우리는 FACS 분석에 대한 기술 지원을위한 오하이오 주립 대학 종합 암 센터의 분석 세포 계측법 핵심 시설, 특히 카트리나 무어, 감사합니다. 또한 우리는 과학적 통찰력 박사 윌리엄 푸와 그의 그룹을 인식하고 있습니다. 이 작품은 NIH HL091878 (JL)과 전국 어린이 병원 심장 센터에 의해 지원되었다.

장비 및 솔루션의 1 준비 <ol><li> 해부 도구를 소독 - 오토 클레이브에 의해 덮여기구 트레이에 - 판막 지역의 해부에 대한 성인의 마음과이 미세 집게를 추출하는 미세 조직 가위. 70 % 에탄올 (EtOH를) 해부하기 전에와 도구를 스프레이. </li><li> 직전에 실험에 대한 모든 솔루션을 준비하고 멸균 0.2 μm의 필터를 통해 전달하여 솔루션을 소독. 사용할 때까지 얼음에 솔루션을 보관하십시오. <ol><li> 무균 해리 버퍼 (15 ㎖의 총 / 샘플). 1.2 ㎖의 콜라게나 제 IV, 300 ㎕의 2.5 % 트립신 및 150 ㎕의 병아리 혈청을 결합합니다. 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)을 15 ml의 볼륨을 만듭니다. </li><li> 무균 정렬 버퍼 (12 ㎖의 총). 25 ㎕의 0.5 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 12 μL의 DNase의 결합 I (의 RNase 무료). HBSS 12 ML에 볼륨 업을 준비한다. </li><li> VEC 문화 미디어. 믹스 내피 촉진제EBM2 미디어의 500 ML에 키트에서 분주 구성 요소를 추가하여 제조업체의 지침 (재료 스프레드 시트를 참조)에 따라 미디어 WTH. </li><li> GFP 부정적인 문화 미디어 (비 내피 세포 미디어). 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / 연쇄상 구균)의 5 ㎖ (1 % 최종 농도)와 50 ML의 FBS (10 % 최종 농도)와 중간 199 1 배 445 ㎖의 혼합. </li></ol></li></ol> 성인 마우스와 E14.5 배아에서 판막 지역의 2 해부 <ul><li> 모든 동물의 절차 승인 및 전국 아동 병원 연구소 IACUC 지침에 따라 수행 하였다. </li><li> 의 Tie2-GFP 마우스는 잭슨 연구소 (주 번호 003658) 14에서 구입하고 FVB / N 배경에 동형 접합체 유전자형으로 유지되었다, 따라서 보장이 Tie2의 양성 내피 세포에서 모든 오프 스프링 명시 GFP. </li><li> FACS 정렬 들어, 하나의 세 일치 부정적인 SAMP를 준비이러한 C57 / BL6으로 GFP를 포함하지 않는 제작은 FACS 분류 할 GFP 게이트 매개 변수를 설정합니다. 참고 :이 프로토콜과 대표적인 결과는 삼, 사 개월 된 성인 마우스 또는 배아 일 (E) 14.5에서 한 쓰레기를 사용을 기반으로합니다. </li></ul><ol><li> 성인 마우스 : CO 2 산소 결핍에 의해 즉시 다음과 같은 희생은 부드럽게 흉강을 열고 심장과 폐를 노출 해부 가위를 사용합니다. 대 혈관에서 그립에게 집게로 마음을 노출 멀리 몸에서 끌어되면. 그대로 폐 조직을 제거하고, 차가운 HBSS의 장소 마음 씻어. 심실를 제거하고 그대로 방실 운하 &#39;링&#39;과 대동맥 영역을 떠나 심방을 당깁니다. &#39;링&#39;을 열고 판막 구조를 노출하는 방실 운하의 측면 아래 하나의 절개를합니다. 부드럽게 집게 멀리 괴롭 히고하여 심근 근위 대동맥 영역을 제거합니다. 핑크 심근 화이트, 조밀 한 조직으로 밸브 전단지를 확인합니다. 부드럽게 DETA방실 밸브에서 건삭 tendinae을 ch가 가능한 나머지 심근의 정도를 제거합니다. 당기거나 vecS에서이 빠질 수 있기 때문에이 과정에서 밸브 전단지를 긁어 할주의하십시오. 1 ㎖의 HBSS를 포함하는 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 손질 판막 영역을 놓고 얼음에 보관하십시오. 참고 : 조심 해부 샘플을 오염시킬 수있는 비 판막 내피 세포를 제거하는 것이 중요합니다. </li><li> 배아 : 교미 플러그가 관찰된다 14.0 일 후 여성 마우스 (교미 플러그 = 0.5 일의 아침)을 제물로 바친다. <ol><li> 즉시 희생을 다음, 자궁 (배아를 포함)를 해부 차가운 HBSS에 씻는다. 자궁에서 개별 배아를 해부하고 각 배아를 둘러싼 배아 난황을 제거합니다. 배아에서 각각 마음을 제거하고 2.1 단계를 따릅니다. (참고 : 부드럽게 마음을 노출하고 제거를 용이하게하는 데 도움이 단지 상부 부속 아래 집게로 배아를 압박.) </li></ol></li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. FACS에 대한 세포 분열 및 준비 <ol><li> 멸균 피펫 팁을 사용하여, 판막 영역을 함유하는 에펜 도르프 튜브에서 제거 HBSS. </li><li> 1 ML의 해리 버퍼와 4 μL의 DNase의의 I.로 교체 </li><li> 7 분 동안 37 ° C에서 튜브를 회전합니다. </li><li> 피펫은 최대 3 번 아래로 한 후 샘플을 15 초 동안 정착 할 수 있습니다. 15 ML 원뿔 튜브에 (해리 세포를 포함) 상층 액을 수집합니다. </li><li> , 콜라게나 반응을 정지 포집 관에 말 혈청 125 μl를 추가합니다. 얼음에 포집 관을 유지합니다. </li><li> 반복 해리 단계 (3.2-3.5) 아홉 번 뜨는 구 분수를 수집합니다. </li><li> 이물질 및 덩어리를 제거하여 단일 세포 현탁액을 보장하는 새로운 포집 관에 70 μm의 나일론 필터로 분획 수집 합격. </li><li> 5 분 펠릿 세포에 400g의 현탁액을 스핀. </li><li> 1 ml의 정렬 버퍼에서 세포 펠렛을 재현 탁하고FACS 때까지 얼음에 보관하십시오. </li></ol> GFP 긍정적 vecS에서 정렬 4 FACS <ol><li> 파편을 제외하고 단일 세포를 캡처 앞으로 및 측면 산란을 위해 게이트를 설정; 이중 차별 게이팅을 사용하여 이중선을 제외 할 수 있습니다. 음성 대조군 샘플을 기록하고의 Tie2-GFP 샘플에서 GFP 양성 세포 집단과 비교하고 정확하게 정의하기 위해, 게이트의 설정을 정의한다. </li><li> FACS로 GFP 양성 세포를 분석하고, 게이트의 설정을 세분화. </li><li> 정렬의 Tie2-GFP의 샘플은 모두 GFP 양성 및 GFP-음성 세포를 수집합니다. 세포를 직접 정렬 정렬 버퍼에 RNA 추출을 위해 사용되는 경우. FACS 후 배양 세포에, 1 ML의 FBS와 1 ㎖의 VEC 미디어를 포함하는 멸균 튜브에 GFP 양성 세포를 수집 한 ML의 FBS와 비 내피 미디어의 1 ㎖에 GFP 음성 세포를 수집합니다. 세포 생존을 향상시키기 위해이 50 % 미디어 / 50 % 혈청 조합을 사용한다. 포스트 FACS 분석까지 얼음에 보관하십시오. </li></ol> 5 포스트 FACS Analysi의 <ol><li> RNA 추출 : <ol><li> 즉시 8 분 동안 1,500 XG에서 FACS, 원심 분리기 GFP 양성 및 음성 세포를 다음과 같습니다. </li><li> 조심스럽게 상층 액 (정렬 버퍼를) 피펫 및 폐기합니다. </li><li> 200 ㎕의 트리 졸에 (펠릿에서 권장 샘플 크기에 표시되지 않은) 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> -80 ° C에서 동결하거나 이전에 우리가 실험실 (15)에 의해 설명 된대로 전체의 mRNA를 분리하기 위해 표준 페놀 - 클로로포름 추출을 시작합니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 Mastermix를 사용하여 cDNA 합성을위한 RNA의 50 ~ 200 NG를 사용합니다. </li><li> 마우스 내피 세포 마커 (CD31, 폰 빌레 브란트 인자 (VWF)), 밸브 간질 세포 마커 (α-평활근 액틴 (α-SMA), Periostin (Postn))에 대한 IDT 개발중인 qPCR에 프로브를 사용하여 정량 PCR 증폭, 심근에 따라 cDNA를 마커 (Mhc6, Mhc7) 및 GAPDH. </li></oL&gt; </li><li> 쥐과 VEC를 배양 : <ol><li> FACS 정렬 및 셀 컬렉션 (단계 4.3), 5 분 동안 300 XG에 원심 분리기 세포 후. </li><li> 조심스럽게 상층 액 (정렬 버퍼 + 미디어)를 오프 피펫 및 폐기합니다. </li><li> VEC 미디어 1 ㎖에 GFP 양성 세포 펠렛을 1 ㎖의 비 - 내피 미디어 GFP 음성 펠렛을 재현 탁. </li><li> 플라스틱 챔버 슬라이드의 잘 하나에 각각의 샘플 플레이트와 합류 할 때까지 성장한다. GFP 음성 세포에 대해 일주에 대한 문화 합류하게하고 GFP 양성 세포에 대한 2 주 이상 (3 샘플, 성인 쥐에서) 합류가 될 수 있습니다. 모든 이일 미디어를 변경합니다. </li></ol></li><li> 면역 형광 염색 : <ol><li> 세포에서 용지를 제거하고 실온에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 고정한다. 인산염 완충 생리 식염수 용액에서 5 분 각 (PBS)에 고정 된 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 5 % 소 혈청 알부민 / 1X PBS에서 슬라이드 블록에서 챔버 우물을 제거합니다. </li><li> 품다(: 1000 또는 α-평활근 액틴 (α-SMA), 1 : 100 CD31, 1) 차 항체를 4 ° C에서 슬라이드 O는 / N. PBS에서 5 분 동안 배를 씻으십시오. </li><li> , 400 PBS에서 슬라이드에 추가하고, 실온에서 1 시간 배양 : 이차 항체 (알렉사 - 플 루어 568 염소 안티 쥐) 일을 희석. 린스 슬라이드는 PBS에서 5 분 동안 3 배. </li><li> Vectashield 함유 DAPI에서 마운트 및 이전보기로 4 ° C에서 1 시간 배양. </li></ol></li></ol>

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여기서는 처음 서술의 Tie2-GFP 마우스에서 배아 및 성인 뮤린 vecS에서의 분리를위한 신규 한 방법. 이 마우스 라인 광범위 내피 세포 집단의 분리를 위해 사용되었지만,이 vecS에서의 선택적 분리를 보여주는 첫 번째보고이다. 때문에 VEC 인구의 취약성, 우리는 배아와 성인 쥐의 심장 판막 긍정적 인 GFP (GFP 및 음수) 세포의 단일 세포 분리를 허용하는 엄격한 프로토콜을 개발했습니다. 의 Tie2-GFP 마우스 (14)로부터 전 배아 또는 기관을 사용하여 출판물에 비해, 우리는 세포의 집단을 분리 선택이 깨지기 내피 세포 집단의 낮은 풍부에 기초 콜라게나 및 절개 단계를 최적화했다. VEC 아이솔레이션는 이전에 제한된 유전 적, 분자 생물학적 도구 큰 동물 모델에서보고되었다. 이러한 도구는 잘 따라서 ABI를 쥐에 설립된다뮤린 vecS에서 격리하는 품 질은 심장 판막의 연구에 사용되는 실험 디자인의 확장 집합을 허용한다. 따라서,이 방법의 중요한 장점은 vecS에서 야생형 마우스와 밸브 질환 및 상해의 모델로부터 시간적으로 분리 될 수 있다는 것이다. 두번째 장점은 절연 vecS에서보다 정확하게 생체의 상황을 반영하는 발현 패턴을 유지, 절개 후에 즉시 분석 할 수 있다는 것이다. 또한,이 분리 프로토콜 번호 팽창 및 시험 관내 환경에 의해 유도 따라서 전위 표현형 변화를 방지 할 수있다 세포 배양 물을 제거하기에 충분하다. 참신하고이 프로토콜의 실험적인 이점에도 불구하고, 우리는 한계가 여전히 존재 함을 인식하고 있습니다. 첫째, 밸브 내 뮤린 VEC 인구의 크기가 매우 작고, 따라서, 여러 타임 드 배아 담가가 유전자 발현 분석을위한 충분한 RNA를 생성하기 위해서 필요한 것이다. 생 동안S가 여러 브리더를 사용 극복 될 수 있고, 그것은 어떤 사후 분리 분석 툴의 적용에 영향을 미칠 수있다. 이 제한은 특히 분자 프로파일 및 기능적 어 세이를 포함 VEC 표현형의 더 철저한 분석을 수행하기 위해 GFP 양성 vecS에서의 합류 문화를 확립하기위한 도전이다. 그러므로 우리는 모든 어려움은 우리의 접근 방식에 의해 극복되고 있음을 인정하지만, 이것은 우리가 극복하기 위해 노력하고 있습니다 관심의 영역입니다. 판막 영역으로부터 분리 vecS에서의 이러한 접근법은 심실 내의 심근 내막 또는 혈관 구조 타이 GFP 이환 비 판막 내피 세포로부터의 오염의 가능성을 소개한다. 지금까지 다른 심장 혈관 내피 세포 집단에서 vecS에서의 분자 차이가 확인되지 않았다. 그러나 Nfatc1 유전자의 인핸서 영역을 파악하고 구체적으로 그렇지 않은 vecS에서 레이블을 보였다심장 (18) 내에서 EMT, 그리고 다른 내피 세포 인구를 받아야. Cre 호텔 모델 (Nfatc1합니다 사이트)를 구할 때, 미래 연구는 오염의 위험을 최소화하기 위해이 라인의 특이성을 활용할 수 있습니다. 비 판막의 Tie2 GFP--양성 세포 이외에, 밸브 전단지 중격 및 벽화 심근 벽의 윤대 영역에 부착 지점 근세포에서 오염 가능성은 항상 존재한다. 여기에 데이터가 표시되지 않음, 우리는 처음에 안티 GFP 및 항 CD31 항체로 코팅 된 복합 구슬을 사용하여 해부 판막 지역에서 vecS에서 격리하기 위해 연구를 시작했다. 이 방법은 내피 세포를 분리하는 성공 동안, 우리는 인접한 비 내피 세포 유형에서 유의 한 세포 덩어리를 경험 때문에 VIC를 심근 세포는 우리의 실험 샘플을 오염. 이 파라미터는 오직 단일 세포 현탁액을 분리하기 위해 설정되어있는 바와 같이 FACS 분석을 이용하여 회피되었습니다s 및 PCR 분석은 심근 특정 유전자의 발현이 제한 (그림 3)에 대한 통제했다 감지한다. 우리의 오염을 최소한으로 간주 될 수 있지만, GFP 및 내피 세포 특이 표면 마커의 선택과 배 향후 피할 수 전위 실험 복잡성 남아있다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 배아 성인 마우스 및이 방법은 RNA 분리 및 GFP 포지티브 및 네거티브 GFP 세포 집단의 세포 배양에 사용할 수있는 방법을 제공하는 실시 예에서 성공적 절연 vecS에서있다. 그러나,이 방법은 이러한 애플리케이션에 한정되지 않고, 분자 및 세포 기능 접근법의 과다에 사용될 수있다. 또한, 상기의 Tie2-GFP 배경은 건강과 질환에서 VEC 개체군의 비교 연구를 허용한다 유전자 마우스 모델과 교배 할 수있다. 이 신규 한 방법의 개발은, 처음으로, 집중 연구를 허용한다밸브 개발 및 유지 보수에 vecS에서의 기여를 검사하고 내피 의존 밸브 질병의 이전에 진가를 인정받지 못한 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.

성숙한 밸브는 심장 밸브 내피 세포 (vecS에서) 하나의 단일 층으로 전문화 된 세포 외 밸브 간질 세포 (VIC를) 산재 매트릭스 (ECM) 및 캡슐화의 세 층 화 층으로 구성되어 있습니다. ECM의 역할은 심장주기 동안 혈역학 힘 상수 변화를 견디도록 필요한 모든 생체 역학적 특성을 제공하는 것이다. 성인 밸브의 밸브 ECM의 회전율 단단히 크게 무부하 및 질병없는 섬유 아세포 등이다 VIC를 의해 통제된다. VIC 인구 이외에, 심장 판막 내피 세포 (vecS에서)은 교두 밸브 (2)의 표면 위에 중단 내피를 형성한다. 밸브 구조와 기능 및 VIC를위한 ECM의 중요성이 미국 및 다른 것들에 의해 설명되었지만, vecS에서의 역할은 덜 잘 알려져있다. 그러나, 이러한 비교적 작은 세포군은 배아에 밸브 형성 중요하며 밸브의 기능 장애로 설명질병. 방실 운하와 유출 기관 지역 내에서 내피 세포의 일부가 중간 엽 변환 (EMT) 및 심 내막 쿠션 1,3로 알려진 형태의 부종에 내피를 받아야 할 때 배아에서 심장 밸브 형성이 시작됩니다. 이러한 구조 내에서 새로 변환 된 중간 엽 세포는 나중에 VIC를로 분화 및 성숙 밸브를 형성한다. EMT가 완료되면, 쿠션 주위 내피 세포, vecS라고 지칭 부상 대 성숙한 밸브를 보호 중단 내피 세포층을 형성한다. 또한, vecS에서의 혈역학 적 환경을 감지하고 ECM은 1,3 항상성 조절하는 기본 VIC를 통신 분자 것으로 나타났다. 병 밸브에서, VEC 단층은 ECM 조직의 비정상적인 변화와 변경 생체 역학 4,5과 관련하여 중단된다. 게다가, 마우스 모델에서 연구 VEC 부전 밸브 (D)의 근본적인 원인임을 시사isease 1,6-9. vecS에서 밸브의 개발, 유지 및 질병에서 중요한 역할을 할 때, 우리가 충분히 미리 필드 및 질병의 메커니즘을 이해하기 위해 그들의 시간적인 표현형을 정의하는 것이 중요하다. 여러 실험실에 의해 이전 작업이 성공적으로 돼지와 네이쳐스 모델 10-12에서 vecS에서 격리하고있다. 이 때문에 밸브의 큰 크기로, 자성 비드와 세포 분리 단일 세포 클론 확장 순수한 11-13 개체군을 생성하는데 효과적이다 포함한 다른 분리 방법의 수에 따라, 보라고 및 / 또는 효소 분해를 통해 절연 부. 그러나, 이러한 모델 인해 높은 비용 이외에 분자 도구의 유용성을 제한하는 돼지 및 양 게놈 불완전한 주석으로 제한 될 수있다. 따라서 분리 한 후 돼지와 네이쳐스 vecS에서의 실험은 제한 될 수 있습니다. 마우스 모델 인해 유전 manipula위한 많은 가능성에 바람직기 및 배아와 성인 분자 도구는하지만, 지금까지 작은 동물 모델에서 더 VEC와 분리되어보고되지 않았다. 이는 현재시켜 항체 기반 격리 방법을 방지 VEC 특정 마커의 고유 한 정체성이 부족 소수 세포 인구를 포함 작은 조직 샘플 작업의 어려움을 가능성이있다. 이 문서에서는, 우리는 배아와 성인 단계에서 쥐 vecS에서 직접 분리하는 새로운 방법을보고합니다. 이 프로토콜은 모든 내피 세포 유형에 GFP를 표현하고 광범위하게 내피 세포 집단 (14)을 연구하는 데 사용 된 Tie2의-GFP 마우스, 활용합니다. 그러나,이 연구는 현재의 신규성은 처음 이들 생쥐, 밸브에서 내피 세포를 분리하기 위해 이용 된 점이다. 밸브 조직 및 FACS 정렬 뒤에 구 효소 digestions 일련의주의 절개함으로써 vecS에서 단리 될 수 있고, 각종 실험 기법을 사용직접 정렬 다음, RNA 추출과 문화를 CLUDING.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>		
<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">A-11077</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:107px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:107px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">2.5% Trypsin</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:107px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:107px;">553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Chick Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16110-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">17104-019</td>
			<td>Prepared according to manufactuer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DNase I, RNase free (10,000 Units)</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:107px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC3156</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">EDTA, 0.5M Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Hoefer</td>
			<td style="width:107px;">03-500-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">EGM2 SingleQuot, Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC-4176</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td style="width:107px;">Hyclone</td>
			<td style="width:107px;">SH3007103IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">230301V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Medium 199 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Paraformaldehyde 16% Solution EM grade</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:107px;">MP-Biomed</td>
			<td style="width:107px;">ICN1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Permanox sterile chamber slide with cover</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:107px;">177429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">PrimeTime Mini qPCR Assay</td>
			<td style="width:107px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:107px;">Acta2 (&#945;SMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:107px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:107px;">4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">SuperScript VILO Mastermix</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">11755050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tie2-GFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">3658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tissue forceps #5 11cm</td>
			<td style="width:107px;">Dumont</td>
			<td style="width:107px;">14096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Trizol</td>
			<td style="width:107px;">Ambion</td>
			<td style="width:107px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">&#945;-SMA anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:107px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine valve endothelial cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

의 Tie2-GFP 세포는 배아 및 성인 심장 판막에 내피 세포 마커와 공동 지역화. 배아 및 성인 쥐에서 vecS에서에서의 Tie2-GFP 발현의 특이성을 확인하기 위해, 면역 형광은 E14.5, 3 개월 된 성인의 Tie2-GFP로부터 제조 조직 절편에서 내피 세포 마커와 공동 지역화, CD31을 결정하기 위해 수행되었다 방법을 사용하여 마우스는 이전에 우리가 실험실 (16)에 의해 출판. 도 1에 도시 된 바와 같이, vecS에서 공동 익스프레스 GFP (도 1 A, B, E, F) 모두 성인에서와 CD31 (C, D, E, F도 1) (도 1 B, D, F) 및 배아 ( 따라서 이후 VEC 분리를위한 우리의 모델을 검증 그림 1 A, C, E) 단계. FACS 분석의 Tie2-GFP 마우스에서 분리 된 배아와 성인 심장 판막에있는 개별의 GFP 양성 및 GFP 음성 세포 집단을 확인했다. 야생 t타 입 C57 / BL6 마우스는 GFP 매개 변수를 설정하는 데 사용하고 Tie2의-GFP 마우스에서 단일 게이트 세포의 약 2 % (그림 2) 배아와 성인 샘플 모두에서 FACS 분석에 의해 GFP 양성 세포에 상당한 농축을 보여줍니다. 도 1에 도시 된 공동 지역화 연구에 기초하여, 이들 세포가 vecS라고 간주하고 61,800 전체 셀의 평균을 산출되는 성인 시료 (N = 3), 및 8928 세포 (8,015- (샘플 39,000-77,000 세포 / 샘플의 범위) 11000 세포 E14.5 배아의 한 쓰레기에서 / 쓰레기). PCR 분석의 Tie2-GFP 마우스에서 분리 된 GFP-음성 세포에서 GFP 양성 세포 및 밸브 간질 세포 마커의 내피 세포 마커의 농축을 확인합니다. qPCR에 다음 FACS에 의해 GFP 양성 및 음성 세포 집단의 유전자 발현 분석은 별개의 분자 프로파일을 보여줍니다. 의 Tie2-GFP의 배아 및 adul에서 분리 된 GFP 부정적인 세포 집단에 비해TS, GFP 양성 세포는 내피 세포 마커 CD31와 VWF (그림 3)의 표현에 충실. 또한, 이들 세포 집단에서 심근 세포 마커 (Myh6, Myh7)의 발현은 비 - 내피 세포의 최소한의 오염을 보여 매우 낮다. 반면, 성인의 Tie2-GFP 마우스 및 E14.5 배아에서 분리 된 GFP 부정적인 세포는 밸브 간질 세포 (VIC) 마커, GFP에 α-SMA 및 Periostin (POSTN) 상대 양성 세포에 농축되어있다. 이러한 마커의 농축으로 인해 성인 VIC를의 대기 표현형 및 활성화 마커 따라서 낮은 표현 성인에 비해 E14.5 샘플에서 분리 GFP 음성 세포에서 더 높다. 의 Tie2-GFP 성인 쥐에서 분리 된 GFP 양성 세포가 시험 관내에서 배양 될 수있다. 성인 샘플로부터 분리 배양 GFP 양성 및 음성 세포에 GFP 능력은베이스를 조사했다세포 형태 및 면역 조직 화학 염색에 라. 이전에 우리는 GFP 양성 세포가 이주 문화 (그림 4C) 후 내피 세포 마커 CD31와 형태 (그림 4A) 라운드 공동 특급 GFP를 나타나는 그림 4에서 보여 우리 (17)에 의해 기술 된 프로토콜을 사용. 반면, 비 내피 세포는 구일 (그림 4D) 후 VIC 마커 α-SMA를 중간 엽 같은 형태 (그림 4B)를 표시하고 표현 GFP 부정적이다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" width="400" /> 도 1의 Tie2-GFP 양성 세포는 태아 및 성인 심장 판막에 CD31와 공동 지역화. 면역 형광은 내피 세포 마커 (Tie2-) GFP 발현의 관계 (A를, B) 보여, CD31 (C, D)에서 의E14.5 (A, C, E)와 성인에서 승모판의 eptal 전단지 (B, D, F) 단계. 밸브 영역이 강조 표시됩니다, C, E. (E, F) 병합 된 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2의 Tie2-GFP 양성 vecS라고는 FACS에 의해 식별 될 수있다. 연령 일치 C57 / BL6 컨트롤 (A, C)에 비해 Tie2의-GFP의 배아 (B)와 성인 (D)에서 격리 밸브가 별개의 GFP-를 포함 녹색으로 표시된 양의 세포 인구. 빨간색으로 표시 GFP 음성 이벤트는, 대조군으로 수집 하였다. (B) 및 (D)의 숫자는 GFP-P의 평균 %로 나타내FACS으로 분류 이벤트의 총 수에서 ositive 세포 (N = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" width="500" /> GFP-음성 세포 밸브 간질 세포와 관련된 유전자를 표현하는 반면 그림 3 GFP 양성 세포는 내피 세포 마커에 충실. 내피 세포 마커 (CD31, 폰 빌레 브란트 인자 (VWF)) 및 성인 (Myh6) 및 태아의 대표 qPCR에 ( Myh7) E14.5 (A) 및 성인 (B 판막의 영역으로부터 격리 GFP 양성 세포에서 심근 세포 마커)의 Tie2-GFP 마우스. 내피 세포 마커와 심근 세포 관련 유전자의 매우 낮은 수준의 참고 농축. (C, D) 차를 접어밸브 간질 세포 마커의 발현 nges α-SMA E14.5 (C)와 성인 (D)의 Tie2-GFP 마우스에서 분리 GFP-음성 세포 및 Postn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig4highres.jpg" width="500" /> 그림 4의 Tie2-GFP 양성 세포는 체외에서 내피 세포 마커의 발현을 유지한다. 다음 FACS, GFP 양성 (A, C)와 (B, D) 대비 영상을 단계적으로 합류 할 때까지 배양 대상이 성인 쥐에서 세포 집단했다을 (A, B) 및 면역 형광 (C, D). GFP 양성 세포가 후 CD31 (적색) (C)을 표현문화의 십일. 반면, GFP의 발현은 α-SMA, 활성화 VIC를 (D)의 마커에 대한 긍정적 인 스테인드 부정적인 세포 인구에서 검출되지 않았다.

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Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

isolation-of-murine-valve-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K 조회수.  The Ohio State University. The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

비디오: Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

인간 제대 베인 내피 세포의 절연 (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

연구

생물학

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

판막병 내피 세포의 분리

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

배아 심실 내피 세포의 분리

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

마우스 관상 내피 세포의 분리

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) play an important role in the calcification process in aortic stenosis through the activation of their dedifferentiation program to osteoblast-like cells. Mouse VICs are a good in vitro tool for the elucidation of the signaling pathways driving the mineralization of the aortic valve cell. The method described herein, successfully used by these authors, explains how to obtain freshly isolated cells. A two-step collagenase procedure was performed with 1 mg/mL and 4.5 mg/mL. The first step is crucial to remove the endothelial cell layer and avoid any contamination. The second collagenase incubation is to facilitate the migration of VICs from the tissue to the plate. In addition, an immunofluorescence staining procedure for the phenotype characterization of the isolated mouse valve cells is discussed. Furthermore, the calcification assay was performed in vitro by using the calcium reagent measurement procedure and alizarin red staining. The use of mouse valve cell primary culture is essential for testing new pharmacological targets to inhibit cell mineralization in vitro.

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

This article describes the isolation of mouse aortic valve cells by a two-step collagenase procedure. Isolated mouse valve cells are important for performing different assays, such as this in vitro calcification assay, and for investigating the molecular pathways leading to aortic valve mineralization.

시험관 내 대동맥 판막의 석회화를 연구하기 위해 마우스 간막판 세포의 격리

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

체외 질병 모델링을 위한 인간 일차 판막 세포의 분리

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...