우리는 중요한 원고 읽기, 시간 경과 이미징 지원 UNC의 현미경 서비스 연구소 및 자금 지원을위한 NIH (부여 # R01HL061656)의 안드레아 포트 베리에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 항체 - 복합 구슬을 준비 <ol><li> 이전 해부 어느 날, 제조업체의 지침에 따라 해당 Dynabeads (쥐 제기 항체 예를 들어, 쥐의 IgG Dynabeads, 4 × 10 8 구슬 / ㎖)로 선택의 항체를 결합합니다. BD 쥐 항 CD31 항체 (0.5 ㎍ / ㎕의 내피 세포를 분리하는 데 사용)의 경우, 3 μL 항체 최종 1.5 μg 항 CD31 항체의 농도 / 1 × 10 7 비즈를 들어, 매 25 μL 비즈에 추가됩니다 25 μL 버퍼입니다. </li><li> 4 ° C.에 구슬과 밤새 항체를 품어 </li></ol> 2. 콜라겐 플레이트를 준비 <ol><li> 단지 콜라겐 코팅 플레이트에 반대 콜라겐 겔에서 재배 할 때 절연 세포는 더 빠르게 세관을 형성한다. 6에 설명 된대로 따라서 콜라겐 젤은, 해부 전날 밤에 만들어집니다. 조직 문화 후드에서 얼음에 다음과 같은 시약 (충분히 19 우물) 결합 : 206.4 μL 멸균 H를 &lt;서브&gt; 2 O, 140.4 μL 콜라겐 유형 I (4.08 밀리그램 / ML), 38.4 μL 배 M199, 그리고 1.15 μL 5 M NaOH를. </li><li> 384 잘 조직 배양 플레이트의 우물에이 콜라겐 젤의 피펫 20 μL. 30 분 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li><li> 각 well에 80 μL DMEM을 추가하고 37 15 분 동안 품어 ° C. 배지를 제거하고 두 번 더 반복합니다. </li><li> 최종 헹굼 후, 잘 FBS / DMEM 각각 80 μL 10 %를 추가하고 37 밤새 품어 ° C. 분리 된 세포를 추가하기 전에 배지를 제거합니다. </li></ol> 3. 소비세 심장을 소화 <ol><li> 승인 안락사 기술을 사용하여 원하는 배아 일에 시간 초과 임신 마우스를 안락사. 모든 실험은 채플 힐에서 노스 캐롤라이나 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. </li><li> 앙와위에서 마우스로, 자유주의 ​​이전에 70 % 에탄올로 여성의 복부 측면을 살포해부. 내부 장기에서 멀리 하복부 피부와 근육을 들어 올려 집게를 사용하여 내부 장기를 시각화하는 여성의 낮은 복강을 열고 잘라. </li><li> 집게와 자궁 경부를 잡고 조심스럽게 핀셋으로 꼬리 잘라 내기 및 복강에서 자궁을 들어 올려 시작합니다. 자궁을 들어 올리면서 그 자리에 경적을 보유하고있는 결합 조직을 잘라. 자궁을 절개 완료하려면 자궁을 무료로 난관과 자궁의 접합부를 잘라. </li><li> 차가운 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)와 필요에 린스를 포함하는 페트리 접시에 자궁을 놓습니다. 첨부 된 배아 주머니를 노출 정중선을 통해 자궁을 열고 잘라. </li><li> 배아를 절단 실수 방지하고 배아를 검색하는 태반의 교차점에서 배아 주머니와 배아를 자르면. 차가운 PBS로 두 번째 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 얼음 자궁 경적 페트리 접시를 돌려줍니다. </li><li> 디가슴 벽에 대한 액세스를 개선하기 위해 배아를 ecapitate. 유전자형이 필요한 경우,이를 제거하고 얼음에 배치 에펜 도르프 튜브에 저장 꼬리를 잘라. </li><li> 그것의 뒤에 배아와, 심장과 폐를 시각화하는 가슴 벽을 열고 잘라. 다음, 부드럽게 방식의 가슴 벽을 당겨 밖으로, 마음을 절단 방지하기 위해, 갈비뼈의 하단에 가로 컷 다음 앞발 근처 흉곽의 측면을 따라 수직 절단,합니다. 최대 약 배아 일 13.5을 통해, 가슴 벽 시각화 은닉, 투명합니다. </li><li> 조심스럽게 집게를 사용하여 마음을 들어 올려 아래의 혈관을 잘라. 그런 마음을 해방하는 큰 그릇 위에 잘라. 폐 혈관이 절단되지 않은 경우, 폐는 마음으로 제거 할 수 있습니다. 필요한 경우 따라서, 폐와 같은 불필요한 조직을 제거합니다. </li><li> 분리 심실에서 심방과 큰 혈관을 버립니다. 가위 사용하여 작은 조각 (약 1mm 3 &lt;에 심실을 말하다/&gt;를 한모금) 약 500 μL 콜라게나 제 (멸균 PBS 1 MG / ML)에서 개최. 모든 심실 다진과 콜라에 배치 될 때까지 얼음에 샘플을 유지한다. </li><li> 심실은 별도의 에펜 도르프 튜브에 각각의 마음을 수집, 모든 배아에서 적출 될 때까지 이전 단계를 반복합니다. 모든 배아가 동일한 유전자형이 있다면, 마음은 하나의 에펜 도르프 튜브에 풀링 할 수 있습니다. 한 번에 처리 된 샘플의 수는 분리에 사용되는 자석에 따라 제한 될 수 있습니다; DynaMag (123-21D)는 16 에펜 도르프 튜브의 최대 보유하고 여기에 사용. </li><li> 45 분 동안 흔들 37 ° C에서 다진 심실를 놓습니다. 매 15 분, 부드럽게 샘플을 제거하고 기계적으로 세포를 해리 아래로 피펫. </li></ol> 4. 내피 세포를 분리 <ol><li> 세포의 나머지 덩어리를 제거하는 필터 70 μm의를 통해 뇌실 - 콜라게나 솔루션을 전달합니다. </li><li> 10 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기. 폐기상층 액은 DMEM 약 200 μL 10 % FBS로 교체하고, 세포를 떼어 놓다 아래로 피펫. </li><li> 일단 이전 단계를 반복합니다. 두 번째 10 % FBS / DMEM 세척 후 10 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기. 50 μl를 10 % FBS / DMEM에 세포를 resuspend을. </li><li> 최종 원심 분리 단계에서 구슬을 준비합니다. <ol><li> 1 분 자석에 항체 비즈를 포함 에펜 도르프 튜브를 놓습니다. </li><li> 자석에 장소 튜브, 상층 액을 제거하십시오. 자석에서 튜브를 제거하고 약 100 μL 10 % FBS / DMEM을 추가합니다. </li><li> 1 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 상층 액을 제거하고 10 % FBS / DMEM 다시 씻는다. 3 세척의 총 반복합니다. </li><li> 마지막 세척 후, 10 % FBS / DMEM에 항체가 결합 된 비즈 (샘플 당 5 μL)을 resuspend을. </li></ol></li><li> 각각의 세포 샘플, 항체 결합 된 구슬의 5 μl를 추가합니다. 락 FO와 4 ° C에서 비드 세포 현탁액을 배치R 30 분. </li><li> 층류 후드에서 1 분 자석에 세포와 항체 - 복합 구슬을 포함 에펜 도르프 튜브를 놓습니다. 상층 액을 제거 자석에서 튜브를 제거하고, 약 100 μL 10 % FBS / DMEM으로 세척한다. 5 세척을 반복합니다. </li><li> 마지막 세척 후, 1 분 동안 자석에 튜브를 배치 상층 액을 제거하고 자석에서 튜브를 제거합니다. 약 100 μL DMEM을 추가합니다. </li><li> 1 분 동안 자석에 튜브를 놓고, 상층 액을 제거하고 자석에서 튜브를 제거합니다. 100-200 추가 μL 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 prewarmed. 37 샘플을 품어 ° C와 5 분 5 % CO 2. </li><li> 2 분 자석에 튜브를 놓습니다. 신선한 에펜 도르프 튜브에 세포를 포함하는 상층 액을 조심스럽게 전송할 수 있습니다. 400 X g에서 5 분 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거합니다. 예상 수익률에 따라, 또는 384 잘 대우 배양 접시 - 80-100 ㎕의 성장 배지 및 플레이트 96에있는 세포를 resuspend을(E14.5 - E16.5 배아의 심실에서 약 450-600 세포). 내피 세포 (아래 정의) 내피 성장 배지를 사용합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Life: How Cells Became Technologies. , (2007).</li><li>Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+dysfunction+and+cytoskeletal+changes+associated+with+repression+of+p16(INK4a)+during+immortalization.">Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.</a> Oncogene. , (2012).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endothelium:+an+emphasis+on+heterogeneity.">Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).</li><li>Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants.">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).</li><li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).</li><li>Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+kidney+fibrosis+emerge+via+endothelial-to-mesenchymal+transition.">Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).</li><li>Chang, L., Noseda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+from+local+precursors+during+embryonic+and+adult+arteriogenesis+requires+Notch+signaling.">Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling.</a> PNAS. 109, 5993-6998 (2012).</li><li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells.">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).</li><li>Frauli, M., Ludwig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+a+culture+of+human+endometrial+stromal+cells+using+a+medium+containing+D-valine.">Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).</li><li>Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media.">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li><li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement.">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

기본 배아 세포와 작업 새로운 실험 개발의 체외 중요한 단계에서 처리 할 수 있습니다. 그러나 분리 절차는 간단하지 않습니다. 세포의 모든 유형을 분리하는 중요한 단계는 세포가 잘 그들이 잘 세척 단계에서 중단되는 다음 콜라 소화에 분리되는 것을 보장 이용하실 수 있습니다. pipetting하여 기계적 박리 크게 콜라 단계에서 세포를 분리하는 데 도움이, 그리고 필터링 단계는 세?...

불후의 세포 라인의 출현은 기본적인 세포 생물학 1 혁명을 일으켰다. 현재 세포주 기관의 다양한에서 파생 된 모든 주요 세포 유형을 포함하고 있습니다. 그러나 설립 세포 라인은 몇 가지 제한이 있습니다. 불멸화 과정은 분명히 특히 수명과 확산에 대해, 세포의 동작을 변경하지만, 또한이 세포 골격 단백질과 같은 예기치 않은 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있습니다. 많은 다른 세포 라인을 사용할 수 있지만 또한, 전체 유기체 내에서 단 한 번의 세포 유형 간의 유의 한 다양성이있다. 특히 쇼 다양한 행동의 내피 세포는 동맥이나 정맥 흐름의 종류는 용기 3에 존재하는 그들은 선 여부에 따라. 발달의 관점에서 훨씬 더 시급한 그러나, (참조, 예를 들면 t 사용할 수있는 세포 라인의 대부분이 성인 조직에서 파생 된 것입니다ATCC 통해 사용할 그가 컬렉션). 이러한 성인 세포주 가능성이 자신의 배아 전구체의 동적 특성을 요점을 되풀이하지 않습니다. 개발하는 동안 관찰 빠르게 변화하는 시공간 유전자 발현 패턴은 특정 발달 단계에서 하나의 기관에서 내피 세포가 다른 발달 단계에서 동일한 기관에서 내피 세포와 같은 방식으로 작동하지 않을 수 있습니다하는 것이 좋습니다. 시중 불후의 세포 라인을 사용하는 대신, 일차 전지는 관심의 특정 조직에서 분리 할 수​​ 있습니다. 이 기술의 장점 가운데 이러한 기본 세포도 특정 기관이나 특정 발달 단계에서 기관의 부분으로부터 격리 할 수​​ 있습니다. 또한, 이러한 기본 세포는 유전자 녹아웃 등의 transfection 효율성과 같은 다른 문제를 피하면서 노크에서의 체외 연구에서 허용 가능한 형질 전환 동물의 다양한 격리 할 수 있습니다. 되지 놀랍게도, 많은기술은 특정 세포 유형 4,5 분리하는 방법에 대해 자세히 발표되었다. 일반적으로,이 기술은 세포 태그 관심의 특정 세포 유형을 해리하고 추가 분석을 위해 그 세포를 분리, 관심의 영역을 모으는 포함한다. 관상 동맥 내피 세포의 초기 배아 인구를 연구하기 위해, 우리는 작은 장기 사용하기 위해 이전에 게시 된 기술 4 축소. 이 축소 된 절차로, 우리는 특정 배아 단계에서 배아 마음에서 관상 동맥 내피 세포를 분리 할 수​​ 있습니다. 이러한 세포는 그런 마이그레이션 분석과 같은 전통적인 내피 분석에 사용할 수 있습니다. 초기 배아 세포 라인이 더 널리 될 때까지, 일차 전지 작업을하는 것은 매우 중요한 기술이다.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Timed-pregnant mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-mouse CD31</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553370</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat IgG Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>110-35</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>F2442 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>(made in lab as described in notes)</td>
			<td></td>
			<td>DMEM containing 20% FBS, 5 &mu;M &beta;-mercaptoethanol, 50 &mu;g/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECGS</td>
			<td>Biomedical Technologies, Inc.</td>
			<td>BT-203</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>384-well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>T-3037-6</td>
			<td>Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>BD</td>
			<td>354236</td>
			<td>Use at a final concentration of 1.5 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>M199, 10x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Syto-16</td>
			<td>Invitrogen </td>
			<td>S7578 </td>
			<td>Used as directed in 13 </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Nikon </td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo </td>
			<td>3110 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DynaMag</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Table-top centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation of embryonic ventricular endothelial cells

세포 배양 크게 수많은 배양 조건에서 세포의 개별 인구를 평가하는 능력을 강화했다. 불후의 세포 라인 사용의 용이성에 상당한 이점을 제공하지만, 이러한 세포 라인은 모든 잠재적 세포 유형에 사용할 수 없습니다. 특히 형질 전환 마우스의 관심의 특정 지역의 일차 전지를 분리하여,보다 미묘한 연구를 수행 할 수 있습니다. 기본 기술은 장기 또는 그 일부 장기 (심장 또는 심장의 특정 지역 등) 해부 및 단일 세포로 장기 해리 ​​포함한다. 이 세포는 그 관심의 세포 유형을 인식하는 항체 복합 자석 구슬로 배양한다. 그 세포는 그 구슬에서 세포를 해리 짧은 트립신 보육과, 자석의 사용으로 격리 할 수​​ 있습니다. 이 고립 된 세포는 다음 배양하고 원하는 분석 할 수 있습니다. 이 기술은 원래 성인 마우스의 장기를 위해 설계되었습니다들하지만, 쉽게 여기에서 알 수 있듯이, 배아 장기 사용하기 위해 아래로 확장 할 수 있습니다. 우리의 관심을 개발하는 관상 동맥 혈관에 있기 때문에, 우리는 특정 배아 단계에서 세포의이 인구를 공부했습니다. 따라서, 원래의 프로토콜은 배아 심실의 작은 크기와 이러한 발달 단계에서 내피 세포의 낮은 잠재적 인 수확량과 호환되도록 수정해야했습니다. 이 스케일 다운 방식 활용, 우리는 유전자 변형 배아 심실 내피 세포의 관상 동맥 신경 얼기 리모델링을 평가했다.

CD31를 인식 내피 세포 특이 항체를 이용하여 내피 세포는 배아 (E) 13.5 (그림 1A) 및 18.5 (피규어 1B-1D) 배아의 심실에서 분리되었다. 치료 배양 접시에 성장하면,이 세포는 둥근 남아 근처 합류 (그림 1A) 만약 조약돌 패턴을 형성한다. 희석 콜라겐은 또한 우물 코트에 사용되어 왔으며, 내피 세포가 (그림 1B)을 준수 할 때, 그들은보다 적은 체인을 형?...

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Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

기본 세포 배양은 특히 특정 발달 단계에서 유전자 변형 마우스 배아에서 세포의 특정 인구를 분석하기위한 유용한 기술이다. 여기서, 배아 심실는 해부와 해리, 항체가 결합 된 구슬 인식하고 자세한 분석을 위해 내피 세포를 분리한다.

배아 심실 내피 세포의 분리

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.3K 조회수.  University of North Carolina at Chapel Hill. 기본 세포 배양은 특히 특정 발달 단계에서 유전자 변형 마우스 배아에서 세포의 특정 인구를 분석하기위한 유용한 기술이다. 여기서, 배아 심실는 해부와 해리, 항체가 결합 된 구슬 인식하고 자세한 분석을 위해 내피 세포를 분리한다.

비디오: Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

인간 제대 베인 내피 세포의 절연 (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

연구

생물학

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Hindlimb 국소 빈혈의 치료를위한 배아 줄기 세포 유래 내피 세포

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

판막병 내피 세포의 분리

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

조류 배아 판막병 전구 세포의 분리 및 문화

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

마우스 관상 내피 세포의 분리

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...