이 연구는 NSF 경력 수상, 하트웰 재단, 그리고 미국 심장 협회 (# 0830384N)에 의해 지원됩니다.

1. 준비 <ol><li> 대상 기기에 압력솥은 다음 항목을 트레이 : <ol><li> 톱니 모양의 조직 포셉 - 전단지 조직을 처리 </li><li> 조직 가위 (8cm) - 전단지 조직 및 cusps을 트리밍을 위해 </li><li> 면화 면봉 - 전단지 또는 끝에서 내피 레이어를 격리 시킨것에 대한 </li></ol></li><li> 무균 collagenase 솔루션을 확인하십시오 <ol><li> 18 MΩ 물 250 ML에 가루 DMEM의 4.0 g을 추가합니다. </li><li> 나트륨 중탄산염의 1.11 g을 추가합니다. </li><li> (600 U / ML) collagenase의 180,000 단위를 추가합니다. </li><li> 1퍼센트 (3mL) 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다. </li><li> 7.2 솔루션의 산도를 조정합니다. </li><li> 270 ML에 대한 해결책을 가져 오십시오. </li><li> 0.2 μm의 필터를 통과하여 솔루션을 소독. </li><li> 무균 태아 소 혈청의 10 % (30mL) 추가합니다. </li></ol></li><li> 무균 내피 세포 미디어 만들기 <ol><li> 18 MΩ 물 400 ML에 가루 DMEM의 6.7 g을 추가합니다. </li><li> 나트륨 중탄산염의 1.85 g을 추가합니다. </li><li> (50 U / ML) 헤파린의 25,000 단위를 추가합니다. </li><li> 1퍼센트 (5mL) 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다. </li><li> 7.2 솔루션의 산도를 조정합니다. </li><li> 450 ML에 대한 해결책을 가져 오십시오. </li><li> 0.2 μm의 필터를 통과하여 솔루션을 소독. </li><li> 무균 태아 소 혈청의 10 % (50mL)를 추가합니다. </li></ol></li><li> 무균 중간 세포 미디어를 확인 <ol><li> 18 MΩ 물 800 ML에 가루 DMEM의 13.37 g을 추가합니다. </li><li> 나트륨 중탄산염 3.7 g을 추가합니다. </li><li> 1퍼센트 (10mL) 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다. </li><li> 7.2 솔루션의 산도를 조정합니다. </li><li> 900 ML에 대한 해결책을 가져 오십시오. </li><li> 0.2 μm의 필터를 통과하여 솔루션을 소독. </li><li> 무균 소 혈청의 10 % (100mL)를 추가합니다. </li></ol></li></ol> 2. 심장 밸브 전단지의 분리 <ol><li> 희생 후 마음에서 즉시 무균 엑사이스 대동맥 루트. </li><li> 철저하게 추위 무균 DPBS과 혈액의 대동맥 뿌리를 씻어. 그것은 VEC의 죽음과 박테리아 오염을 제한하는 모든 혈액 구성 요소를 가능한 한 빨리를 제거하는 필수적입니다. 그들은 VEC에 잠재적으로 해로운 있기 때문에 항생제와 antimycotics이 단계에서 권고하지 않습니다. </li><li> 바로 12 ML 감기 DPBS 가득한 살균 15 ML 원뿔 관에 뿌리와 장소에서 밸브 전단지 (3 밸브 당) 분리. 신선한 DPBS와 파편과 리필을 제거하기 위해 여러 번 흔들어. </li><li> 얼음에있는 실험실로 이송합니다. </li><li> 실험실에 도착하자마자, 멸균 후드 아래에있는 조직과 용기를 놓습니다. </li></ol> 3. 내피 층의 분리 <ol><li> 밸브마다 감기 collagenase 솔루션 (3 전단지)을 3mL와 살균 35mm 요리를 입력합니다. </li><li> collagenase 솔루션 가득 그릇에 15 ML 관에서 세 전단지를 놓습니다. </li><li> 37 5-10분에 대한 조직을 품어 ° C. </li><li> 부드럽게 전단지의 표면에 건조한 멸균 면봉을 돌려 내피 층을 제거합니다. 전단 적용의 회전과 금액의 방향은 샘플의 순도를 위해 중요합니다. 면봉의 회전이 제어 전단을 만드는 손의 직선 운동에 반대 방향으로해야합니다. 이 전단은 조직에서 내피 세포 리프트 무엇입니까. 강제 적용의 금액은 조직의 저항을 느낄하지만, 지하 막에 침투하지 않도록 충분해야합니다. </li><li> 때때로 소량의 collagenase 솔루션 내에서 면봉은 팁 섬유에서 세포를 이동시키다 수 있습니다. 보라고가 완료되면, 내피 층의 질감보다 약간 부드러워지는 느낌한다. </li><li> 세포 현탁액 / collagenase를 수집하고 새로운 살균 15mL 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 펠렛 5 분 어떤 고립된 세포 1,000 RPM에서 튜브를 원심과 뜨는을 대기음. 뿐만 아니라 중간 세포를 분리하는 경우 이러한 세포가 centrifuged되고있는 동안, 그 프로토콜을 수행합니다. </li><li> 15 ML 튜브에 내피 돼지의 매체 3 ML 추가, 두 번째 시간을 원심 분리기하고, 기음 미디어. 이 초 원심 분리는 팁 섬유로 불필요한 자료의 일부를 필터링하는 데 도움이됩니다. </li><li> centrifuged 내피 세포가 콜라겐과 사전 코팅 T - 25 플라스크 (사용 원심 분리기 튜브 당 1 플라스크)에 내피 돼지의 미디어 및 플레이트 세포 5 ML에 다시 일시 중지합니다. </li><li> 세포가 내피 매체를 변경하기 전에 최소한 2~3일 성장하자. 이것은 세포가 회복과 격리 프로세스가 매우 거칠고이고 세포 수율이 낮은 수 있기 때문에 나눌 수 있습니다. 연락처 억제가 세포 변형을 초래할 수 있으므로이 코플루엔스 근처 통로 세포에 중요합니다. </li></ol> 4. 사이드 특정 절연을위한 60mm 문화 요리의 준비 <ol><li> 알루미늄 호일 (와 라인 60mm 유리 배양 접시 당 leafle이 유리 요리T). 알루미늄 포일은 유리 페트리 접시는 다른 isolations 위해 재사 용할 수 있도록, 파라핀을 제거하는 데 도움이됩니다. </li><li> 반쯤 찼다고에 대한, 요리 이내 파라핀 비즈를 삽입하고, autoclaving 커버. </li><li> autoclaving가 완료되고 파라핀이 녹아되면 시원한 평면으로 요리의 앙상블 이동합니다. 파라핀이 차가워지면서, 그것은 강화가되며 바늘 자국을 지원하는 레이어를 만들 수 있습니다. </li><li> 30 분 후에, 살균 요리는 다음 전단지 조직을 고정하기 위해 격리 챔버로 사용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 사이드 특정 내피 층의 분리 <ol><li> 측면 특정 격리 준비 60mm 문화 접시에있는 15mL 튜브 장소에서 전단지를 제거합니다. </li><li> ventricularis 측면이 fibrosa 측면이 노출 떠나는 파라핀 표면에 내려 얼굴 있도록 전단지를 조작. 내피 층을 노출하는 전단지의 가장자리를 핀. </li><li> 37 각 (이상 방향) 내피 표면에 감기 collagenase 몇 방울을 넣고 50-10분에 대한 조직을 품어 ° C. </li><li> 전처럼 부드럽게 전단지의 표면에 건조한 멸균 면봉을 돌려 내피 층을 제거합니다. 전단 적용의 회전과 금액의 방향은 샘플의 순도를 위해 중요합니다. 면봉의 회전이 제어 전단을 만드는 손의 직선 운동에 반대 방향으로해야합니다. 이 전단은 조직과 다른 아무것도에서 내피 세포 리프트 무엇입니까. 강제 적용의 금액은 조직의 저항을 느낄 수 있지만, 조직 내에 침투하지 않는 정도로해야합니다. </li><li> 때때로 소량의 collagenase 솔루션 내에서 면봉은 팁 섬유에서 세포를 이동시키다 수 있습니다. 보라고가 완료되면, 내피 층의 질감보다 약간 부드러워지는 느낌한다. </li><li> 세포 현탁액 / collagenase를 수집하고 새로운 살균 15mL 튜브로 전송할 수 있습니다. 라벨 측면 특이성을 (같은 밸브의 전단지를 함께 풀링 수 있음)을 나타냅니다. </li><li> ventricularis 측면 이제 노출 및 반복 단계 (5.3-5.6)되도록 새로운 문화 요리에 전단지를 전송합니다. </li><li> 모든 세포 현탁액 / collagenase가 수집되면, 펠렛 어떤 격리 세포 오분 1,000 RPM에서 튜브를 원심과 뜨는을 대기음. 뿐만 아니라 중간 세포를 분리하는 경우 이러한 세포가 centrifuged되고있는 동안, 그 프로토콜을 수행합니다. </li><li> 튜브에 내피 돼지의 매체 3 ML 추가, 두 번째 시간을 원심 분리기, 그리고 미디어를 대기음. 이 초 원심 분리는 팁 섬유로 불필요한 자료의 일부를 필터링하는 데 도움이됩니다. </li><li> centrifuged 내피 세포가 합성 (원심 분리기 튜브마다 사용하는 한 플라스크)로 사전 코팅 T - 25 플라스크에 내피 돼지의 미디어 및 플레이트 세포 5 ML에 다시 일시 중지합니다. </li><li> 세포가 내피 매체를 변경하기 전에 최소한 2~3일 성장하자. 이것은 세포가 회복과 격리 프로세스가 매우 거친이기 때문에 나눌 수 있습니다. 당신은 생산량이 매우 낮을 것으로 예고 경우, 세포 세포의 부착은 세포 성장을 촉진 때문에 작은 술병이나 잘 플레이트로 이동 고려해보십시오. 연락처 억제가 세포 변형을 초래할 수 있으므로 합류 근처에 통과해야합니다. </li></ol> 6. 중간 세포의 분리 <ol><li> 밸브마다 collagenase 솔루션 (3 전단지) 10 ML과 멸균 15 ML의 원심 분리기 튜브를 입력합니다. </li><li> 내피 세포의 전단지를 보라고 후, 즉시 collagenase 솔루션 해당 15mL 튜브에서 그들을 놓으십시오. </li><li> (원하는 경우 부드럽게 선동) 약 12​​-18시간위한 부화. </li><li> 세포 현탁액 / collagenase가 균질 될 때까지 serological 피펫과 함께 부드럽게 저하된 조직을 섞는다. 이 균질의 조직을 헤어지게하고 중간 세포를 출시하는 데 도움이됩니다. </li><li> 1,000 RPM에서 5 분 동안 소화 조직을 원심 분리기 및 뜨는을 대기음. </li><li> 15mL 튜브 5 ML 중간 돼지의 매체를 추가, 두 번째 시간을 원심 분리기 및 supernate을 대기음. </li><li> centrifuged 내피 세포의 중간 돼지의 미디어 및 플레이트 세포 5 ML에 다시 중단 T - 75 플라스크 (원심 분리기 튜브 당 1 플라스크를 사용하여). </li><li> 세포는 중간 세포 매체를 변경하기 전에 최소한 1-2일 성장하자. 예상되는 내피 세포하지만,보다 많은 조직 파편있을 것입니다. 세포는 또한 빠른 때문에 세포 수율과 자연의 내피 세포보다 합류로 성장한다. </li></ol> 7. 대표 이미지 <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 2-3일 게시물 절연의 절연 세포의 형태. (A) VEC는 일반 내피 형태학 및 형태의 성장을 촉진하기 위해 클러스터를 나타냅니다. (B) VIC의 형태는 일반적으로 스핀들 모양과 술병에 걸쳐 균등하게 분산시키고 myofibroblasts 비슷합니다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. confluency에서 분리된 세포의 형태. (A) VEC은 일반적으로 조약돌과 성장 접촉 저해하는 전형적인 내피 형태를 나타냅니다. (B) VIC의 형태는 일반적으로 스핀들 모양이 아니라 성장 접촉 저해 아르 myofibroblasts 비슷합니다. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 격리 세포의 기능 특성 6. (A) VEC는 acetylated LDL 이해 높은 수준의 (적색)과 연결되어 있습니다. (B) VIC는 acetylated LDL 이해의 낮은 수준과 관련됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 절연 세포 6 세포 마커. (A) VEC의 표현형는 본 Willebrand 팩터 (녹색), 파랑 (핵)에 대한 긍정적인 얼룩에 기여합니다. (B) VIC의 표현형는 본 Willebrand 팩터에 대한 부정적인 얼룩에 기여합니다. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 격리 세포의 세포 마커. (A) VEC의 표현형는 알파 SMA (녹색), 파랑 (핵)에 대한 부정적인 얼룩에 기여합니다. (B) VIC의 표현형는 알파 SMA에 대한 긍정적인 얼룩에 기여합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 해리 에이전트 </td><td> 분리 기술 </td><td> 셀 컬렉션 </td><td> 셀 수량 </td><td> 세포 퓨리티 </td><td> 오염 </td></tr><tr><td> CaCl 2없이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (3mM) </td><td> 5, 20, 60 분. CaCl 2뿐만 아니라 전 </td><td> 20, 60, 120 분. 수령 전에 </td><td> - </td><td> + / - </td><td> + + + </td></tr><tr><td> CaCl 2없이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (6mM) </td><td> 5, 20, 60 분. CaCl 2뿐만 아니라 전 </td><td> 20, 60, 120 분. 수령 전에 </td><td> + / - </td><td> + </td><td> + + + </td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.5 g / L) </td><td> 5, 10, 15 분. 비활성화하기 전에 </td><td> 매체 즉시 수집 </td><td> + </td><td> + </td><td> + + </td></tr><tr><td> Collagenase II (300 U / ML) </td><td> 5, 10, 15 분. 비활성화하기 전에 </td><td> 매체 즉시 수집 </td><td> -, +, + + </td><td> - + + + </td><td> + </td></tr><tr><td> Collagenase II (600 U / ML) </td><td> 5, 10, 15 분. 비활성화하기 전에 </td><td> 매체 즉시 수집 </td><td> +, + +, + + + </td><td> + +, + +, - </td><td> - </td></tr></tbody></table> 표 1. 예비 밸브 모양의 내피 세포 격리 프로토콜의 결과.

<ol>
	<li>Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+truncus+arteriosus+of+the+chick+embryo+heart:+the+formation+and+migration+of+mesenchymal+tissue.">Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue.</a> Am J Anat. 154, 545-556 (1979).</li><li>Johnson, C. M., Fass, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture:+A+relative+deficiency+of+fibronectin+synthesis+in+vitro.">Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro.</a> Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).</li><li>Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calf+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture:+production+of+glycosaminoglycans,+prostacyclin+and+fibronectin.">Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin.</a> J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).</li><li>Cheunyg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+isolating+and+purifying+porcine+aortic+valve+endothelial+cells.">Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells.</a> JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).</li><li>Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+valve+endothelial+cells+undergo+transforming+growth+factor-beta-mediated+and+non-transforming+growth+factor-beta-mediated+transdifferentiation+in+vitro.">Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro.</a> Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).</li><li>Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+morphology+and+focal+adhesion+development+of+valvular+endothelial+cells+in+static+and+fluid+flow+environments.">Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments.</a> Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).</li><li>Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+heterogeneity+of+endothelial+phenotypes+correlates+with+side-specific+vulnerability+to+calcification+in+normal+porcine+aortic+valves.">Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves.</a> Circ Res. 96, 792-799 (2005).</li><li>Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiles+of+Valvular+and+Vascular+Endothelial+Cells+Reveal+Phenotypic+Differences:+Influence+of+Shear+Stress.">Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).</li><li>Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pulmonary+Valve+Progenitor+Cells+Exhibit+Endothelial/Mesenchymal+Plasticity+in+Response+to+Vascular+Endothelial+Growth+Factor-A+and+Transforming+Growth+Factor-&#946;2.">Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-&#946;2.</a> Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).</li><li>Shi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells.">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92, 362-367 (1998).</li><li>Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+endothelial+progenitor+cells+are+derived+from+monocyte/macrophages+and+secrete+angiogenic+growth+factors.">Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors.</a> Circulation. 107, 1164-1169 (2003).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

밸브 모양의 생물학의 이해는 분리 기술적인 문제 및 밸브 모양의 내피 세포의 culturing 순수 인구에 의해 장애인되었습니다. 일반 절연 기술 기본 기초 매트릭스 또는 내피 접착 채권 2,3의 화학 분해 효소의 소화를 포함. 예비 분리 실험은 질적으로 분리 직원과 부화 기간 변화에 의해 평가되었다. 이러한 실험의 결과는 최대 60 분 동안 그 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (또는 트립신 -...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modified Eagle Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>50-103-PB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>26140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin Sodium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H4784-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington Biochemical</td>
<td>LS004176</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21300-058</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Tail Collagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354236</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Critical Swabs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89031-270</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>55761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T25 Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>353018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T75 Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>353136</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 Well Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>353047</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60x15 mm Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>25384-092</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60x15 Glass Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraffin Embedding Wax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>19304-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Precision Glide Needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences </td>
<td>305165</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>500 mL Nalgene Filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>73520-985</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1L Nalgene Filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>73520-986</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11023-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FSC Tweezers #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11295-00</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of valvular endothelial cells

심장 판막은 심장 혈관 시스템을 통해 단방향 혈액 흐름을 유지하는 책임은 전적으로 귀하에게 있습니다. 이 얇고 섬유질 조직들은 수명 동안 억 여러 번 열고 닫는 등 상당한 기계적 스트레스를 받게됩니다. 이러한 조직의 놀라운 인내력은 내피 거주 판막병 (VEC)와 중간 세포에 의한 (VIC)는 지속적으로 지방 기계 및 생물 학적 신호에 대한 응답으로 수리 및 개조. 최근 우리는 시험 관내 실험에서 중요한 역할을 담당해 왔습니다있는 이들 세포의 독특한 행동을 이해하기 시작했다. 특히 도전은 VEC의 격리와 문화입니다. 특별한주의는 순간부터 조직이 최종 도금을 통해 호스트에서 제거됩니다 사용해야합니다. 여기 우리는 직접적인 고립, 측면 구체적인 고립, 문화, VEC의 순수한 인구의 검증을위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 표면 세포를 이동시키다하는 부드러운 면봉 사장을 때릴 때의 기술 다음 효소 소화를 사용합니다. 이러한 세포는 다음 튜브에 수집하여 펠렛으로 centrifuged 있습니다. 펠렛은 다음 resuspended과 콜라겐 I 매트릭스 사전 코팅 문화 flasks로 도금입니다. VEC의 표현형가 접촉에 의해 확인하는 것은 성장과 같은 PECAM1 (CD31)로 내피 특정 마커의 표현을 저해, 폰 Willebrand 팩터 (vWF), 그리고 알파 - 부드러운 근육 굴지 (α - SMA)의 부정적인 표현. VEC의 기능적 특성은 acetylated LDL 높은 수준의와 관련된 있습니다. 혈관 내피 세포와는 달리, VEC는 일반적으로 배아 밸브 형성 한 동안 발생 mesenchyme로 변환하는 독특한 능력을했습니다. 이것은 또한 체외 문화에 크게 연장 게시물 합류하는 동안 발생할 수 있으므로주의가 합류 또는 가까운 통로로하여야한다. VEC 분리 후, VIC의 순수한 인구 그때 쉽게 취득하실 수 있습니다.

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Isolation of Valvular Endothelial Cells

우리는 분리하고 심장 밸브 내피 세포 (VEC)의 culturing 순수한 인구를위한 방법을 제공합니다. VEC는 (雨 期) 또는 전단지의 양쪽으로부터 격리하고 즉시 다음과 같은 수 있습니다 기본 중간 세포 (VIC) 격리는 간단합니다.

판막병 내피 세포의 분리

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Research

JoVE Journal

Biology

20.3K 조회수.  Cornell University. 우리는 분리하고 심장 밸브 내피 세포 (VEC)의 culturing 순수한 인구를위한 방법을 제공합니다. VEC는 (雨 期) 또는 전단지의 양쪽으로부터 격리하고 즉시 다음과 같은 수 있습니다 기본 중간 세포 (VIC) 격리는 간단합니다.

비디오: Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

인간 제대 베인 내피 세포의 절연 (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

연구

생물학

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

조류 배아 판막병 전구 세포의 분리 및 문화

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

배아 심실 내피 세포의 분리

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

마우스 저항 동맥의 미세 혈관 내피 튜브의 분리

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

마우스 관상 내피 세포의 분리

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

소형 돼지에서 1 차 대동맥 내피 세포의 격리 및 배양

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...