. 소프트웨어에서 허용하는 경우, 기능의 픽셀 강도를 포괄 번호 범위를 입력하고 원하는대로이 허용 오차를 조정합니다. 기능에 속하는 밀도는 앵커의 픽셀 또는 허용 오차 값의 강도에 따라 뽑힐 것입니다. 아미라를 사용하는 경우 다음 명령을 사용합니다. <ol><li> 구별 여백 기능에 대한 자동 선택 도구를 사용합니다. <ol><li> 관심 영역에 클릭 한 다음 기능이 완전히 강조되도록 값의 올바른 범위를 캡처하는 디스플레이 및 마스킹에서 슬라이더를 조정합니다. 바로 가기 &quot;&quot;로 선택을 추가합니다. </li></ol></li><li> 명확하게 구별 할 여백이없이 기능에 대한 임계 값 도구를 사용합니다. </li><li> 임계 값 아이콘을 선택합니다. 관심의 기능 만이 마스크 될 수 있도록 바람직한 범위 내에서 농도를 조정하는 슬라이더를 조정합니다. 선택 버튼을 클릭 한 후 바로 가기로 선택 추가220; &quot;. </li><li> 세그먼트 전체 볼륨, 선택을 추가하기 전에 모든 조각을 선택합니다. </li><li> 제도 및 / 또는 분할&gt; 부드러운 라벨&gt; 소음, 선택 분할을 삭제합니다. </li></ol></li><li> 수동 추적 섹션 2.6-2.6.2에 설명 된대로 시각화 및 질적 분석을 위해 표면을 생성합니다. 원하는 경우, 적절한 3D 디스플레이, 정량 분석​​ 및 시뮬레이션을위한 다른 프로그램에 내보낼 수 있습니다. </li></ol> 4 사용자 정의 맞게 자동 분할 참고 : 큰 볼륨에서 정확한 밀도 모델을 생성 할 수있는 기능을 컴퓨터 과학의 배경 경험을 필요로하지만, 수 있습니다 자동 분할에 대한 사용자 정의 스크립트를 만들려면이 방법을 사용합니다. <ol><li> 도구 (MATLAB (27)의 모양이 주관 분할의 구체적인 예) <ol><li> 이미지 전처리 : 수행 노이즈 제거, 배경 제거 및 이미지 향상다음 파이프 라인을 사용하여 : <ol><li> imread 명령을 사용하여 이미지를로드합니다. <ol><li> 명령 줄에서 다음을 입력합니다 &gt;&gt; 메신저 = imread $의의 image_path 분석 할 수있는 이미지의 위치의 ($의 image_path). </li></ol></li><li> 이미지 처리 도구 상자에서 추정 또는 알려진 잡음 전력에 대한 신호 비율 (NSR)를 사용하여 위너 필터를 호출합니다. </li><li> 이전에 처리 된 이미지를, 그 후, 배경 레이어를 추정 imopen 화상 개구 함수를 호출 다른 마스크로 결과를 할당. <ol><li> 명령 줄에서 다음을 입력합니다. &gt;&gt; 배경 = imopen (메신저, strel의 ($ shape_string, $ 크기)),이 방법에서, $의 shape_string 크기가 분석기로 주어진 변수 $ &#39;디스크&#39;와 같다 즉 &gt;&gt; 배경 = imopen (메신저, strel ( &#39;디스크&#39;, 15)). </li></ol></li><li> 배경으로 필터링 된 이미지를 뺍니다. <ol><li> &gt;&gt; IM2 = 메신저 - :를 명령 줄에서 다음을 입력배경 </li></ol></li><li> 결과의 품질에 따라, 또는 이미지 처리 도구 상자에서 기능 imadjust를 사용하여 호출 할 수있는 적응 오츠의 방법 (28)없이 이미지 정규화를 수행합니다. <ol><li> 명령 줄에서 다음을 입력합니다 &gt;&gt; IM3 = imadjust (IM2) </li></ol></li><li> 정규화 된 이미지를 자르기로 관심의 영역을 제한, 분할에 대한 관심의 기능을 준비합니다. <ol><li> imtool 명령을 사용하면, 자른 될 관심 영역을 탐구하고 명령에 좌표를 제공 벡터 [1 개 Y1 2 배 Y2가]에 해당 &gt;&gt; im3_crop = imcrop (IM3, [1 개 Y1 2 배 Y2), 사각형 영역이 잘릴 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li><li> (관심 특징 걸쳐 2D 영상에 선형 흔적) 각 개체의 다른 카테고리에 대해 구체적인 예를 제공하여 알고리즘을 가르치 인식 / 감독 형상 분류 형상. <ol><li> VLFEAT 29 API가 성공적으로 설치되어 있는지 확인하고보다 깊이있는 문서에 대한 VLFEAT의 웹 사이트를 방문하십시오. </li><li> 명령 줄에서 다음을 입력 &gt;&gt; [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, $ K $ NLEAVES) $ K가 사용하는 클러스터의 수 또는 관찰자에 데이터를 정렬하고 싶은 클래스의 수입니다, 달러 NLEAVES 잎 클러스터의 원하는 번호가 즉입니다 &gt;&gt; [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4100) </li><li> VLFeat의 입력으로 수동으로 분할 기능을 사용합니다. 참고 :이 오픈 소스 C 기반 라이브러리가 데이터 집합에 대해 가장 잘 작동하도록 선택 방법의 종류에 따라 픽셀 패치, 패치 클러스터링 및 클러스터 중심 위치를 수행합니다. 가능한 옵션은 기반 texton하는 K-평균 클러스터링에서부터 30에 접근하고, 출력 특성이 주어진 모범 설명에 기초하여 원하는 수치 배열이다. </li></ol></li></ol></li><li> 분할이 쿵푸를 사용하여에서야 있지만 계산 비용, 자동화, 더 시각화 및 분석을위한 별도의지도로 기록 될 것입니다 동시에 객체의 세그먼트 여러 클래스에 접근. <ol><li> 이전에 생성 된 숫자 배열 (모델)을로드합니다. </li><li> 입력으로 분할 될 모델과 이미지를 사용하여, VLFeat에서지지 벡터 머신 (SVM) 함수를 호출한다. <ol><li> 명령 줄에서 다음을 입력합니다 &gt;&gt; x는 원래 이미지 im2_crop 자른 y는 목표 이미지를 수동으로 분할 된 이미지입니다 = vl_svmtrain (X, Y, 0.1), [B, w]. 클러스터링에 의해 생성 된 레이블에 따라 결과 색상을 &gt;&gt; ISEG = VL_IMSEG (I, 라벨)를 사용합니다. 주 : 모델의 특성들에 기초하여, VLFeat 클래스의 수에 처음부터 할당 (관심 기능) 화상을 분류한다. 원하는 정확도의 수준에 따라, 또는 다른 방법으로 추정 clust 방법이 조합 될 수있다등의 선체 및 클러스터 센터와 같은 어 매개 변수를 설정합니다. SVM 알고리즘의 출력은 확률 모델과 새로운 데이터 세트에 필요한 여러 종류의 이진 마스크​​이다. </li></ol></li><li> &gt;&gt; $ 형식은 &#39;티파니&#39;는 imwrite (메신저, $ 형식, $ 파일 이름)와 $ 파일 이름은 출력 파일의 경로입니다 : 명령을 입력하여 결과를 저장합니다. </li><li> &gt;&gt; imshow (IM) : 이미지를 시각화를 들어, 명령을 입력합니다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+cryo-microscopy+as+a+powerful+structural+tool+in+molecular+medicine.">Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine.</a> J Mol Med (Berl). 78 (4), 191-202 (2000).</li><li>Johnson, M. C., Rudolph, F., Dreaden, T. M., Zhao, G., Barry, B. A., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+two-dimensional+crystallization+trials+of+small+membrane+proteins+for+structural+biology+studies+by+electron+crystallography.">Assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (44), e1846 (2010).</li><li>Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+for+3D+structural+analysis+of+dynamic+interactions.">Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (76), e50386 (2013).</li><li>Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+HIV-1+capsid+assemblies+by+cryo-electron+microscopy+and+iterative+helical+real-space+reconstruction.">Structure of HIV-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (54), e3041 (2011).</li><li>Chen, S., McDowall, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryotomography+of+Bacterial+Cells.">Electron Cryotomography of Bacterial Cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (39), e1943 (2010).</li><li>Meyerson, J. R., White, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (58), e2770 (2011).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+from+cells+to+molecules.">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li><li>Bajaj, C., Yu, Z., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+feature+extraction+and+visualization+of+tomographic+molecular+imaging.">Volumetric feature extraction and visualization of tomographic molecular imaging.</a> J Struct Biol. 144 (1-2), 132-143 (2003).</li><li>Lin, G., Adiga, U., Olson, K., Guzowski, J. F., Barnes, C. A., Roysam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+3D+watershed+algorithm+incorporating+gradient+cues+and+object+models+for+automatic+segmentation+of+nuclei+in+confocal+image+stacks.">A hybrid 3D watershed algorithm incorporating gradient cues and object models for automatic segmentation of nuclei in confocal image stacks.</a> Cytometry A. 56 (1), 23-36 (2003).</li><li>Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+variant+of+the+watershed+transform+for+segmentation+of+electron+density+maps.">A novel three-dimensional variant of the watershed transform for segmentation of electron density maps.</a> Journal of Structural Biology. 138 (1), 123-129 (2002).</li><li>Rigort, A., G&#252;nther, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+segmentation+of+electron+tomograms+for+a+quantitative+description+of+actin+filament+networks.">Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks.</a> Journal of structural biology. 177 (1), 135-144 (2012).</li><li>Cremers, D., Rousson, M., Deriche, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Statistical+Approaches+to+Level+Set+Segmentation.">A Review of Statistical Approaches to Level Set Segmentation.</a> Integrating Color, Texture, Motion and Shape. International Journal of Computer Vision. 72 (2), 195-215 (2007).</li><li>Lin, Z., Davis, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape-based+human+detection+and+segmentation+via+hierarchical+part-template+matching.">Shape-based human detection and segmentation via hierarchical part-template matching.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 32 (4), 604-618 (2010).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Zhang, Q., Bettadapura, R., Bajaj, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+structure+modeling+from+3D+EM+using+VolRover+2.0.">Macromolecular structure modeling from 3D EM using VolRover 2.0.</a> Biopolymers. 97 (9), 709-731 (2012).</li><li>Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+focused+ion+beam+milling+techniques+for+TEM+specimen+preparation.">A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation.</a> Micron. 30 (3), 197-204 (1999).</li><li>Heymann, J. A. W., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> Journal of structural biology. 155 (1), 63-73 (2006).</li><li>Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focussed+ion+beam+milling+and+scanning+electron+microscopy+of+brain+tissue.">Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2588 (2011).</li><li>Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+Ion+Beam+(FIB)+combined+with+SEM+and+TEM:+Advanced+analytical+tools+for+studies+of+chemical+composition,+microstructure+and+crystal+structure+in+geomaterials+on+a+nanometre+scale.">Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale.</a> Chemical Geology. 261 (3-4), 217-229 (2009).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Frangakis, A. S., Hegerl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+reduction+in+electron+tomographic+reconstructions+using+nonlinear+anisotropic+diffusion.">Noise reduction in electron tomographic reconstructions using nonlinear anisotropic diffusion.</a> Journal of structural biology. 135 (3), 239-250 (2001).</li><li>Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+bilateral+denoising+filter+in+biological+electron+microscopy.">Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 144 (1), 114-122 (2003).</li><li>Van der Heide, P., Xu, X. P., Marsh, B. J., Hanein, D., Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+automatic+noise+reduction+of+electron+tomographic+reconstructions+based+on+iterative+median+filtering.">Efficient automatic noise reduction of electron tomographic reconstructions based on iterative median filtering.</a> Journal of structural biology. 158 (2), 196-204 (2007).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>MathWorks. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB. , (2012).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> Systems, Man and Cybernetics, IEEE Transactions on. 9, 62-66 (1979).</li><li>Vedaldi, A., Fulkerson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> VLFeat: An Open and Portable Library of Computer Vision Algorithms. , (2008).</li><li>Zhu, S. C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+Textons?.">What are Textons?.</a> International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).</li><li>Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloride+intracellular+channel+protein+CLIC5+is+expressed+at+high+levels+in+hair+cell+stereocilia+and+is+essential+for+normal+inner+ear+function.">The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).</li><li>Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+diploid+nontumorigenic+human+breast+epithelial+cell+line+isolated+and+propagated+in+chemically+defined+medium.">A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium.</a> In vitro cellular &amp; developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).</li><li>Petersen, O. W., R&#248;nnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Shin, J. B., Krey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+chick+vestibular+hair+bundle.">Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle.</a> Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).</li><li>Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+Surface+Models+of+Tubular+Bacteria+and+Cytoskeleta.">Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta.</a> Journal of Information &amp; Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

3D EM 볼륨에서 관련 기능의 추출을위한 효과적인 전략이 시급히 최근 생물학적 영상을 강타했다 데이터 쓰나미와 유지하기 위해 필요합니다. 데이터가 시간 또는 일에 생성 할 수 있지만, 깊이 3D 볼륨을 분석하기 위해 몇 달이 걸립니다. 따라서, 이미지 분석은 과학적 발견을위한 병목 현상되었음을 분명하다; 이러한 문제에 대한 적절한 해결책없이, 영상의 과학자들은 자신의 성공의 희생자가되고 있습니다. 이는 또한 높은 데이터의 복잡성과 일반적으로 단백질 및 단백질 복합체 테두리 다른 하나와 본질적으로는 계조 농도 구배의 연속적으로 나타나는 생물학적 세포에서 발견되는 거대 분자 군집 부분적이다. 문제는 샘플 준비 및 이미징 결함에 의해 복잡하고, 어떤 경우에는 영상 재구성 유물에서 최고의 완전 자동화 된 접근 방식에 대한 문제를 제기 할 수 있습니다보다 완벽한 체적 데이터에있다에스. 가장 중요하지만, 샘플 준비, 촬상 한 생물학적 해석 전문가 좀처럼 잘 계산 과학에 정통한없고, 따라서 효과적으로 피쳐 추출 및 분석 접근하는 방법에 대한 지침을 요구된다는 사실이다. 따라서, 다양한 실시 예를 사용하여, 프로토콜은 세그먼트에 대한 데이터뿐만 아니라, 수동 추상화 모델 생성, 자동 밀도 계 분할 관심 기능 설명서 추적 및 커스텀 메이드 자동 세그멘테이션을위한 단계를 준비​​하는 방법을 설명한다. 절차에 설명 된 수동 및 자동 방법은 여기에 언급 된 일부 분할 소프트웨어의 많은 다양한에서 발견 될 수 있으나, 다른 유사한 기능을 수행하는 동등하게 적합하다. 결과는 3 차원 분할 방법의 각각의 효과는 데이터 집합의 각각의 서로 다른 유형의 다름을 증명한다. 에도의 서로 다른 접근 방식이 질적으로 생산하지만imilar 3D 렌더링은, 최종 생성물로서, 시간 및 노력의 양이 크게 변화 세그멘테이션 과정 각각에 보냈다. 해당 이미지의 특성과 분할 방식 별 개인 목표에 대한 권장 사항은 추가로 다음과 같은 네 가지 하위 절에 설명되어 그림 5에 요약되어있다. 이러한 기준은도 6의 판정 흐름도에 도시 된 바와 같이도 5 않는다., 여섯 데이터 세트에 적용하고, (6)은 단지 각 데이터 세트에 대한 이론적 근거를 제공하기위한 것으로 각 기준 의사 결정 과정에서 가중 된 방법, 그들은만으로는지도 않고, 시작점을 제공하지 않는다. 의사 결정 과정에 영향을 미치는 너무 많은 기준이 단순히있다 : 다른 사람은 원하는 목적 등의 주관적 기준, 반면 일부는 이러한 데이터 세트 특성과 같은 객관적인 기준입니다. 그것은 높은 레프를 표시하는 데이터 세트 말을하는 것이 안전합니다날카로운 선명한 경계와 대비 엘, 잘 분리하고 (너무 다양하지 않음) 상대적으로 균일하며, 많은 수의 개체에 대한 밀도 모델을 표시하는 목적으로 처리하는 기능을 가지고, 자동화 된 접근 방식이 우수한 것입니다하지 않는 경우 수동 접근법은 단순히 자원 (시간) -prohibitive 것이 사실. 콘트라스트가 낮은 경우, 다른 한편으로, 데이터를 퍼지하며, 따라서, 오브젝트가 혼잡하고, 특징이 높은 다양성을 보여 주며, 따라서 이질적 전문가의 지식을 필요로 한 수동 피쳐 추출 이외의 선택이 없을 수 / 분할. 수동 추상화 된 모델 생성 수동 추상화 된 모델 추적, 선형 요소를 분할 자동으로 (스틱) 연결할 수있는 씨앗 포인트 (공을) 제공에 특히 효과적이다. 이러한 공 및 스틱 - 모델은 길이를 측정 할 매우 강력한 될 수 있습니다차와 같은 모델의 방향과는 질적 검사 및 정량 분석​​을 모두 적절하게 추상화 된 모델을 제공합니다. 분석에 소요되는 리소스를 최소화 할 때 일반적으로 사용되는 수동 추상화 모델 생성은 원래의 데이터의 형태로 절대 정확도보다 더 중요하다. 그것은 관심의 선형 및 균일 한 기능 (예를 들면, 필라멘트, 튜브)를 가장 성공적이다. 데이터 콘트라스트, 선명도 및 혼잡이 한 사람의 눈으로 관심 물체를 인식 할 수있는 바와 같이, 이러한 방법의 성공을 결정하는 중요한 역할을하지 않는다. 때로는 그러한 모델들은 세그먼트 골격 골격 주위 영역의 3 차원 맵으로서 이용 될 수있다. 추상적 모델보다는 정확한 밀도 반사이지만, 그것은 3D 밀도 골격 화 된 버전을 나타내고, 따라서 혼란없이 시각화 및 정성 분석을 허용한다. 이러한 길이 정량적 측정은 또한 근사 모델로부터 결정될 수있다. 용수동 추상화 된 모델 세대 소프트웨어의 예는 온라인 키메라의 자세한 사용 설명서를 참조하시기 바랍니다 <a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html</a> . 관심의 특징 수동 추적 수동 그림판 추적은 거의 모든 데이터 특성과 잘 작동하지만, 그것은 또한있어서 가장 시간이 소요된다. 때때로, 이러한 얇은 뒤얽힌 세포막 등의 기능의 넓은 다양성을 포함하는 복잡한 이미지 집합에서 관심 특징을 추출하기위한 유일한 방법이다. 관심의 기능이 원활하게 변경 될 때 일부 프로그램에서 사용할 수있는 하나의 유용한 도구가 일시적으로 분할 된 조각 사이의 보간 수 있습니다. 데이터가 선명하고 콘트라스트가 높은 매질에있는 경우 수동 추적은 가장 효율적으로 적용 할 수 있지만, 또한 사용될 수있다사용자만큼 더 도전 데이터 세트에 대한 관심의 대상이 익숙하다. 데이터 복잡성은 객체가 밀접하게 포장 복잡하고 혼잡 한 데이터 세트에 개별 개체에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 자동 접근 방식은 종종 세그먼트에 원하는 볼륨 투쟁 너무 많이 또는 너무 적게 추출로 후자의 경우, 수동 분할은 유일한 선택이 될 수 있습니다. 이러한 뒤얽힌 시트 또는 볼륨과 같은 어려운 기능 형태학은,이 방법으로 추출 할 수 있습니다. 관심의 기능의 높은 인구 밀도의 분할은 시간이 금지되면서 관심의 기능의 인구 밀도가 낮은 경우, 사용자는 여러 가지 어려운 특성을 가진 데이터 셋은 분할 될 수 있음을 알아 두셔야합니다. 수동 추적과 소프트웨어의 예를 들어, 온라인 아미라의 상세한 사용자 설명서를 참조하시기 바랍니다 <a href="http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf">http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guid</a>e.pdf. 자동화 된 밀도 기반의 분할 수동 기법과 대조적으로, 자동화 된 접근 방식은 일반적으로 이미지의 큰 스택을 분할 할 때 고려해야 할 중요한 요소이다 덜 시간 소모적이다. 그러나, 단순 임계 값은 정확하지 않을 수 있습니다, 그리고 훨씬 더 많은 시간이 자동으로 분할 된 볼륨의 정제 및 큐 레이션에 지출 할 수있다. 자동화 된 밀도 기반의 분할은 모든 분할을 요구하는 관심의 비슷한 기능의 큰 숫자를 표시하는 데이터 세트에 가장 잘 작동합니다. 데이터가 더 복잡하면, 이러한 자동화 된 기술은 아직 초기 단계로서 사용될 수 있지만, 가능성이 관심 피쳐를 포함하는 서브 볼륨을 지정하기 위해 라인 아래 일부 수동 개입을 필요로한다. 이 전략은 일반적으로 선형 또는 모폴로지 뒤얽힌 볼륨에서 잘 작동하지만, 같은 회선 얇은 시트와 거의 성공세포막. 고 충실도에 대한 보답으로 같은 시간과 같은 몇 가지 사용자 자원을 늘리지 동안 자동화 된 방식으로 사용자 개입을 최소화는 크고 작은 볼륨을 분할 할 수 있습니다. 자동화 된 밀도 기반의 세분화와 소프트웨어의 예를 들어, 온라인 아미라의 자세한 사용 설명서를 참조하시기 바랍니다 <a href="http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf">http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf</a> . 커스텀 메이드 자동 분할 커스텀 메이드 자동 세그멘테이션은 특정 데이터 세트에 대한 알고리즘의 전력 지정을 허용하지만, 종종 기능 특성의 제한에 적합한 데이터 세트 또는 데이터 타입을 특정하며, 쉽게 일반화 될 수 없다. 여기에 전시하는 절차는 유역 침수 및 다른 레벨과 일반 자동 분할 방식과는 다릅니다<html> 이러한 시드 포인트에서 고속 행진 큐브 확장 하였다 임계 시드 포인트의 판정에 의존하는 프로그램 집합 방법. 이 테마의 변형은 그라데이션 벡터 정보 기능 경계를 알리는 경계 분할이다. 대조적으로, 여기에 사용되는 사용자 정의 스크립트는 사용자가 수동으로 몇 가지 예를 추적 훈련 단계에 의존한다. 기계 학습을 통해 특정 알고리즘을 감지하고 독립적으로 지속적으로 추적에있는 속성 및 데이터 특성을 인식하는 방법을 배웁니다. 알고리즘을 재교육 더 예를 포함하여 분할의 정밀도를 향상시킬 수있는 전문 사용자는 기능 기준 큰 집합을 제공하도록 추적. 큐 레이션은 단지 수동 추적 등 노동 집약적으로 할 수있다 전반적으로, 임계 값 및 관련 접근 방식, 또는 커스텀 메이드 방식은, 세포 내 소기관이나 모양의 복잡한 다양성 이미지에서 관심의 단일 기능을 추출 유용하지 않을 수 있습니다. &quot;&gt; 데이터의 선별 및 분할 접근법을 선택을위한 전략 그림 5와 그림 4와 적절한 데이터 세트의 요약에 나와있는 주관적이고 객관적인 기준을 감안할 때, 그림 6에 도시 된 의사 결정 방식은 데이터 세트의 큰 다양한 기능을 추출 전략의 효과적인 평가를 지원할 수 있습니다. 데이터 세트는도 4에 도입 사 각각의 목적뿐만 아니라 사 주관적인 기준 중 어느 하나를 포함 할 수있다 각각의 네 개의 연속적인 결정에 triaged된다. 예로서,도 6는 여섯 데이터 각각의 선별을위한 합리적 세트는 (그림 3). 의심 할 여지없이, 거기에 하나의 고유 한 경로가 아니라 각 데이터 세트에 대한 t을 발생할 수 있습니다 의사 결정을위한 다른 기준 다음이 행렬을 통해 오히려 다른 경로데이터 세그먼트에 대한 동일하거나 상이한 추천 오. 모든 데이터 세트가 예상 할 수없는 속성의 그것의 자신의 세트를 가지고 동안, 여섯 예는 각각 선호하는 기능을 추출 / 분할 방식 뒤에 이론적 근거에 대한 설명과 쌍을, 주어진다. 또한 대부분의 다른 의사 결정 경로는 동일하거나 다른 분할 방법의 사용에 하나 결과는 (그림 6)에 대한 제안을 포함한다. kinocilium 자동화 된 접근 가능성이 성공할 수 있습니다 명확하게 정의 된 경계를 설정 선명 데이터입니다. 관심의 모든 기능은 물론 다시 자동화 된 접근 방식을 선호, 분리된다. 또한, 관심있는 특징은 커​​스텀 메이드 분할 비교적 균질 데이터 세트 이상적으로 서로 유사하다. 마지막으로, 목적은 반자동 방식 호의 전체 피쳐를 추출하는 것이었다. 결과적으로, 그것은 체결 한 것 자동 임계 값 (초록색 라인)뿐만 아니라 맞춤 설계 (예) 감독 세그먼트를 형성 방식 (녹색 점선)은 모두이 데이터 세트에 잘 할 가능성이 높다. 결정 네트워크에서 다른 순서로 배치되지만 유사 기준은, 박테리아의 경우에 적용된다. 이 데이터 세트가 매우 큰 때문에 커스텀 메이드 접근 방식은 부분적으로 추천합니다; 따라서, 한정된 자원은 노동 집약적 인 수동 작업 / 분할 방식을 금지하고 있습니다. 임계 값이 허용되는 결과를 산출 한 것입니다 동안, 주문 제작 방식은 박테리아 사이 또는 오른쪽 옆에있는 세균 중 하나에있는 세포 외 금속 예금에서 둥그스름한 박테리아 모양을 분리하는 연구의 주요 목적을 수행 할 수 있었다, 따라서 커스텀 메이드 방식이 선호되었다. stereocilia 데이터 세트의 경우, 첫 번째 고려 사항은 원하는 목적이었다 목표 전체 농도를 표시 할 수 있습니다또는 기하학적 모델을 만들 수 있습니다. 관심 용적은 혼잡 영역이고, 상기 대물은 세그먼트에 후속 등 것이 도움이되었다 길이, 번호, 거리, 방향을 포함하여 정량적 체적 분석을 실행하기 위해 분리 된 개체와 같은 개체의 다수였다 그 개체 관심은 주로 선형이었고, 이것은 선택의 방법을 추적 기하학적 모델을 만들었다. 그러나, 대신에 목표가 자동 임계 프로토콜을 가능하게 할 선명하게 정의 경계 전체 밀도, 다음 선형 피쳐 형태뿐만 아니라 비교적 높은 콘트라스트를 표시되었을 경우. 세포막과 미토콘드리아 데이터의 경우 인해 기능 형태의 자신의 범주에 자동화 된 접근 방식에 대한 도전 아르 : 뒤얽힌 시트와 볼륨을 각각. 정확하게 목표 셀 또는 미토콘드리아 윤곽을 추적하는 것이지만, 그렇게 할 경우에만 한정된 자원이있다. 인터의 또한, 기능추정은 복잡하며 미토콘드리아 데이터는 아마도 상기 커스터마이즈가인가 될 수있다 박테리아 걸리는 맞춤 스크립팅 접근법 세트이지만, 쉽게 자동으로 검출 또는 모양 부호화 없다. 다행히도, 미토콘드리아 막 자체는 단지 전체 부피의 작은 부분을 나타내고, 따라서, 수동 추적은 시간이 많이 소요되는 방법이라도 간단하다. 콘트라스트가 다소 낮고 경계가 아니라 퍼지 때 수동 추적은 또한 이러한 데이터 세트에 대한 선택의 방법이다. 그들은 데이터 세트의 상당한 부분을 구성하는 경우에도 결과적으로, 이러한 복잡한 시트는 단순히 수동으로 인해 더 나은 대안의 부족으로 추적해야한다. 목표는 세그먼트 조밀 한 간격 및 붐비는 풍경을 구성하는 모든 개체를에 때문에 공장 데이터 세트는 자신의 문제를 제기했다. 밀도를있는 그대로 표시 형상과 물체의 조직,하지만 B에 대한 측정을 가능하게 할여를 수동으로 각 사상 객체가 자동 임계 값 대신에 비용이 너무 많이 사용되었다됩니다 분할. 3 차원 모델을 만드는 다양한 단계 및 대응 결과는 여기에 표시되어 있지만, 더 중요한 것은, 검색된 데이터 및 개인의 특성 기준 세그먼트의 최적 경로가 또한 밝혀져있다 결정하는데 결정적인 것으로. 화상 데이터 자체의 특성이 중요한 반면, 혼잡, 선명도 및 다른 모양 또는 (예 소기관, 필라멘트, 막 등)의 기능의 수로서 여기에 설명 된 것을 포함한다. 주관적 기준 (측정 / 계산, 골격 화 표현 데이터 / 3D 렌더링의 볼륨 표시), 관심있는 기능의 형태 학적 특성 (선형, 연장 된 네트워크, 복잡하고, 복잡한)의 밀도 분할의 원하는 목적을 포함 고려 전체 볼륨 (아르 개체의 분율에 관하여 관심 기능중요한)를 추출 할 필요가 있고, 원래의 데이터의 세그먼트의 충실도에 자원을 늘리지의 장단점 및 자원 할당을 위해 실질적으로 더 높은 증분 개선 결과 투자 수익률 감소를 분산. 영상 분할의 분야는 크게 최근 몇 년 동안 성숙, 아직 특효약, 모든 것을 할 수있는 알고리즘이나 프로그램이 없다. 데이터 세트 크기에 정기적으로 수십 기가 바이트의 수백 메가 바이트에서 성장, 그들은 이제 불가능 가까운 수동 분할을하고, 테라 바이트를 초과하기 시작했다. 따라서, 더 많은 리소스가 인간의 의사 결정 프로세스를 모방 영리한 및 시간 효율적인 피쳐 추출 방법에 투자 할 필요가있다. 이러한 노력은 (Google 어스 유사) 시맨틱 계층 데이터베이스는, (2) 데이터 추상화 기법 (즉, 천이 기반 (1) 지리 정보 시스템 (GIS)과 결합 될 필요컴퓨터 보조 설계 (CAD) 소프트웨어들이 자주 사용되는 바와 같이, (3) 시뮬레이션 기술, 크게 데이터의 양을 감소시키고, 따라서 더 큰 볼륨 (35)의 디스플레이를 가능하게하기 위해 호환 형상 / 체적 표현 복셀) 발 엔지니어링 분야뿐만 아니라 (게임 산업을 위해 개발되는 것과 유사한) 플라이 스루 애니메이션을 포함하여 (4) 고급 애니메이션과 영화 제작 기능. 확실히, 효율적으로 피쳐 추출 및 분할은 다른 데이터 유형에 대해 수행 하였다 셀룰러 고해상도 영상이 오는 회전의 중심에 더 나은 방법이 항상 필요한 반면, 그리고, 원리 여기서 제시뿐만 아니라 어떤 방식의 예를 속인다 , 걸릴 접근하는 결정을하기위한 몇 가지 유용한 정보를 제공 할 것입니다.

전통적으로, 전자 현미경은 (EM) 필드는 1) 높은 초 고해상도 TEM을 사용하여 구조 생물학 분기로 분할되어, 일반적으로 내재적 또는 명시 적 데이터와 고분자 복합체의 3 차원 (3D) 구조를 조사하기 위해 평균화와 결합 정의 된 구성과 일반적으로 상대적으로 작은 크기 1-4, 및 전체 휴대 풍경이 1,5,6를 가시화되는 2) 세포 이미징 지점. 구조 생물학의 지점은 지난 40 년간 극적으로 발전을 겪은 반면, 세포 생물학의 지점은 대부분 종종 덜보다 최적으로 보존 샘플에 두 가지 차원으로 제한했다. 단지 지난 10 년간 전자 단층의 도래와 함께 일반적으로 셀룰러 경관, 따라서 관심의 기능으로서 수행 될 수 평균 제 5,7 차원으로 확장 된 미세 세포 생물학적 이미징을 가지며, 일반적으로 고유하다. 시각화 셀룰러 장면 눈에 종종 충격적 있지만 정확한 단백질 조성물은 일반적으로 알 수 없기 때문에, 관심과 같은 고도로 복잡한 셀룰러 볼륨 후속 정량 분석​​의 기능을 효율적으로 추출 따라서 이들 세포를 해석하기가 어려운하게 부분적 뒤쳐 3D 볼륨. 이 현재까지 광범위한 생물학적 지식은 종종 복잡한 단층 촬영을 해석, 또는 심지어 3D 볼륨에서 중요한 영역과 필수적 구성 요소를 식별하기 위해 필요하다. 또 다른 합병증으로, 3D 볼륨 시각화는 매우 사소하다. 3D 볼륨은 생각 때문에 2D 이미지의 스택으로 시각화 할 수 있습니다. 순차 차원 영상의 각 슬라이스 검사는 복잡성을 감소 시키지만, 이는 또한 제한이 치수로 추출하고, 따라서 정량 분석​​이 있습니다. 그러나, 대부분의 3 차원 오브젝트에 대한 3 차원 볼륨의 묘사는 단순히 연속 평면의 스택은 불완전한 리드특정 시스템의 3D 자연에 D 왜곡 된 관점입니다. 육안 검사의 대체 모드 셀룰러의 자주 밀도 자연 주어진 두 볼륨 렌더링 또는 표면 렌더링을 필요로 볼륨을 - 수 따라서 대화 형 수동 분할이 어려워 쉽게 중첩 된 객체의 방해보기로 이어질 또는 모두 사용자를 압도. 이러한 장벽, 자동화 된 특징 추출의 큰 다양성을 해결하기 위해 (분할) 방식은 일반적으로 density- 또는 그라데이션 기반 8-10 중 아르 개발되었다. 최근의 방법은 관심의 특정 기능을 대상으로 할 수 있지만, 그러나, 이러한 방법은 액틴 필라멘트 (11)로,에 관계없이 지역이나 기능은 전문가에 관심있는의 세그먼트에 전체 볼륨을 경향이있다. 또한, 자동 분할을 실행하는 프로그램은 때때로 예 유역 immersio 적용시 (서브 - 볼륨이 다수 생산 될 수있다종종 관심의 전체 기능을 포함하거나 추가적인 세그멘테이션을하여야 수동으로 다시 병합 될 필요 N 분할). 이 때문에 대부분의 렌더링 컴퓨터 알고리즘은 종종 원하는 분할 볼륨을 생성하는 데 필요한 전문가에 의해에만 충실하여 원하는 기능 및 실질적인 큐 레이션 노력을 추출 할 수없는, 특히 복잡하고 혼잡 한 데이터 세트도 마찬가지입니다. 또한, 매우 구체적인 문제에 대한 맞춤형 솔루션은 종종이 넓은 만들기에 더 중점이 거의 과학적인 회의 종이로 출판 수학, 컴퓨터 과학 및 / 또는 분야의 친밀한 지식이없는 연구자들에게 포괄적 인 도구에 액세스 할 수 있습니다 컴퓨터 그래픽입니다. 이미지 분석 라이브러리의 범위를 포함하는 맞춤형 프로그래밍 소프트웨어 환경, 사용자가 효율적으로 정확한 분할을 위해 자신의 모듈을 작성할 수 있도록 강력한 도구 설정 될 수있다. 그러나,이 접근법은 내선 필요ensive 교육 및 다양한 기능 또는 이미지 분석 기능을 활용하기 위해 컴퓨터 과학에 대한 배경. 하나는 자신의 주변 12,13에서 관심 물체를 분리하는 &quot;템플릿&quot;의 독특한 기하학에 의존 강력한 형상 기반 접근법을 이용하여, 예를 들어 기능이 더 드물다 특정 데이터 세트에 대해 그러한 다목적 소프트웨어 환경 내에서 작동 할 . 컴퓨터 그래픽 시각화 패키지 공정 다양한 대화 형 수동 분할 및 모델 구축을 위해 존재한다. 캘리포니아 샌프란시스코 대학 키메라 (14), 콜로라도 IMOD (15)의 대학과 텍사스 대학 오스틴 VolumeRover 16 : 다른 사람이 학문적 기원 아르와 같은 무료로 배포하면서 일부 패키지는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 프로그램이 보유 특성과 기능의 넓은 범위 및 복잡성은 EA에 대한 학습을​​ 가파르게채널. 특정 시각화 프로그램에는 공 및 복잡한 3D 용적의 단순화 된 모델을 생성하기 위해 밀도 맵에 배치 될 수있는 다양한 크기의 막대기 같은 단순한 기하학적 모델을 제공한다. 이 모델은 간단한 기하학적 및 체적 측정이 때문에 그냥 &quot;예쁜 그림&quot;을 넘어 수 있습니다. 개체의 그러한 설명서 추적 물체의 작은 번호를 추적 및 추출 할 필요가 볼륨에 대해 잘 작동한다. 그러나, 사용하는 대용량 차원 미세 화상의 최근 발전은 어느 집속 이온빔 스캐닝 전자 현미경 (FIB-SEM)을 17-20 또는 직렬 블록면을 주 사형 전자 현미경 (SBF-SEM)은 21은 3 차원 데이터의 크기가 추가적인 합병증을 제시 세트는 수십 기가 바이트와 기가 바이트의 수백, 심지어 테라 바이트에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 따라서, 그러한 큰 3D 볼륨 서, 피쳐 추출 사실상 액세스 할 수없는, 따라서 효율적인 사용자 유도 반자동 묘기우레 추출은 가까운 미래에 3D 볼륨의 효율적인 분석을위한 병목 현상 중 하나가 될 것입니다. 일상적으로 생물 이미지 형식의 넓은 범위에서 사용되는 네 가지 분할 방식이 여기에 표시됩니다. 이러한 방법은 다음 생물 학자들이 자신의 데이터의 효과적인 특징 추출을위한 최적의 분할 접근 될 것인가를 결정하는 데 도움을 참조로 컴파일 있도록 데이터 세트의 서로 다른 유형의 효과에 대해 비교된다. 자세한 사용자 매뉴얼에 설명 된 대부분의 프로그램에 사용할 수있는 바와 같이, 목표는이 특별한 패키지의 한 잠재적 인 사용자가 익숙하게하지 않는 것입니다. 대신, 목표는 다양한 특성을 가진 여섯 예시적인 데이터 세트에 적용함으로써 이러한 상이한 분할 전략의 각각의 장점과 한계를 보여주는 것이다. 이러한 비교를 통해, 일련의 기준은 하나의 대물 화상의 특성을 기반으로 개발되었다예컨대 분할에 대해 원하는 목표 주관적인 고려로부터 데이터 콘트라스트, 선명도, 혼잡, 복잡성, 또는 줄기와 같은 3 차원 데이터 세트는 기능의 모폴로지는의 분율을 의미 관심 특징 인구 밀도, 분단 할 관심의 기능을, 어떻게 일이 진행 최적의 같은 시간과 직원의 가용성 유한 한 자원에 의해 점유 된 볼륨을 설정합니다. 이러한 다양한 예시적인 데이터 집합이 객관적 및 주관적인 기준 데이터 세트를 특정 유형의 특정 피쳐 추출 방법의 페어링을 수득 다양한 조합을 순차적으로 적용 할 수있는 방법을 예시한다. 희망 초보자 도움이 될 것입니다있는 추천은 분할 옵션의 큰 다양성에 직면 자신의 3D 볼륨을위한 가장 효과적인 분할 방법을 선택합니다. 본 연구의 초점은 데이터 수집 및 사전 처리 데이터에 피쳐 추출 주목이지만 효율적인들에 중요egmentation. 종종 시료의 염색 불균일 할 수 있고, 따라서 잠재적 염색 아티팩트 분할 절차에서 고려되어야한다. 그러나, 얼룩은 대개 더 높은 신호 - 대 - 잡음을 제공하고, 따라서 더 적은 필터링 및 잠재적으로 아티팩트가 발생할 수 셀룰러 볼륨의 다른 수학적 처리를 필요로한다. 각각의 원시 화상 데이터 세트는 3 차원 체적으로, 정확한 콘트라스트 및 카메라 화소 설정 취득한 정렬 및 재구성 될 필요가있다. 단층 촬영의 경우, 정렬 된 이미지는 가중 역 투영을 사용하여 통상적으로 재구성되고, 그 데이터 세트는 일반적으로 비선형 이방성 확산 (22), 양자 필터링 (23) 또는 (24)를 필터링 재귀 중앙값으로서 잡음 제거 알고리즘을 받는다. FIB-SEM 및 SBF-SEM 영상 데이터는 같은 ImageJ에 25 XY 활용 프로그램 간 상관 관계를 연속 조각으로 정렬됩니다. 콘트라스트 개선 및 필터링의 기능을 강화하기 위해 적용될 수있다관심 따라서는 화상 스택 잡음보기 해제한다. 필터링 방법은 계산 비용이 많이들 수 있습니다으로 필터링, 선택하거나 선택한 서브 볼륨에 서브 볼륨을하기 전에 전체 볼륨 중 하나를 수행 할 수 있습니다. 데이터가 크게 기대 해상도에 비해 오버 샘플링 된 경우 다운 샘플 때로는 소음 감소 및 / 또는 파일 크기 감소를 위해 사용되는 데이터 (비닝)의 단지 추천합니다. 노이즈 감소 후에, 처리 된 화상은 그 다음 다양한 방법으로 분할 될 수 있으며,이 연구의 초점은 다음의 네 가지에 : 공 - 및 - 스틱 모델을 만드는 과정 (1) 수동 추상화 모델 생성 (2) 수동 추적 프로젝트 특정 세그먼트에 대한 스크립트를 통해 관심, (3) 자동화 된 임계 값 기반 밀도, (4) 커스텀 메이드 자동 분할의 기능. 경계 분할 팔과 몰입 유역 분할 열은 단순 임계 값에 더 나은 대안이 있지만, t는이봐 같은 범주에 속하고,이 토론에 명시 적으로 포함되지 않았다. 밀도 수동 추적 슬라이스 슬라이스하여 각 서브 셀 영역의 원래 농도의 유지를 허용, 관심의 기능을 개략적으로 필요로한다. 이 방법은 세그멘테이션 프로세스의 최대 제어 할 수 있지만 번거롭고 노동 집약적 인 공정이다. 알고리즘은 사용자 정의 된 파라미터들의 세트에 기초하여 픽셀을 선택하는 곳에 자동 임계 값 기반 (그리고 관련) 밀도 세그멘테이션 방법은 반자동이다. 이러한 UCSF 키메라, IMOD, 피지 26 및 VolumeRover 여러 대학 (프리) 시각화 패키지는, 패키지 (유료 라이선스를 필요로) 사용할뿐만 아니라, 상업용, 및 두 가지 유형은 일반적으로 이러한 세그멘테이션 방법 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 여러 가지 방법을 설명하기 위해이 작업에 사용되는 소프트웨어 패키지는 상용 프로그램과 교육 개방의 포함수동 추상적 모델뿐만 아니라, 수동 및 자동 밀도 분할을 생성하기위한 프로그램 ource. 그러나, 오픈 소스 소프트웨어는 종종 사용자 정의의 가능성을 통해 고급 옵션을 제공 할 수 있습니다. 데이터 세트의 다른 종류를 사용하여 이러한 기술의 비교는 우리의 지식에 아직 게시되지 않은 다양한 생물학적 데이터 3D 볼륨의 분할에 접근하는 방법에 대한 다음과 같은 규칙의 발표 및 안내되었다. 따라서,이 제 체계적 다른 접근법을 비교하고 서로 다른 목표와 사용자의 특성을 가진 다양한 데이터 세트에 유용성이있다.

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			<td style="width:151px;">UCSF</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</a></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;"><a name="RANGE!A4">Fiji/ImageJ</a></td>
			<td style="width:151px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:99px;">IMOD</td>
			<td style="width:151px;">Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:99px;">Photoshop</td>
			<td style="width:151px;">Adobe</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.adobe.com/products/%20photoshopfamily.html">http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:99px;">MATLAB</td>
			<td style="width:151px;">MathWorks</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.mathworks.com/">http://www.mathworks.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">VLFeat</td>
			<td>VLFeat</td>
			<td></td>
			<td>http://www.vlfeat.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from voxels to knowledge: a practical guide to the segmentation of complex electron microscopy 3d-data

현대 3 차원 전자 현미경 방식은 최근 이러한 접착 착체뿐만 아니라 고차 구조 등의 골격 등 및 셀룰러 소기관 큰 거대 분자 기계의 시각화를 가능하게, 세포 및 조직의 3 차원 미세 조직으로 전례 통찰력을 허용 할 그들의 각각의 세포 및 조직 콘텍스트. 셀룰러 볼륨의 복잡한 특성을 감안할 때, 먼저 자신의 3 차원 조직의 시각화, 정량화, 따라서 이해를 허용하기 위해 관심있는 특징을 추출하는 데 필수적이다. 각 데이터 세트는 데이터의 고유 특성, 예를 들면, 신호대 잡음비, 선명도 (선명도)에 의해 정의되고, 그것의 기능, 특징, 존재 또는 쉽게 식별 가능 특징 형상의 부재의 혼잡 및 백분율의 이질성 관심의 특정 영역이 차지하는 전체 부피. 이러한 모든 특성은 고려 될 필요결정할 때 분할에 대해 수행하는 접근한다. 세 가지 다른 영상으로 얻을 수 있었다 제시된 여섯 가지 차원 미세 데이터 세트 접근 : 수지 포함 된 스테인드 전자 단층 촬영, 이온 빔 - 직렬 블록 페이스 주사 전자 현미경 (FIB-SEM, SBF-SEM)을 집중 약간 스테인드 무겁게 스테인드 샘플 각각. 이러한 데이터 세트의 경우, 네 개의 다른 분할 방법이 적용되었다 : (1) 완전 수동 모형 구축 (3) 반자동 접근법 따라 표면 렌더링 뒤에 데이터 (2) 수동 추적 세그먼트, 모델의 시각화에 의해서만 이어 표면 렌더링, 또는 표면 렌더링 및 정량 분석​​ 하였다 (4) 자동 맞춤 설계 분할 알고리즘에 의해. 데이터 세트의 특성의 조합에 따라서는 이러한 네 범주 접근법은 일반적으로 하나의 성능을 능가 다른 것을 발견했지만, 기준 정확한 순서에 따라 MO다시 이상의 접근은 성공적 일 수있다. 이들 데이터에 기초하여, 우리는 서로 다른 데이터 세트의 분석을위한 객관적 데이터 세트 특성 및 개인 주관적인 기준을 모두 분류 선별 기법을 제안한다.

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From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

셀룰러 차원 전자 현미경을위한 병목 고도로 복잡한 3D 밀도 맵에서 피쳐 추출 (분할)된다. 우리는 따라서 효율적인 세그멘테이션 대한 시작점을 제공하고, 분할 방식 (수동, 반자동 또는 자동으로)가 상이한 데이터 유형에 가장 적합 관한 지침을 제공하는 기준의 세트를 개발했다.

복셀에서 지식 : 복잡한 전자 현미경 3D-데이터의 분할에 대한 실용 가이드

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.4K 조회수.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  셀룰러 차원 전자 현미경을위한 병목 고도로 복잡한 3D 밀도 맵에서 피쳐 추출 (분할)된다. 우리는 따라서 효율적인 세그멘테이션 대한 시작점을 제공하고, 분할 방식 (수동, 반자동 또는 자동으로)가 상이한 데이터 유형에 가장 적합 관한 지침을 제공하는 기준의 세트를 개발했다. 

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

상관 라이트 / 전자 현미경을위한 저가의 Cryo - 라이트 현미경 스테이지 제작

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

연구

생체공학

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em&gt; 생체</em&gt; 광학 이미징

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

여러 색상과 고속에서 구조화 조명 TIRF 현미경에 가이드

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 추적 하 고 바이러스 성 단백질을 이미징 관련 Cryo 움직일 셀 구조

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

가 여러 명의 병렬 접시 흐름 챔버를 사용 하 여 스트레스에 노출 된 내 피 세포의 유전자 표정 분석

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

높은 경사 구축 가이드 확장 된 시야의 단일 분자 이미징 타일 현미경을 휩 쓸

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

조기 골관절염을 검출하기 위한 원자력 현미경 검사법 적용

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

복셀에서 지식 : 복잡한 전자 현미경 3D-데이터의 분할에 대한 실용 가이드

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