복잡한 생물학적 샘플에 대한 특정 관심 영역의 3D 초구조 학적 조사가 필요한 모든 생명 과학 프로젝트는이 기술을 활용할 수 있습니다. 샘플 준비 절차는 SBF/SEM 및 FIB-SEM인 두 가지 이미징 양식에 대해 동일합니다. 전자레인지를 사용하면 시료 처리 부품의 속도가 크게 빨라집니다.
루트 팁에 대해 여기에 표시되지만 이 프로토콜은 최소한의 조정으로 모든 생물학적 모델 시스템에 사용할 수 있습니다. SBF/SEM 및 FIB-SEM 의 상호 연관관계를 위해 이 워크플로를 사용하기 전에 개별 기술에 대해 잘 알고 있어야 합니다. 특정 단계의 실행은 쉽게 입증되지만 서면 텍스트로 설명하기는 어렵습니다.
절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 기술자인 피터 보르그레프입니다. 시작하려면, 천 접시에 고정 된 애비도시스 탈리아나 묘목의 루트 팁을 잘라 4 섭씨에서 하룻밤 같은 고정을 포함하는 Eppendorf 튜브에 2 ~ 3 개의 팁을 넣어. 아침에파이펫을 사용하면 튜브의 pH 6.8에서 0.1 개의 어금반 인산염 버퍼로 고정을 교체하고 100 RPM의 회전 테이블에 튜브를 장착하고 10 분 동안 세척하십시오.
그런 다음 신선한 인산염 버퍼를 사용하여 5 번 세척을 반복하십시오. 연기 후드에서 인산염 버퍼를 2% 오스뮴 테트산화물로 교체하고 0.2%루테늄 레드를 pH 6.8의 굴어 인산염 버퍼에 전자레인지에서 뚜껑이 열려 있는 튜브로 교체하여 루트 팁을 수정하고 프로그램을 시작합니다. 그런 다음 튜브에 용액을 버리고 루트 팁을 각각 5 분 동안 이중 증류수로 두 번 씻으십시오.
세 번째와 네 번째 더블 증류 수세척을 위해 전자레인지를 사용하여 세척을 돕습니다. 처음 40초 의 이중 증류 수세 후, 전자레인지에서 루트 팁 샘플을 꺼내 이중 증류수를 신선한 이중 증류수로 대체하십시오. 샘플을 전자레인지에 다시 넣고 프로그램을 계속하십시오.
다음으로, 15 밀리리터 튜브에 이중 증류수 10 밀리리터에 티오카르보히드라지드 0.1 그램을 추가하여 TCH 솔루션을 준비합니다. 튜브를 오븐에 넣고 1시간 동안 60도의 가열하여 용해합니다. 그런 다음 0.22 마이크로미터 주사기 필터를 사용하여 TCH 용액을 필터링합니다.
샘플 튜브의 솔루션을 필터링된 TCH 솔루션으로 즉시 교체하고 프로토콜을 계속 합니다. 이제 샘플을 에탄올에 담그고 전자레인지에 넣고 50%70%90%의 등급단계에 탈수한 다음 100% 에탄올 처리의 두 배에 이를 가열합니다. 프로필렌 산화물 탈수 처리 후, 튜브에 50 %의 Spurr의 수지를 추가하여 최소 2 시간 동안 루트 팁의 침투를 시작합니다.
100% Spurr의 수지에서 최종 인큐베이션 후, 금형을 포함에 루트 팁을 배치하고 신선한 100 % 스퍼의 수지로 금형을 채우고 36 ~ 48 시간 동안 65 섭씨 65도에서 오븐에 중합하십시오. 첫째, 면도날을 사용하여 중합화된 샘플을 얇은 블록으로 대략 다듬습니다. 측면이 노출된 조직을 아래로 향하고 있는 상황에서 전도성 에폭시 수지가 있는 금속 핀의 중앙에 샘플을 부착하여 조직이 금속 핀에 닿도록 합니다.
하룻밤 에폭시를 치료하기 위해 65섭씨65도의 오븐에 샘플을 놓습니다. 아침에는 금속 핀을 캐리어에 넣고 면도날을 사용하여 샘플에서 과도한 에폭시를 제거합니다. 시료의 얼굴을 더욱 부드럽게 하기 위해 초미세토메를 위해 홀더에 금속 핀으로 캐리어를 적재합니다.
초미세토메에서는 유리 나 다이아몬드 나이프를 사용하여 피라미드를 형성하는 블록의 측면의 면을 부드럽게합니다. 적어도 일부 조직이 블록 얼굴에 이미 노출되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 트리밍된 샘플 블록을 스퍼터 코팅에 넣고 2~5나노미터의 플래티넘으로 설정을 조정하여 샘플을 얇은 층으로 코팅합니다.
SBF-SEM 현미경에 담체를 삽입합니다. 다이아몬드 나이프를 샘플 표면에 가까이 가져와 서 샘플의 상부를 잘라 백금 층을 제거하고 조직의 일부를 노출합니다. 그런 다음 가속 전압을 1.5 ~2킬로볼트로 설정합니다.
조직의 이미지를 캡처하고 이미징 실행을 설정합니다. 피지 소프트웨어를 사용하여 파일, 가져오기, 이미지 시퀀스를 선택하고 이미지를 로드할 이미지 스택을 찾습니다. 원고에 따라 이미지를 조정한 후 데이터 집합을 스크롤하여 정렬을 확인합니다.
정렬된 데이터 집합을 3D TIFF 파일로 저장하려면 파일 메뉴 아래에 있는 저장 명령을 사용합니다. 데이터 집합을 신중하게 분석하여 ROI가 포함되는지 확인하고 생물학적 질문에 필요한 정보가 포함되어 있는지 확인합니다. SBF-SEM 현미경의 현재 블록 면인 스택의 마지막 이미지에서 FIB-SEM에 대한 새로운 ROI를 선택합니다.
백금으로 다시 코팅한 후, 샘플을 FIB-SEM에 적재하고 15킬로볼트와 1나노암프에서 이차 전자 검출기를 사용하여 블록 면의 SBF-SEM에서 확인된 ROI를 찾습니다. FIB 빔 및 가스 분사 시스템을 사용하여 시료에 ROI를 일치 지점으로 가져오도록 스테이지를 이동하고 기울입니다. ROI 위의 표면에 백금의 1 마이크로미터 보호 층을 증착합니다.
다음으로, 50~100피코앰프에 이르는 낮은 밀링 전류를 사용하여, 이미징 실행 중 자동 초점 및 3D 추적을 위해 백금 증착에 잔주름을 밀링합니다. 그런 다음 30 나노 암프의 높은 밀링 전류를 사용하여 ROI 앞에 30 마이크로미터의 트렌치를 밀링하여 SEM 빔에 대한 이미징 표면을 만듭니다. 이미지 표면을 부드럽게 한 후 이미징 실행을 시작하고 처음 50 ~ 100 단면도 동안 프로세스의 안정성을 모니터링합니다.
시스템이 원활하게 실행되면 방을 떠나 방에 가능한 한 적은 방해가 있는지 확인하십시오. SBF-SEM의 이미지는 세포 및 세포 내 연결의 공간 방향에 대한 통찰력을 제공하는 조직의 개요를 제공합니다. 새로운 영역에 대한 후속 FIB-SEM 이미징은 특정 세포 및 구조의 고해상도 세부 정보를 추가합니다.
SBF-SEM 데이터는 등위위축성 VOXel FIB-SEM 데이터로부터 비등위축복셀의 상이한 렌더링을 나타낸다. SBF-SEM은 표면에 계단 효과를 제시하는 반면, 5나노미터 섹션이 있는 FIB-SEM 데이터는 렌더링이 훨씬 매끄럽게 나타나고 개별 섹션이 표면으로 완전히 혼합되도록 합니다. 이 프로토콜은 단일 샘플에서 고유 영역의 이미징을 설명하고 워크플로에서 임의의 편차가 샘플에 손상을 입히면 관심 영역을 재배치하는 것이 불가능할 수 있습니다.
