여기에서, 우리는 원발성 마우스 간 정현파 세포 분리 또는 LSEC 단리의 우리의 프로토콜을 시연한다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류 및 비실질 세포 정제를 위한 저속 초원심분리 및 CD146 마그네틱 비드 선택으로 구성됩니다. 우리의 LSEC 분리 방법은 매우 효율적이며 건강하고 병든 마우스 간에도 적용 할 수 있습니다.
절연된 LSEC는 고순도를 표시하고 구조와 기능을 보존합니다. 이 프로토콜을 사용하여 분리된 LSEC는 기능 및 분자 연구 및 다중 오믹스 데이터 생성에 최적입니다. 이 프로토콜은 간에서 세포 간 통신을 연구하는 데 도움이 될 것입니다.
10 센티미터 배양 접시에 세 밀리리터의 콜라겐 용액을 코팅하여 시작하십시오. 그런 다음 접시를 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션하십시오. 한 시간 후, 코팅된 표면으로부터 과량의 유체를 제거한다.
PBS로 접시를 세 번 씻고 공기 건조하게하십시오. 가열 및 가습 재순환 관류 장치를 설치하십시오. 5 분 동안 10 % 표백제를 사용하여 관류 시스템을 헹구십시오.
그런 다음 시스템을 다시 멸균수로 10 분 동안 헹구십시오. 콜라게나제 용액으로 관류하기 전에 헹굼액을 가능한 한 많이 배출하십시오. 관류 시스템을 통해 콜라게나제 용액을 주입하여 섭씨 37도까지 예열하십시오.
속도 제어 다이얼에서 펌프 속도를 속도 하나로 설정하십시오. 전체 절차에서 속도를 동일하게 유지하십시오. 절차를 위해 마우스의 무게를 측정하십시오.
그런 다음 수술 표면에 고정하십시오. 마우스 복부에 70 % 에탄올을 뿌리십시오. 외과 용 가위를 사용하여 복부의 아래 부분에서 xiphoid 과정까지 약 다섯 센티미터의 절개를하십시오.
그 후, 복부의 양쪽에있는 작은 홍채 가위를 사용하여 복부 장기를 완전히 노출시키는 두 개의 측면 절단을하십시오. IV 카테터의 칼집을 동물의 등 아래에 두어 복부를 들어 올리고 평평하게하십시오. 규칙적인 곡선 드레싱 포셉을 사용하여 창자와 위를 동물의 왼쪽으로 부드럽게 당깁니다.
그런 다음 노출 된 왼쪽 신장 바로 아래의 열등한 정맥 카바 또는 IVC 아래에 5-0 개의 외과 봉합사를 놓습니다. 봉합사에 느슨한 히치를 묶으십시오. 다음으로, 간 포털 정맥 주위에 또 다른 5-0 개의 외과 봉합사를 놓습니다.
봉합사를 간 문맥 정맥의 비장 정맥 분기 지점 바로 위에 놓습니다. 다시 말하지만, 봉합사에 느슨한 히치를 묶으십시오. 포털 정맥 봉합사를 장력으로 사용하여 20 게이지 IV 카테터를 간 포털 정맥에 삽입하여 좌우 간 포털 정맥으로 분기하는 한 센티미터 아래에 삽입하십시오.
그런 다음 카테터를 정맥 위로 밀어 올리지 만 분기 영역 아래에 보관하십시오. 혈액이 물방울이 떨어지기 시작할 때까지 카테터 아래로 이동하게하십시오. IV 카테터를 포털 정맥 봉합사로 고정하십시오.
IV 라인을 사용하여 버퍼 A가있는 IV 병을 카테터에 부착하십시오. 그런 다음 시스템에 공기가 들어 가지 않도록하면서이 용액으로 간을 씻어 내십시오. 신장 아래의 IVC 주위의 봉합사를 묶으십시오.
그 후, IVC를 봉합사 아래로 잘라 동물이 피를 흘릴 수 있도록하십시오. 일단 관류하면 위장, 창자, 비장 및 간장에 붙어있는 다른 entrails를 잘라냅니다. 그런 다음 횡격막과 흉강에서 주요 혈관을 잘라냅니다.
동물에서 간을 제거하고 관류 트레이에 놓습니다. 조심스럽게 IV 라인을 제거하고 재순환 챔버에서 콜라게나제 용액을 연결하십시오. 캡슐이 모델링되고 끈적 끈적하게 보일 때까지 간이 관류하도록하십시오.
이 작업은 일반적으로 10~15분 정도 걸립니다. 소화되면 챔버에서 간을 제거하고 약 20 밀리리터의 무혈청 DMEM이있는 10 센티미터 페트리 접시에 놓습니다. 두 개의 피펫 팁으로 간을 부드럽게 떼어 내고 담즙 나무를 버리십시오.
그 후, 간 현탁액을 70 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 여과하십시오. 세포 현탁액을 실온에서 두 분 동안 50배 G에서 원심분리한다. 이어서, 비실질 간 세포를 함유하는 상청액을 수집한다.
상층액을 섭씨 네 도에서 5분 동안 300배 G에서 원심분리한다. 그 후, 세포 펠릿을 수집하고 한 밀리리터의 분리 완충액에 재현탁시킨다. 제조업체의 지침에 따라 자동 셀 카운터를 사용하여 셀 번호를 확인합니다.
다음으로, 세포 현탁액을 원심분리한다. 상청액을 완전히 흡인하고 펠렛을 10 백만 세포 당 90 마이크로리터의 분리 완충액으로 재현탁시킨다. 총 세포 1천만 개당 10마이크로리터의 CD146 마이크로비드를 첨가한다.
잘 섞어서 섭씨 네 도에서 15 분 동안 배양하십시오. 세포를 세척하려면 10 백만 세포 당 1 ~ 두 밀리리터의 분리 버퍼를 추가하십시오. 용액을 300배 G에서 10분 동안 원심분리한다.
그 후, 상청액을 완전히 흡인하고 500 마이크로 리터의 분리 완충액에 최대 10 억 개의 세포를 재현탁하십시오. 다음으로, 분리 컬럼을 세 밀리리터의 분리 완충액으로 헹구어 준비한다. 세포 현탁액을 70마이크로미터 예비 분리 필터로 적층된 컬럼 상에 적용한다.
세 밀리리터의 분리 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하십시오. 그 후, 컬럼을 분리기에서 제거하고 15 밀리리터 원심분리 튜브 위에 놓습니다. 컬럼에 다섯 밀리리터의 격리 버퍼를 피펫합니다.
자성 비드 표지된 세포를 회수하려면, 플런저를 컬럼 내로 단단히 밀어 세포를 플러시한다. 마지막으로, 세포를 섭씨 네 도에서 5분 동안 300배 G에서 원심분리한다. 단리된 LSECs 순도 및 표면 마커를 유세포 분석기로 평가하였다.
게이팅된 LSEC 및 싱글 트에 대한 데이터 분석 및 게이팅 전략은 순방향 분산 및 측면 분산 데이터를 기반으로 합니다. 단리된 LSECs를 생존성 염료 및 CD45, CD146 및 스타빌린-2 항체의 조합으로 염색하였다. 생존 가능한 LSECs를 CD45 음성 집단에 게이팅하고, CD146 및 스타빌린-2 발현에 대해 분석하였다.
이 데이터로부터, 분리된 LSECs가 94% 이상의 생존력과 90% 이상의 순도를 가짐을 확인하였다. 분리된 세포의 LSEC 특이적 표현형을 광 현미경 및 주사 전자 현미경을 사용하여 추가로 확인하였다. 분리된 LSECs를 여섯 시간 동안 완전 성장 배지에서 배양하고 광 현미경으로 조사하였다.
SEM 이미지의 흰색 화살표는 LSEC fenestrae를 나타내며, 이는 LSEC의 특징적인 형태학적 특징입니다. 간 조직의 완전한 관류를 보장하는 중요한 단계는 카테터에 공기가 유입되는 것을 피하고 콜라게나제 소화의 최적 타이밍을 피하면서 적절한 카테터 테이프 위치입니다. 우리의 프로토콜을 사용하여 획득 한 고품질 LSEC는 LSEC 기능의 분자 메커니즘의 식별을 용이하게하고 간, 건강 및 질병에서 세포 간 통신에서의 역할에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것입니다.
