이 프로토콜은 간단하고 견고한 방식으로 소기관을 3D 재구성 할 수 있으며 현재 전문 체적 전자 현미경이없는 실험실에서 액세스 할 수 있습니다. 이 기술은 매우 유연하여 뛰어난 X/Y 해상도를 제공하는 동시에 필요한 경우 샘플을 다시 이미지화할 수 있습니다. 또한 매우 높은 Z 해상도가 필요한 경우 틸트 단층 촬영과 호환됩니다.
이 기술은 소기관 간 맥락에서 소기관 형태학의 심문을 허용합니다. 따라서 소기관 결함이있는 병리학 적 상태를 검사하도록 확장 될 수 있습니다. 이 접근법은 소기관 상호 작용 및 세포 밀매 사건에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
이 방법은 간세포 이외에 다른 조직, 오가노이드 모델 및 세포 배양 시스템에도 적용될 수 있다. 처음 사용하는 사용자는 직렬 단면화를 발견하고 손실없이 도전 할 수 있습니다. 이 프로토콜을 귀중한 샘플에 적용하기 전에 정기적 인 초박형 단면화에 능숙하는 것이 좋습니다.
먼저 트리밍 어댑터에 잠긴 샘플로 면도날을 사용하여 수지 매립 조직을 조심스럽게 트리밍합니다. 척 및 샘플과 함께 표본 방주를 마이크로톰의 표본 암으로 옮기고 표본 방주를 배치하여 방주의 이동 범위가 위에서 아래로 흐르도록 합니다. 다이아몬드 나이프를 나이프 홀더에 넣고 잠그고 칼의 절단 각도가 적절하게 설정되었는지 확인하십시오.
나이프 홀더를 스테이지에 안전하게 잠급니다. 무대 다운 라이팅을 끄고 무대 업라이트를 켜고 조심스럽게 칼을 시편쪽으로 옮기고 블록 면이 나이프의 가장자리에 정렬 될 때까지 관련 손잡이를 조정하여 나이프의 측면 각도, 시편 기울기 및 시편 회전을 지속적으로 조정합니다. 시편 팔의 절단 창의 상단과 하단을 설정하고 시편을 나이프 가장자리 바로 아래에 두십시오.
칼 보트를 깨끗하고 이중 증류수로 채우고 물 표면이 칼의 가장자리와 약간 오목하게 맞는지 확인하십시오. 그런 다음 단면 절단을 시작하십시오. 샘플이 칼의 가장자리를 통과 한 직후에 절단을 중지하십시오.
빈 슬롯 격자를 사용하여 각 그리드에서 수집할 섹션 수를 추정합니다. 각 손의 속눈썹을 사용하여 리본을 슬롯 그리드의 길이에 맞을 수있는 작은 리본으로 부드럽게 나눕니다. 샘플 내에서 상대적 위치를 정신적으로 기록하십시오.
유리 어플리케이터 막대를 사용하여 클로로포름 한 방울을 섹션 위로 가져와 평평하게하십시오. 첫 번째 번호가 매겨진 포셉으로 첫 번째 빈 슬롯 그리드를 집어 들고 Triton X-100에 부드럽게 담근 다음 증류수에 두 번 담그십시오. 여과지를 사용하여 집게의 가장자리에서 과도한 물을 제거하십시오.
포셉을 사용하여 포름바 코팅 슬롯 그리드의 약 2/3을 칼 보트의 물에 부드럽게 내립니다. formvar 측면이 아래를 향하고 슬롯의 긴 오른쪽 가장자리가 물 표면에 있고 물 가장자리와 평행한지 확인하십시오. 물 속의 그리드를 리본 쪽으로 부드럽게 흔들어서 복귀 스트로크 시 섹션이 그리드 쪽으로 드리프트되도록 합니다.
리본의 오른쪽 가장자리가 슬롯의 오른쪽 가장자리와 정렬될 때까지 더 작고 작은 wafts에서 이 작업을 계속합니다. 그런 다음 마지막 waft를 사용하여 그리드를 부드럽게 위로 가져 와서 섹션을 슬롯 그리드로 가져옵니다. 이산화탄소가없는 환경을 제공하기 위해 페트리 접시 뚜껑 아래에 수산화 나트륨 몇 알갱이를 놓습니다.
그런 다음 조심스럽게 레이놀드의 납 시트레이트를 파라 필름에 40 마이크로 리터 떨어 뜨리고 각 그리드마다 한 방울씩 떨어 뜨립니다. 각 그리드를 리드 시트레이트 드롭에 반전시키고 7 ~ 10 분 동안 페트리 접시 뚜껑으로 보호하십시오. 그리드가 염색되는 동안 파라 필름 위의 각 그리드에 대해 약 300 마이크로 리터의 증류수 방울 다섯 개를 놓습니다.
납 시트레이트 인큐베이션이 끝나면 각 그리드를 증류수 방울로 옮겨 그리드에서 직접 호흡하지 않고 1 분 동안 세척하십시오. 이것을 네 번 더 반복하십시오. 번호가 매겨진 크로스오버 포셉을 사용하여 첫 번째 격자를 선택합니다.
그리드의 가장자리를 터치하여 종이를 여과하여 대부분의 물을 윅 제거하고 포셉에서 적어도 20 분 동안 건조시킵니다. 각 격자선에 대해 이 작업을 반복합니다. 낮은 배율에서 직렬 단면의 순서, 위치 및 위치를 관찰하십시오.
그리드에서 계열의 중간 섹션으로 이동합니다. 샘플을 찾아보고 관심 지역을 식별합니다. 이어서, 샘플을 원하는 배율로 관찰한다.
단면이 완벽하게 정렬되지 않는 경우가 많으며 나중에 이미지를 잘라야 할 수 있으므로 시리즈를 약간 낮은 배율로 수집하는 것이 좋습니다. 다음으로, 더 낮은 배율로 참조 이미지를 촬영합니다. 이것은 관심 지역의 맥락을 이해하는 데 도움이 될 것이며, 섹션 경계와 관련하여 다른 배율에서의 거친 위치 및 샘플 내의 랜드 마크 특징입니다.
이를 사용하여 다른 섹션의 관심 영역을 푯말하십시오. 화면 참조의 경우 재사용 가능한 접착제 퍼티, 스티커 또는 화면에 테이프로 붙인 오버헤드 프로젝터 용지를 사용하여 화면에 임시 마커를 배치합니다. 이렇게 하면 데이터 집합 전체에서 이미지 중앙에 있는 관심 영역의 동일한 기능을 일상적으로 다시 상상할 수 있습니다.
이미지 스택을 열고 복셀 측정을 지정한 다음 세그멘테이션 탭을 선택하여 세그멘테이션을 시작합니다. 세그멘테이션 편집기 패널에서 새로 만들기를 클릭하여 재료 목록에서 새 객체를 정의합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 개체의 색상을 변경하고 두 번 클릭하여 개체의 이름을 바꿉니다.
수동 세분화의 경우 재료 목록 아래의 세그멘테이션 도구를 선택하고 기본 브러시 도구를 선택하여 픽셀을 강조 표시합니다. 두 개의 대향하는 간세포의 전자 현미경 이미지가 여기에 표시됩니다. 더 높은 배율 이미징은 나노 미터 해상도로 다른 소기관의 형태 학적 세부 사항을 관찰 할 수있게합니다.
대표적인 이미지는 동일한 단층 촬영의 분절 된 버전, 소포체의 흔적, 미토콘드리아, 및 다른 공간의 ER과 미토콘드리아 사이의 막간 접촉을 보여줍니다. 대표적인 이미지는 세분화 흔적과 전체 미토콘드리온 내의 상대적 위치로 겹쳐진 기울어진 오르토 슬라이스를 보여줍니다. 다른 각도에서 분절된 소기관과 소포체-미토콘드리아 접촉의 3D 재구성이 여기에 도시되어 있다.
이 프로토콜은 매우 높은 Z 분해능이 필요할 때 틸트 단층 촬영과 호환되므로 작거나 복잡한 구조를 해결하는 데 도움이됩니다. 이 기술은 상이한 소기관 사이의 공간적 관계의 초기 평가에 완벽하며, 따라서, 막 항상성에서의 막 접촉의 진행 분야에서 특히 유용하다.
