인간 일차 판막 내피 및 간질 세포의 분리는 석회성 대동맥 판막 질환의 발병기전의 기본 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 판막이 천연 조직에서 절제되면 세포 생존율이 떨어집니다. 그래서 우리는 세포 생존율을 연장시키는 방법을 확인했습니다.
추출된 판막 조직 샘플을 받은 후, 대동맥 뿌리를 추출하고 멸균 헹굼 용액이 들어 있는 50밀리리터의 원추형 튜브에 조직을 잠근다. 로커의 얼음 양동이에서 10 분간 배양 한 후 튜브에 70 % 에탄올을 뿌립니다. 멸균 조직 배양 후드에서 조직을 페트리 접시로 옮기고 두 개의 밸브 전단지를 절제합니다.
극저온 바이알에 하나의 전단지를 넣고 섭씨 영하 80도 보관을 위해 액체 질소에서 조직을 스냅 동결시킵니다. 칼슘 함량 염색을 위해 조직을 고정하려면 두 번째 전단지를 결절에서 경첩까지 반으로 자르고 두 조직 조각을 4 % 파라 포름 알데히드에 잠긴 카세트에 넣습니다. 그런 다음 전체 설정을 실온에서 최소 2시간 이상 4시간 이하로 로커에 놓습니다.
판막 간질 세포를 분리하려면 전단지를 얼음처럼 차가운 PBS가 들어있는 새로운 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 튜브를 실온에서 2 분 동안 로커에 놓습니다. 혼합 후, 조직을 5-7 밀리리터의 차가운 콜라게나제 용액이 들어있는 60 밀리미터 접시에 옮깁니다. 집게를 사용하여 전단지의 양면을 용액에 3-4 회 담그고 세포 배양 인큐베이터에서 조직을 섭씨 37도에서 5-10 분 동안 배양하고 2 분마다 3-4 회 조직을 부드럽게 흔 듭니다.
배양이 끝나면 접시에서 2 밀리리터의 용액을 멸균 된 15 밀리리터의 원추형 튜브로 옮깁니다. 전단지의 결절에 집게를 놓고 멸균 면봉을 사용하여 전단지를 따라 면봉을 돌리면서 집게에서 경첩으로 조직을 스 와이프합니다. 스 와이프 한 후 콜라게나제 용액 튜브에서 면봉을 헹구고 방금 보여준대로 조직의 다른 쪽을 닦습니다.
헹군 후 조직의 양쪽에 면봉을 반복하고 1 밀리리터 피펫과 콜라게나제 용액을 사용하여 전단지 표면의 양쪽에서 제거 된 세포를 접시로 헹굽니다. 헹군 후 접시의 모든 용액을 면봉의 세포가 들어있는 튜브로 옮기고 나머지 밸브 조직을 멸균 콜라게나제 용액 7 밀리리터가 들어있는 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브에 넣습니다. 원심분리에 의해 분리된 판막 내피 세포를 펠렛화하고 세포 펠렛을 3 밀리리터의 혈관 내피 세포 성장 배지에 재현탁시킨다.
2차 원심분리 후, 세포를 계수하기 위해 1 밀리리터의 새로운 성장 배지에 재현탁시키고, 콜라겐이 코팅된 6-웰 플레이트에 평방 센티미터당 5 x 10 내지 5번째 세포 농도로 세포를 시드하고, 3 내지 4일마다 배지를 새로 고친다. 판막 내피 세포 패치가 플레이트의 80 % 이상을 덮을 때, 성장 속도에 따라 1.3 x 10 농도에서 평방 센티미터 당 네 번째 세포로 세포를 분할합니다. 세포가 확장되면 관심 있는 판막 내피 세포 마커에 대한 면역형광 염색으로 판막 내피 세포 표현형을 확인합니다.
판막 간질 세포를 분리하려면 면봉이 들어있는 튜브를 전단지 조직에 넣고 캡을 약간 연 상태에서 12-18 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 배양이 끝나면 혈청 학적 피펫을 사용하여 조직을 부드럽게 해리하여 밸브 간질 세포의 방출을 보장하고 70 미크론 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 50 밀리리터 원추형 튜브로 여과합니다. 7 밀리리터의 밸브 간질 세포 배지를 튜브에 추가하고 원심 분리로 세포를 수집합니다.
계수를 위해 1 밀리리터의 새로운 밸브 간질 세포 성장 배지에 펠릿을 재현탁시키고 60 밀리미터 직경의 조직 배양 처리된 접시에서 평방 센티미터당 4 세포 농도의 1.3 x 10으로 세포를 시드합니다. 1-2일 후, 배양물을 PBS로 2회 세척하고 세포에 새로운 배지를 첨가한다. 세포가 90% 컨플루언시에 도달하면 DPBS로 배양물을 2회 세척하고 섭씨 37도에서 2-3분 동안 예열된 해리 시약 2-3밀리리터로 세포를 처리합니다.
세포가 분리되면 세포 현탁액을 원추형 튜브로 옮겨 원심분리하고 계수를 위해 미리 예열된 밸브 간질 세포 성장 배지 3-4ml에 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 이어서 세포를 본래의 배양 밀도에 1 대 2의 비율로 시드하고, 입증된 바와 같이 면역형광 염색에 의해 판막 간질성 세포 성장 표현형을 평가하였다. 석회성 대동맥 판막 질환 조직 샘플은 대조군 비석회화 조직 샘플에 비해 석회화의 무거운 결절을 갖는 변경된 형태를 나타낸다.
석회화가 폰 코사 염색에 의해 평가 될 때, 병든 전단지 조직에서 짙은 갈색 또는 검은 색 침전이 관찰된다. 냉장 보관 용액은 절제된 판막 조직 세포를 크게 안정화시켜 판막 추출 후 최대 61시간까지 두 가지 유형의 회수된 세포 모두에 대해 약 40%의 생존율을 관찰합니다. 판막 내피 세포의 형태학적 분석은 패킹된 조약돌과 같은 성장 접촉 억제 세포를 나타내는 반면, 판막 간질 세포는 근섬유아세포에서 관찰된 것과 유사한 방추형 형태를 보여줍니다.
면역염색은 확장된 판막 내피 및 판막 간질 세포의 대다수가 예상되는 조직 특이적 마커를 발현한다는 것을 확인시켜준다. 전단지의 부드럽지만 단단한 면봉은 내피 세포층의 방출에 중요하며, 조밀 한 조직 내부에서 간질 세포 집단을 방출하려면 콜라게나제를 사용한 밤새 배양이 필요하다는 것을 기억하십시오. 세포주가 확립되면 질병 발병, 진행 및 치료를 포함한 특정 대동맥 판막 질환 발병 기전에 관한 기계적 연구에 사용할 수 있습니다.
