We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Cura&#231;ao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.

참고 : 시약은 산호 샘플의 직렬 블록 얼​​굴 이미징을위한 준비를합니다 1 Preinfiltration 왁스 <ol><li> 유리 비커에 스테아린 조각 3.6 g을 녹여. 핫 플레이트 (60 ~ 70 ° C에서) 잘 섞는다. </li><li> 수단 IV의 400 mg의 추가 (왁스 배경 형광을 최소화하기 위해). 잘 섞어 빨간색 반투명​​ 솔루션이 달성 될 때까지 기다립니다. </li><li> 96 ㎖의 뜨거운 용융 파라핀 (100 %)을 넣고 잘 섞는다. </li></ol> 1.2) 포함] 왁스 <ol><li> 유리 비커에 스테아린 조각 7.2 g을 녹여 뜨거운 접시에 잘 혼합 (60 ~ 70 ° C). </li><li> 수단 IV의 0.8 g을 추가합니다. 잘 섞어 빨간색 반투명​​ 솔루션이 달성 될 때까지 기다립니다. </li><li> 파라핀 과립 (162g)를 추가 파라핀이 완전히 녹을 때까지 섞는다. </li><li> 흰색 과립 Vybar의 30g를 추가하고 같은 비커에 완전히 녹아; 녹인 후, 혼합한다. </li><li> 느슨하게 뚜껑 유리 병을 닫습니다. 60 ° C 대류 오븐에 유리 병을 배치EN은 액상 성분을 유지한다. 이 오븐의 모든 침입을 수행하십시오. </li><li> 100 ㎖의 각의 두 유리 병에 200 ㎖의 빨간색 왁의 전체 볼륨을 분할합니다. 한 침투에 대한 나누어지는 최종 매립에 대한 기타를 사용합니다. </li></ol> 1.3) 직렬 블록 얼​​굴 이미징에 대한 임베딩 산호 조직 <ol><li> 인산염 완충 생리 식염수에 (3 배 5 분) (파라 포름 알데히드 4-5 ° C에서 3-6개월) 산호 분야 (SI 비디오 1)에서 수집 및 저장 폴립을 씻고 준비가 이미지를 만들 때 석회. 24 시간 동안이나 용종의 CaCO3의 완전히없는만큼 때까지 ExCal 솔루션의 폴립을 석회. 샘플을 탈수 1X 크실렌 대체 한 후, 25, 50, 75, 및 100 % 에탄올 시리즈에서 단일 블록으로 여러 탈회 산호 폴립 부화. </li><li> 100 % 자일 렌의 대체를 포함하는 예열 65 ° C의 오븐에서 처리 된 용종을 놓습니다. 창이에 의해 두 번 30 분 동안 품어신선한 용액에 겨. 폴립의 상부면 아래 및 상부 표면은 가능한 평탄한되는 방식으로 용종의 방향. </li><li> 1, 1 : 1 및 1 : 2의 용액을 2 크실렌 대체물 및 50 ㎖의 팔콘 튜브에서 preinfiltration 왁스 (단계 1.1). </li><li> 30 ~ 60 분마다 100 %의 preinfiltration 왁스의 3 배 인큐베이션 preinfiltration 왁스의 세 가지 농도를 증가, 산호 폴립을 품어. </li><li> 주의 : 샘플의 두께에 따라, 단계 1.3.1-1.3.5 장기간에 따라 증가 될 수있다. </li><li> 왁스를 포함하는 샘플을 이동 100 % preinfiltration 왁스의 3 배 배양 후에 (단계 1.2.6 참조). </li><li> 30 분 후 삽입 왁스를 제거합니다. 신선한 삽입 왁스로 교체하고 65 ° C에서 4 시간의 최소 배양을 계속합니다. </li></ol> 1.4) 레드 왁스에 포함하기 <ol><li> 블록 (흰색 왁스 배치와 상단에있는 스테인리스 스틸 트레이를 촬영하는의 샘를 들어)이 배치된다. 일단 왁스에 매립하기 때문에 필요한 샘플의 위치는 매립 붉은 왁스가 불투명으로 보이지 않게된다. </li><li> 새로운 예열 된 스테인레스 스틸 삽입 금형 주위에 고 융점 왁스의 작은 방울을 넣고 식 힙니다. 단계 1.2.6에서 언급 한 바와 같이 제 2 용기에서 갓 녹은 내장 왁스의 작은 볼륨을 붓는다. </li><li> 흰색 왁스 점 이상 빠르게 아래로 향하게 산호 폴립의 위치를​​ 다음 스테인리스 쟁반에 플라스틱 샘플 홀더를 배치하고 왁스는 플라스틱 금형의 표면까지 오도록 더 삽입 왁스를 붓는다. </li><li> 65 ° C의 오븐에서 전체 설치를 타고 왁스가 완전히 경화 될 때까지 벤치 또는 차가운 표면에 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 이것은 하루 이틀에 6 시간 최대 걸릴 수 있습니다. 장기 저장을 위해 빛으로부터 보호 4 ° C에서 냉장고에 건조 된 블록을, 놓습니다. </li></ol> 1.5) 직렬 블록 얼​​굴 설정에서 단면 <ol><li> TR블록 메신저 및 마이크로톰을 사용하여 1 μm의 섹션을 잘라. 그들은 분말처럼 될 것 같은 부분을 수집하지 마십시오. 우리는 단지 블록의 얼굴을 이미지화하는 것을 잊지 마십시오. 흰색 왁스가 사라지기 시작할 때 샘플이 나타납니다. </li><li> 샘플보기 부분이 제거 될 때마다 블록이 포함 매끄러운면의 이미지를 캡처. 산호 폴립은 SI 비디오 2에서 사라질 때까지 계속합니다. </li><li> 녹화 / 색소 / 산호 폴립의 자동 형광을 데리러 FITC 형광 필터를 사용하여 흑백 카메라로 이미지를 캡처합니다. 이미지 각 종에서 3-4 탈회 코어. </li></ol> 2 이미징 산호에서 두 개의 광자 형광 현미경 <ol><li> 즉시 물에서 수확 각 컬렉션 (바다 해안)의 사이트에서 4 % 파라 포름 알데히드에 직경 인치에 대해 약 10 ~ 12 폴립을 포함, 산호 폴립 코어를 수정합니다. </li><li> 영상까지 4 ° C에서 샘플을 보관하십시오. 세탁 코어는 일에 배치됩니다거꾸로 커버 유리 바닥 접시에 전자 같은 용액 (0.17 mm 두께). </li><li> 10 배 (0.3 NA) 목표를 사용하여 780 nm의 여기, 이미지 두 개의 서로 다른 배율 (디지털 줌)에서 3-4 폴립에서 두 광자 레이저를 사용. 산호 폴립 형상과 높이도 촬상 대물의 작동 거리에 의해 제한되는 샘플 (보통 1~2밀리미터) 및 촬상 깊이 사이에서 변한다. </li><li> 주위 5,000-10,000 이미지를 총, 10, 20 μm의 간격으로 z 축 통해 XY의 초점면 당 이미지와 50 ~ 100 이미지를 약 25 ~ 100 (5 × 5, 10 × 10 타일)를 수집하기 위해 타일 스캔 모드를 사용 / 산호 폴립. </li><li> 네 용종 지역 이미지 셋은 코어와 산호 종을 나타냅니다. 참고 : 이미지 획득 시간은 2-5 시간 / 용종 지역마다 다릅니다. </li><li> LSM 5는 3D 이미지 분석 및 렌더링 소프트웨어에서 3D 렌더링으로 시스템의 하드 디스크에 원시 데이터 형식으로 모든 이미지를 저장합니다. </li></ol> 3 차원 볼륨 렌더링과 VisualizatioSBFI의 n 및 두 개의 광자 형광 스펙트럼 데이터 <ol><li> 프로그램 사각형 자르기 도구를 사용하여 하나의 용종에 포커스함으로써 파일 크기를 줄이고 컴파일 단일 TIFF 파일로 수집 소프트웨어 (8 비트 형식으로 파일을 저장하여도 파일 크기를 감소)하는 2D 데이터 자르기. </li><li> Imaris 볼륨 알고리즘에 따라 모듈을 능가 프로그램에 SBFI 데이터의 조립 파일 (1.5.1 단계에서 수집) 또는 (2.1.4 단계에서 수집 된) 두 광자 광학 부분의 타일 여러 Z-스택을 엽니 다. </li><li> 그림자 투영을 사용하여 3D 렌더링 SBFI 데이터를 전망이다. 복셀은 고체 표면 패턴 (SI 비디오 3)을 만들 역치 아르있는 isosurface 모드를 만듭니다. </li><li> 산호의 3 차원 구조와 형태를 나타 내기 위해 XZ, XY에서 클리핑면 알고리즘을 사용하여 3D 돌기, 그리고 YZ 직교 모드를 시각화. </li><li> Imaris 동일한 프로그램 키 프레임 애니메이션 모듈을 사용하여 돌기에 애니메이션 (SI 바이DEOS 3-7). </li><li> 5 % 압축에서 비디오 파일을 생성하고 볼륨을 사용하여 AVI 형식의 동영상 클립을 생성 (SI 동영상 4 및 6), 3D 및있는 isosurface 양식 (SI 동영상 5, 7). </li></ol>

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The authors declare no conflict of interests.

산호초 연구는 해양 환경에서 작동을 동시에 물리적, 화학적 분석, 생물학적 현상을 포함하는, 고도의 학제 적 연구 노력이다. 복잡한 산호초 생태계의 연구는 따라서 최선의 상황에 맞는 프레임 워크 (그림 10) &#39;10의 멱수&#39;내에 완료됩니다. 이 그래픽 편집 산호 생태계 차원 공간의 넓은 범위 (10 -9 10 5m)를 다루고 있음을 보여줍니다. 또한,이 운동은 geobiological 필?...

지구 온난화 및 첨부 환경의 변화는 직접적으로 열대 해양 산호 1-4의 건강 및 유통에 영향을 미치는됩니다. 여러 영향 산호 표백 및 전염병 5-6의 출현을 포함하여 관찰되고있다. 그러나 이러한 환경 적 위협에 대한 미래 산호 응답의보다 정확한 예측은 조직 학적 &quot;베이스 라인&quot; &quot;건강 해 보이는&quot;산호에 대한 조직의 형태 및 세포 구성과 분포를 정의하는 설립하는 것이 필요합니다. 차례로, 산호가 다음 정량적으로 비교 될 수있다 &quot;영향&quot;. &quot;정상 응답이&quot;또한 환경에 걸쳐 구배 계측 할 수 있도록 또한,이 기준선은, 다양한 환​​경 조건 하에서 외관상 건강한 산호 대해 확립되어야한다. 이 기준선을 설정 향한 초기 단계로서, 고해상도 3D 연구는 어떻게 외관상 건강한 산호 폴립 조직 수행되었다형태와 세포 조성물은 햇빛 조사량에서 수심의 증가 (WD) 및 첨부 감소에 응답합니다. 결과는 다음 산호 적응 기작보다 포괄적 이해를 설정할뿐만 아니라, 산호 공생 진화 통찰력과 광 수확의 향상을 얻기 위해 이용 될 수있다. 스토니 산호 (Scleractinia)는 공동으로 산호 7-10 holobiont이라 다른 미생물의 복잡한 조립, 호스트를 재생 식민지 해양 무척추 동물이다. 본 연구에서 수행 연구는 동시에 조직 색소의 증가 수심 분명히 건강한 호스트 산호의 공생 주산 셀러와 변경 사항을 추적하기 위해 최첨단 영상 기술의 제품군을 사용하고자한다. 이 산호 난방의 지표로 분명히 건강한 산호와 행위에 대해 수심 그라데이션을 통해 필요한 비교 조직 셀 &quot;기준&quot;을 설정합니다LTH 10. 산호 안료라는 색소가 흡수, 반영, 산란, 굴절, 회절, 또는 다른 사건 태양 복사 11을 방해하는 역할을합니다. 주산 셀러 - chromatophore endosymbiotic 관계는 산호 동물 (12)에 대해 전략적으로 유리한 빛 수확 최적화 및 골격 성장 전략의 공진화뿐만 아니라 영양 소성 (시프트 공급 전략 autotrophy가 heterotrophy까지 앞뒤로)를 사용할 수있다. 쿠라 카오 남부 카리브해 섬 국가 (네덜란드 령 앤 틸리 스의 이전 부분) 아루바 라 Blanquilla 열도 (그림 1A)를 동향 동서 내에서 약 65km 북쪽 베네수엘라있다. 쿠라 카오 70km 긴 남쪽 해안은 현대 지속적이고 중신 - 플라이오세 - 플라이 스토 홀로 세 고대의 언저리 산호초 기관 13, 14이 포함되어 있습니다. 큐라는 약 3 ° C 형을 변화에 연간 SST 평균nually, 27.5 ± 0.5 ºC의 연간 평균 온도, 9 월 초에 29 ° C의 최대 월 말에서 26 ° C의 최소에 이르기까지 (NOAA SST 데이터 것은 2000년부터 2010년까지 설정합니다). 이전에 잘 공부 되었기 때문에 큐라 (그림 1A)의 북서쪽 끝에 근처에 누워 야 Kalki에서 산호초 (12 ° 22&#39;31.63 &quot;N, 69 ° 09&#39;29.62&quot;W)는, 샘플링에 선정되었다 이 위치에서 해양 생태계 신선한 nonpolluted 해수 7,15-19에서 목욕을합니다. . 두 밀접하게 관련 scleractinian 산호 종, M.의 annularis 및 M faveolata,이 연구에서 실험과 분석을 위해 선택되었다 각 종 때문에 (1) 선반 휴식과에 대한 암초 기관에 전시 분명히 다른과 겹치지 않는 수심 분포 관련 탄산염 퇴적 퇴적 환경 (M.의 annularis 범위 = 0-10미터 WD, M.의 faveolata범위 = 10~20m WD 20,도 1B, 2A 및 2B); (2) 카리브해 (21)에 걸쳐 공통의 산호초 프레임 워크 빌더입니다; (3) 잘 연구 된 생태 학적, 생리 학적, 진화 관계 (22)이있다. 본 연구를위한 필드를 샘플링은 해외 쿠라에 플라 야 Kalki의 표준 스쿠버 다이빙 기술을 사용하여 실시 하였다. 얕은 - 투 - 심해 해저 지형의 횡단면은 선반 휴식을 통해, 선반 가로 질러 그 설립하고, 깊은 물 이물 암초 환경으로 하였다. (1) 세 개인 M.의 ~ 1m 직경 산호 머리 : 분명히 건강한 산호 헤드는 다음을 포함하여이 수심 횡단면을 따라 샘플링 확인되었다 5m 수심 (WD)에 있었다 모두 annularis; M.의 (2) 개별 세 ~ 1m 직경 산호 머리 faveolata는 모두 12m WD에 있었다. 광합성 활성 복사 (PAR)는 33-36% P로 측정 하였다5m WD에서 AR과 10m WD에서 18-22%의 PAR. SST는 5m와 12m 모두의 수심에서 26 ° C를 때 샘플링 년 1 월에 실시했다. 이 여섯 산호 헤드의 각 (즉,. 육 반구형 산호 머리에 각각 약 45 ° N 위도) 동일한 공간 위치에 세중 샘플링했다. 각각의 샘플은 청소 아치 펀치 수집 2.5 cm 직경 산호 조직의 골격 코어 생검으로 구성되었다. 세 산호 조직의 골격 조직 검사가 산호 머리에서 각각 장갑을 낀 손으로 표준 SCUBA에서 샘플링되었다 (M. 9은 5m WD에서 식민지를 annularis 및 M.에서 9 12m WD에서 faveolata). 즉시 깊이에서 수령시, 각 조직 검사 코어 시료를 멸균 50 ㎖의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 넣고, 나사 정상은 밀봉하고, 표면에 돌아왔다. 해수 각 원심 관으로부터 경사 분리하고, 각 코어 생검 후, 침지 저장, 4 % 파라 포름 알데히드로 이송 하였다. 23-30와 동물 샘플의 여러 유형을 포함하여 생물학적 시료의 넓은 범위에서 수행되었다. 형광 또는 시야 기법 중 하나와 광학 / 광학 현미경을 이용 이러한 연구의 대부분. 그러나, 연구는 지난 31 년 사형 전자 시리얼 블록 얼굴 영상을 사용하여 초고 배율에서 수행되고있다. 본 연구에서, 변성 SBFI 프로토콜이 개발되었으며 처음 산호인가. M. 때문에 annularis와 M. faveolata 산호 폴립은 두께 1-2mm 아르, 루틴 광학 현미경 기술 중 어느 것도 산호 폴립 조직의 전체 두께를 관통 할 수 없을 것입니다. 따라서, 우리는 특히 산호 샘플을 위해 설계 SBFI 샘플 준비 프로토콜을 가지고있다. 또, 정의 실체 홀더를 설계했다x와 y 방향 모두에서 동력 이동된다. 이 장치는 오히려 현미경 앞의 정규 마이크로톰을 사용하는 섹션을 수집하는 것보다 샘플 블록 얼​​굴의 화상을 얻어. 우리는 또한 산호 조직의 전체 두께에 걸쳐 이미지에 동일한 산호 폴립을 다른 비선형 광학 두 광자 현미경 기술을 소개했다. 이것은 탈회 측면과 시료 전처리 (탈수) 및 프로세싱 프로토콜에 의해 유도 될 수있다 조직 형태학 및 볼륨 (수축)의 변화의 가능성에 의해 부과 SBFI 한계를 극복한다. 또한, 산호에서 배출 프로파일은 스펙트럼 색소와 광합성 주산 셀러 사이에 절정 배출과 변화를 확인하기로 결심 하였다. 이러한 결과는 사용 된 방법의 컨텍스트 및 수집 시간에 관한 개별 장점, 분석 시간, 및 STR을 손상시키지 않고 미세 구조적 세부 사항을 해결하는 능력으로 평가 하였다산호 조직의 uctural 무결성.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coral Tissue Skeleton</td>
			<td>None</td>
			<td>None</td>
			<td>2.5 cm Biopsy from natural habitat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arch Punch Coring Device</td>
			<td>C.S. Osborne and Company</td>
			<td>No. 149</td>
			<td>For Coral biopsy collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15700</td>
			<td>16% Pre-diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear/Safeclear II</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 64111-04</td>
			<td>Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene and Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Richard Allen Scientific</td>
			<td>Type H REF 8338</td>
			<td>Infiltration solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybar</td>
			<td>The Candle Maker</td>
			<td>None</td>
			<td>Component of Red Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stearin</td>
			<td>The Candle Maker</td>
			<td>None</td>
			<td>Component of Red Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S667-25</td>
			<td>Red Wax-Opaque background</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin (WGA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>W32466</td>
			<td>For labeling&#160; Coral Mucus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36095</td>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD-35-100</td>
			<td>For two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Motor, Driver and Controller</td>
			<td>Lin Engineering</td>
			<td>211-13-01R0, R325, R256-RO</td>
			<td>XY Translational Movement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>DC-220</td>
			<td>Melting all wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convection Oven</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>DX-600</td>
			<td>Infiltration and Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ASP 300</td>
			<td>Dehydration, Infiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2055</td>
			<td>Disposable knifes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stereolumar V 12</td>
			<td>1.5x (30 mm WD) Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope with ApoTome</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axiovert M 200, ApoTome I System</td>
			<td>Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiocam camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>MRm</td>
			<td>Monochrome camera 1388x1040 pixels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Version 4.8</td>
			<td>Image acquisition program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Photon Laser</td>
			<td>Spectraphysics</td>
			<td>Maitai eHP, pulsed laser (70 fs)</td>
			<td>With DeepSee module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 710 with Spectral Detector</td>
			<td>34 channel PMT detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>2010 or above</td>
			<td>for two-photon and spectral image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Suite Software</td>
			<td>Bitplane, Inc.,</td>
			<td>Version 7.0 or above</td>
			<td>3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal optical microscopy methods reveal polyp tissue morphology and structure in caribbean reef building corals

이미징 기술의 통합 스위트 카리브해 암초 건물 산호 Montastraea의 annularis 및 M. 이루어지는 3 차원 (3D) 형태학 및 용종 조직의 세포 구조를 결정하기 위해 적용되어왔다 faveolata. 이러한 접근은 형광 현미경 (FM), 시리얼 블록 얼​​굴 영상 (SBFI), 및 2 광자 공 초점 레이저 주사 현미경 (TPLSM)를 포함한다. SBFI 물리적 절편 후 깊은 조직 이미징을 제공한다; 그것은 이상 2mm의 조직 깊이에 조직 표면의 질감과 3D 시각화에 대해 자세히 설명합니다. 조직 세포 구조의 보완 FM 및 TPLSM 수율은 매우 높은 해상도의 이미지. 결과가있다 : (1) 외부 개별 산호 폴립의 벽에 이전에보고되지 않은 lobate 조직 형태학을 확인 (2) 색소, 조류와 같은 dinoflagellate의 주산 셀러의 endosymbionts의 3 차원 분포와 조직 밀도의 제 1면지도를 만들었습니다. 스펙트럼 흡수 완두콩500 nm 내지 675 nm 인 KS는 각각 제안 M. annularis와 M. faveolata 엽록소와 색소의 유사한 유형을 포함. 그러나, M. annularis와 M. 조직 밀도와 이러한 주요 세포 구성 요소의 3 차원 분포의 유의 한 차이를 나타내지 faveolata. 이미징 방법에 초점을 맞춘이 연구는 SBFI이 탈회 산호 조직의 큰 mm 크기의 샘플의 분석에 매우 유용 있음을 나타냅니다. 무료 FM 및 TPLSM는 nondecalcified 산호 조직 샘플에서 세포의 분포와 밀도의 미묘한 서브 밀리미터 규모의 변화를 알 수있다. TPLSM 기법 수득한다 : (1) 최소 침습 샘플 준비, (2) 우수한 광 단면 처리 능력, (3) 최소의 광 흡수 및 산란, 여전히 깊은 티슈 이미징을 허용하면서.

(본 연구를 위해 특별히 제조 된 그림 3) 사용자 정의 설계 SBFI 장치는 M.의 외부 표면의 질감과 형태의 첫번째 상세한 3D 디지털 고도지도 (DEM을)를 생산 annularis와 M. faveolature 산호 폴립 (그림 4 및 SI 동영상 1-2). 이것은 각각의 동심 폴립 (도 4B, 4D 및 4E)의 중심으로부터 외측 방사 산호 조직되지 않았던 이전 누적 로브 이미지를 수득 하...

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Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

영상 기술의 통합 제품군은 카리브해 산호 Montastraea의 annularis와 M.에서 용종의 형태와 조직 구조를 결정하기 위해 적용되었습니다 faveolata. 형광, 직렬 블록 얼​​굴, 및이 광자 공 초점 레이저 주사 현미경 lobate 구조 용종 벽 및 예상 chromatophore 및 주산 셀러 밀도 및 분포를 확인했다.

복합 광학 현미경 방법 카리브 암초 건물 산호의 폴립 조직 형태와 구조를 밝히기

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

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Research

JoVE Journal

Environment

12.2K 조회수.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  영상 기술의 통합 제품군은 카리브해 산호 Montastraea의 annularis와 M.에서 용종의 형태와 조직 구조를 결정하기 위해 적용되었습니다 faveolata. 형광, 직렬 블록 얼​​굴, 및이 광자 공 초점 레이저 주사 현미경 lobate 구조 용종 벽 및 예상 chromatophore 및 주산 셀러 밀도 및 분포를 확인했다. 

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Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of natural proteins have a molecular mass between 40 - 200 kDa1,2, a robust and high-throughput method with a nanometer resolution capability is needed. Negative staining (NS) electron microscopy (EM) is an easy, rapid, and qualitative approach which has frequently been used in research laboratories to examine protein structure and protein-protein interactions. Unfortunately, conventional NS protocols often generate structural artifacts on proteins, especially with lipoproteins that usually form presenting rouleaux artifacts. By using images of lipoproteins from cryo-electron microscopy (cryo-EM) as a standard, the key parameters in NS specimen preparation conditions were recently screened and reported as the optimized NS protocol (OpNS), a modified conventional NS protocol 3 . Artifacts like rouleaux can be greatly limited by OpNS, additionally providing high contrast along with reasonably high&#8208;resolution (near 1 nm) images of small and asymmetric proteins. These high-resolution and high contrast images are even favorable for an individual protein (a single object, no average) 3D reconstruction, such as a 160 kDa antibody, through the method of electron tomography4,5. Moreover, OpNS can be a high&#8208;throughput tool to examine hundreds of samples of small proteins. For example, the previously published mechanism of 53 kDa cholesteryl ester transfer protein (CETP) involved the screening and imaging of hundreds of samples 6. Considering cryo-EM rarely successfully images proteins less than 200 kDa has yet to publish any study involving screening over one hundred sample conditions, it is fair to call OpNS a high-throughput method for studying small proteins. Hopefully the OpNS protocol presented here can be a useful tool to push the boundaries of EM and accelerate EM studies into small protein structure, dynamics and mechanisms.

More than half of proteins are small proteins (molecular mass &#60;200 kDa) that are challenging for both electron microscope imaging and three-dimensional reconstructions. Optimized negative staining is a robust and high-throughput protocol to obtain high contrast and relatively high resolution (~1 nm) images of small asymmetric proteins or complexes under different physiological conditions.

최적화 된 음의 염색 : 전자 현미경으로 작은 비대칭 단백질 구조 검사를위한 높은 처리량 프로토콜

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

연구

환경과학

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Building Double-decker Traps for Early Detection of Emerald Ash Borer

Emerald ash borer (EAB) (Agrilus planipennis Fairmaire), the most destructive forest insect to have invaded North America, has killed hundreds of millions of forest and landscape ash (Fraxinus spp.) trees. Several artificial trap designs to attract and capture EAB beetles have been developed to detect, delineate, and monitor infestations. Double-decker (DD) traps consist of two corrugated plastic prisms, one green and one purple, attached to a 3 m tall polyvinyl chloride (PVC) pipe supported by a t-post. The green prism at the top of the PVC pipe is baited with cis-3-hexenol, a compound produced by ash foliage. Surfaces of both prisms are coated with sticky insect glue to capture adult EAB beetles. Double-decker traps should be placed near ash trees but in open areas, exposed to sun. Double-decker trap construction and placement are presented here, along with a summary of field experiments demonstrating the efficacy of DD traps in capturing EAB beetles. In a recent study in sites with relatively low EAB densities, double-decker traps captured significantly more EAB than green or purple prism traps or green funnel traps, all of which are designed to be suspended from a branch in the canopy of ash trees. A greater percentage of double decker traps were positive, i.e., captured at least one EAB, than the prism traps or funnel traps that were hung in ash tree canopies.

Effective traps to attract and capture the emerald ash borer (EAB) are a key element of detecting and managing this invasive pest. Double-decker traps, placed in full sun near ash trees, incorporate visual and olfactory cues and were more likely to capture EAB than other trap designs in field trials.

에메랄드 색 재 송곳의 조기 발견을 위한 이층 트랩을 구축

Emerald ash borer (EAB) (Agrilus planipennis Fairmaire), the most destructive forest insect to have invaded North America, has killed hundreds of millions ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol for performing in situ juvenile exposure tests within oligotrophic river catchments over one-month and three-month periods. Two methods (in both modifications) are presented to evaluate the juvenile growth and survival rate. The methods and modifications differ in value for the locality bioindication and each has its benefits as well as limitations. The sandy cage method works with a large set of individuals, but only some of the individuals are measured and the results are evaluated in bulk. In the mesh cage method, the individuals are kept and measured separately, but a low individual number is evaluated. The open water exposure modification is relatively easy to apply; it shows the juvenile growth potential of sites and can also be effective for water toxicity testing. The within-bed exposure modification needs a high workload but is closer to the conditions of a natural juvenile environment and it is better for reporting the real suitability of localities. On the other hand, more replications are needed in this modification due to its high-hyporheic environment variability.

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

In situ bioindications enable determination of the suitability of an environment for endangered mussel species. We describe two methods based on the juvenile exposure of freshwater pearl mussels in cages to oligotrophic river habitats. Both methods are implemented in variants for open water and hyporheic water environments.

Bioindication 영 민물 진주 홍합에 현장 노출 방법을 사용 하 여에 대 한 스트림 환경 적합성의 테스트

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular substrates offer key advantages over cell-based aAPC, including precise control of signal presentation parameters and physical properties of the aAPC surface to modulate its interactions with T cells. aAPC constructed from anisotropic particles, particularly ellipsoidal particles, have been shown to be more effective than their spherical counterparts at stimulating T cells due to increased binding and larger surface area available for T cell contact, as well as reduced nonspecific uptake and enhanced pharmacokinetic properties. Despite increased interest in anisotropic particles, even widely accepted methods of generating anisotropic particles such as thin-film stretching can be challenging to implement and use reproducibly.
To this end, we describe a protocol for the rapid, standardized fabrication of biodegradable anisotropic particle-based aAPC with tunable size, shape, and signal presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo, along with methods to characterize their size, morphology, and surface protein content, and to assess their functionality. This approach to fabricating anisotropic aAPC is scalable and reproducible, making it ideal for generating aAPC for &#34;off-the-shelf&#34; immunotherapies.

Here, we present a protocol to quickly and reproducibly generate biologically inspired, biodegradable articifical antigen presenting cells (aAPC) with tunable size, shape, and surface protein presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo.

이방성 고분자 인공 항 원 제시 세포 CD8 + T 세포 활성화의 제조

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm morphogenesis, that is the structural diversification of biofilms during community assembly, represents a remarkable challenge across spatial and temporal scales. Here, we present an automated biofilm imaging system based on optical coherence tomography (OCT). OCT is an emerging imaging technique in biofilm research. However, the amount of data that currently can be acquired and processed hampers the statistical inference of large scale patterns in biofilm morphology. The automated OCT imaging system allows covering large spatial and extended temporal scales of biofilm growth. It combines a commercially available OCT system with a robotic positioning platform and a suite of software solutions to control the positioning of the OCT scanning probe, as well as the acquisition and processing of 3D biofilm imaging datasets. This setup allows the in situ and non-invasive automated&#160;monitoring of biofilm development and may be further developed to couple OCT imaging with macrophotography and microsensor profiling.

Microbial biofilms form complex architectures at interphases and develop into highly scale-dependent spatial patterns. Here, we introduce an experimental system (hard- and software) for the automated acquisition of 3D optical coherence tomography (OCT) datasets. This toolset allows the non-invasive and multi-scale characterization of biofilm morphogenesis in space and time.

대규모 공간 스케일을 통해 생물막 형태 형성을 해명하는 자동화된 3D 광학 일관성 단층 촬영

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm ...

Split Point Analysis and Uncertainty Quantification of Thermal-Optical Organic/Elemental Carbon Measurements

Researchers from myriad fields frequently seek to quantify and classify concentrations of carbonaceous aerosols as organic carbon (OC) or elemental carbon (EC). This is commonly accomplished using thermal-optical OC/EC analyzers (TOAs), which enable measurement via controlled thermal pyrolysis and oxidation under specific temperature protocols and within constrained atmospheres. Several commercial TOAs exist, including a semi-continuous instrument that enables on-line analyses in the field. This instrument employs an in-test calibration procedure that requires relatively frequent calibration. This article details a calibration protocol for this semi-continuous TOA and presents an open-source software tool for data analysis and rigorous Monte Carlo quantification of uncertainties. Notably, the software tool includes novel means to correct for instrument drift and identify and quantify the uncertainty in the OC/EC split point. This is a significant improvement on the uncertainty estimation in the manufacturer&#8217;s software, which ignores split point uncertainty and otherwise uses fixed equations for relative and absolute errors (generally leading to under-estimated uncertainties and often yielding non-physical results as demonstrated in several example data sets). The demonstrated calibration protocol and new software tool enabling accurate quantification of combined uncertainties from calibration, repeatability, and OC/EC split point are shared with the intent of assisting other researchers in achieving better measurements of OC, EC, and total carbon mass in aerosol samples.

This article presents a protocol and software tool for the quantification of uncertainties in the calibration and data analysis of a semi-continuous thermal-optical organic/elemental carbon analyzer.

열 광학 유기/원소 탄소 측정의 분할 점 분석 및 불확실성 정량화

Researchers from myriad fields frequently seek to quantify and classify concentrations of carbonaceous aerosols as organic carbon (OC) or elemental carbon ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

순수 낙엽 스탠드에서 세 가지 뚜렷한 방법을 사용한 잎 영역 지수 추정

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

수생 생태계에서 유기 탄소 흐름의 새로운 경로를 밝히기 위해 추적자로 형광으로 분류 된 박테리아

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, or proteostasis. Caenorhabditis elegans occupies a unique and powerful niche for HSR research because the HSR can be assessed at the molecular, cellular, and organismal levels. Therefore, changes at the molecular level can be visualized at the cellular level and their impacts on physiology can be quantitated at the organismal level. While assays for measuring the HSR are straightforward, variations in the timing, temperature, and methodology described in the literature make it challenging to compare results across studies. Furthermore, these issues act as a barrier for anyone seeking to incorporate HSR analysis into their research. Here, a series of protocols is&#160;presented for measuring induction of the HSR in a robust and reproducible manner with RT-qPCR, fluorescent reporters, and an organismal thermorecovery assay. Additionally, we show that a widely used thermotolerance assay is not dependent on the well-established master regulator of the HSR, HSF-1, and therefore should not be used for HSR research. Finally, variations in these assays found in the literature are discussed and best practices are proposed to help standardize results across the field, ultimately facilitating neurodegenerative disease, aging, and HSR research.

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Here, standardized protocols are presented to assess induction of the heat shock response (HSR) in Caenorhabditis elegans using RT-qPCR at the molecular level, fluorescent reporters at the cellular level, and thermorecovery at the organismal level.

Caenorhabditis elegans의 열 충격 반응 유도를 측정하는 표준화된 방법

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...