이 작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 (BBSRC), 왕립 학회와 노팅엄 대학에서 지원됩니다.

Mant 표지 된 뉴클레오티드의 결합에 따라 형광 강도의 변화의 1 결정. <ol><li> 적절한 반응 버퍼에 1 μM의 키네신 (최종 농도)에 1 μM의 mant 표지 뉴클레오티드를 추가합니다. 일반적으로 미세 소관의 성장과 안정성을 혜택을 버퍼 (설명을 참조)이 사용됩니다. 일반적으로 사용되는 버퍼 80MM 피페 라진 비스-2-에탄 술폰산 (PIPES)가 포함 pH6.9, 1mM의 MgCl2를 및 1mM의 에틸렌 글리콜 비스-2-아미노 에테르 디아민 테트라 아세트산 (EGTA). 참고 : 모든 프로토콜에 명시된 키네신의 농도는 염기 결합 부위 (즉, 모터 도메인)의 농도를 의미한다. 다른 키네신은 단량체, 이량 체 또는 테트라로 존재 등 분자 당 하나 이상의 뉴클레오티드 바인딩 사이트를 포함 할 수 있습니다. </li><li> 잠복기 (1-3 분) 및 표준 fluorimeter 사용 후 mant 표지 된 뉴클레오티드 키네신 컴플렉스의 발광 스펙트럼을 측정한다. 365NM의 여기 파장을 사용측정 단위는 1nm 400-500 nm의 빛을 방출. </li><li> 단계 1.1에서 사용 된 것과 동일한 반응 완충액가 1mm의 용액 mant 표지 된 뉴클레오티드를 확인. </li><li> 전술 한 바와 같이, mant 뉴클레오티드에만 샘플 발광 스펙트럼을 측정한다 (단계 1.2 참조). </li><li> 이 값을 통해 나누어 (키네신없이 즉,) 용액 mant 뉴클레오티드의 형광 스펙트럼의 피크 강도의 파장에서 신호 스펙트럼을 정규화. </li><li> (예를 들어, 그림 2B)가 mantATP 바인딩 및 / 또는 솔루션 mantADP 바인딩 키네신과 mant 염기 사이의 형광 강도의 차이를 관찰하기 위해 정규화 된 스펙트럼을 그린다. </li></ol> mantATP 협회 및 해리 속도 상수의 2 측정 <ol><li> - 무료 버퍼 2 + 적절한 마그네슘 최대 20 μM의 키네신 (설명 참조)의 용액에 (예를 들어, 80MM 파이프 pH6.9, 1mM의 EGTA, 0.1 % 트윈 20) 하나를 추가MM은 (최종 농도) 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 및 1 ㎜ (최종 농도) 디티 오 트레이 톨 (DTT). 참고 :이 감소로 버퍼에 트윈 20의 추가 권장 / 버퍼 교환을 위해 사용되는 열을 키네신 단백질의 손실을 방지하는 단계 (2.3 및 3.3) </li><li> 15 분 동안 25 ° C에서 솔루션을 품어. </li><li> (물질의 목록 참조) 제조업체의 지침에 따라 중력 흐름 G-25 세파 덱스 겔 여과 컬럼을 사용하여 키네신에서 별도의 무료 염기 및 EDTA. <ol><li> 적절한의 Mg 2 + 불 함유 버퍼의 적어도 3 컬럼 부피로 컬럼을 평형화 (단계 2.1 참조). 컬럼 상에 키네신 함유 용액을로드합니다. 염화 마그네슘의 최종 농도는 용액 키네신의 컬렉션 후 1 ㎜가되도록, 빈 튜브 100mm의 염화 마그네슘 용액의 적합한 양을 첨가하여 포집 관을 준비한다. 마그네슘 클로라이드의 직접 첨가 열차 단 도움염기가없는 키네신을 SE는. </li><li> 적절한의 Mg 2 + 불 함유 완충액을 사용하여 용출 키네신. 빠르게 작업 할 때 중요하므로 염기의 무료 키네신은 불안정하다. 얼음에 염기가없는 키네신을 저장하고 1 ~ 2 시간 이내에 사용한다. </li></ol></li><li> 중이나 종래 뉴클레오티드 프리 키네신의 준비로, 염기 무 키네신의 최종 용액과 동일한 반응 완충액의 농도 mantATP 시리즈를 준비한다. 0.1 ~ 50 μM (단계 2.5 및 설명을 참조)에 이르기까지 전형적인 시리즈 키네신의 사용 가능한 농도에 따라 필요한 mantATP의 농도의 범위를 결정합니다. </li><li> 염기가없는 키네신의 농도 시리즈를 준비합니다. mantATP의 각 농도 (단계 2.4)의 경우, 무 염기 키네신의 농도 mant 표지 된 뉴클레오티드가 키네신 뉴클레오티드 결합 부위 위에 5-10 배 몰 과량이되도록 제조한다. </li><li> 정지-FLO에 여기 파장을 설정365 ㎚에 fluorimeter w 및 긴 - 패스 필터를 사용하여&gt; 400 nm에서 방출 된 광을 수집한다. </li><li> 정지 흐름 fluorimeter (그림 3a 및 3b 삽입 된)를 사용하여 1 V / V 비율 : mantATP의 가장 낮은 농도부터 하나의 염기가없는 키네신의 적절한 농도 mantATP을 섞는다. 참고 : 반응물이 혼합에 50 % 희석된다. 혼동을 피하기 위해 염기 농도 모두 사전 및 사후 혼합 (즉, 3.0 / 1.5 μM)를 기록해 두십시오. </li><li> mant기로 photobleaching에 설명하기 위해, 지수 함수를 더한 일정한 음의 기울기의 선에 mantATP의 각 농도에서 측정 된 형광 강도의 변화를 장착한다 (즉, 형광 공 .EXP (OBS .T를 K) + (m를 =. t + 0 진폭 C), 케이 OBS는 속도 상수이고, t는) 그림 (b)와 토론을 볼 시간입니다. 이러한 맞는에서를 결정mantATP 각각의 농도에서 상수 (k 개의 OBS)를 평가했습니다. 각 케이 OBS는 협회와 해리 속도 상수 (그림 1, K 1과 K-1)의 컨볼 루션이다. </li><li> (예를 들어, 그림 3C) mantATP 농도에 대해 케이 OBS 음모를 꾸미고하여 협회와 해리 속도 상수를 Deconvolve. 기울기와 y 축 절편을 얻기 위해 선형 함수 (즉, 케이 OBS = K 1 [mantATP] + K-1)에이 데이터를 맞 춥니 다. 그라디언트 단위 M -1의 -1과 mantATP 협회 (그림 1, K 1)에 대한 속도 상수를 나타낸다. 절편들 -1 (논의를 참조)의 단위와 해리 속도 상수 (도 1, K -1)을 나타낸다. 이 접근법은 또한 ADP 협회 및 해리를 결정하기 위해 적용될 수있다 : 참고염기로 mantADP를 사용하여 속도 상수 (그림 1, K -4 K 4). </li></ol> mantADP의 해리 속도의 3 측정 상수 <ol><li> 적합한 반응 완충액 2 μM의 키네신의 용액에 (예를 들면, 80 밀리미터 PIPES pH6.9, 1mM의 MgCl2를, 1mM의 EGTA는 0.1 % 트윈 20), 50 μM mantADP (최종 농도)를 추가한다. </li><li> 30 분 동안 25 ℃로 품어. </li><li> G-25 세파 덱스 컬럼을 사용하여 선택한 반응 버퍼에 키네신를 교환 버퍼에 의해 초과 mantADP 및 기타 무료 염기를 제거 제조업체의 지침에 따라 (물질의 목록 참조). 키네신 모터 도메인은 지금 mantADP로드해야합니다. </li><li> 365 ㎚에 정지 흐름 fluorimeter에 여기 파장을 설정하고 긴 통과 필터를 사용하여&gt; 400 nm에서 방출 된 광을 수집한다. </li><li> 50 배 이상 MOLA으로 mantADP.kinesin 단지 (~ 1μM)를 혼합정지 흐름 fluorimeter (그림 4a 및도 4b 삽입 된)를 사용하여 1 V / V 비율 : 1에서 레이블이없는 ATP의 R 초과. </li><li> 단일 지수 함수 플러스 mant 그룹의 광표백를 고려하여 일정한 음의 기울기의 라인에 시간이 지남에 따라 관찰 형광 강도의 감소를 장착한다 (즉, 형광 공 .EXP (OBS .T를 K) + (m.t +를 = 공은 진폭 여기서 c), 케이 OBS는 속도 상수이고, t는 시간,) 그림 (b)와 토론을 참조하십시오. 이 피트로부터 결정된 k 개의 S는 OBS -1 (논의를 참조)의 단위 ADP (도 1, K 4)의 해리에 대한 속도 상수이다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

여기에, 우리는 키네신에 대한 염기 상태 사이의 전환 역학의 관​​찰 및 분석을위한 프로토콜을 제시한다. 이러한 프로토콜은 형광 표지 뉴클레오티드와 함께 급속 혼합 방법 정지 흐름을 이용한다. 이 유형의 방법은 키네신 9-11,13-16의 다양한 뉴클레오티드가 결합 및 해리 공부 광범위하게 사용되어왔다. 인산 릴리스 (그림 1, 3 단계)의 관찰을 허용하지 설명하는 방법. 그러나, 정지 흐름 형광은 형광 강도의 변화 (17)에 결합하도록 인산염의 인산염 생산을 감지 단백질을 이용하여 이러한 전환을 관찰하기 위해 사용될 수있다. 단백질에 결합 할 때, 일반적으로 형광 강도의 증가를 나타내는 작은 형광 단 methylanthraniloyl (mant)로 표지 뉴클레오티드를 이용 제시 방법. 또한, mant의 형광체는, 경우에 R 2 &#39;또는 3&#39;위치 중 하나에 접합ibose 종종 염기 9-12의 결합, 분해 또는 가수 분해에 거의 또는 전혀 효과가 있습니다. Mant 표지 뉴클레오티드는 상업 소스 (재료의 목록 참조)에서 쉽게 사용할 수있는 단일 이성질체 8 정제 할 때 빠르게 다시 평형으로 2 &#39;및 3&#39;복합체의 혼합물로 제공됩니다. Mant 표지 뉴클레오티드는 염기 결합과 분해의 반응 속도를 관찰 할 수있는 훌륭한 기자 분자를 확인합니다. 형광 표지 된 뉴클레오티드의 사용은 기재된 분석에서 형광 강도의 실시간 변경을 판독한다는 것을 의미한다. 이는 시약의 신속한 혼합과 후속 반응과 관련된 형광의 변화를 실시간 관찰을 허용 정지 흐름 형광, 이러한 분석에 적합하다. 검출의 방법으로서 혼합 기술과 같은 형광 정지 흐름의 조합이 상대적으로 샘플 EF 인 시스템을 생산ficient. 예를 들어, 0.8 필요도 3c에 도시 된 데이터를 획득하기 위해 - 정제 키네신-13 1.0 mg의, MCAK는,도 4b에 도시 된 데이터를 획득하는 것은 ~ 정제 키네신-13, MCAK 0.3 밀리그램을 필요로한다. 형광 물질로서 mant의 사용의 한 가지 단점은 photobleaching에 경향이 있다는 것이다. 이것은 정지 흐름에서, 키네신의 부재 하에서, 반응 완충액 mant 표지 된 뉴클레오티드의 용액을 혼합하여, 반응 동력학을 키네신 분리하여 관찰 될 수있다. mant 그룹이 표백 된대로 형광 강도의 느린 감소는 관찰된다. mant 그룹의 광표백을 설명한 프로토콜에 사용되는 시간의 척도의 범위에서 잘 선형 함수에 의해 설명된다. 따라서, 광표백에 대한 데이터를 보정하는 방법은 단순한 하나의 파라미터에 의해 설명 된 선형 함수 (즉, MT + c)가 아닌 일반적인 평평한 기준선에 의해 설명 기준선 지수 함수로 적합 할 것이다. mantATP 바인딩 mantATP 협회와 해리에 대한 속도 상수 미세 소관의 부재에서 키네신 뉴클레오티드 바인딩 사이트와 연결된 상태를 유지 (2 절) ADP를 측정 할 때 제거해야합니다. 이 mantATP 협회와 해리 (그림 1, 1 단계) ADP 해리 분리하여 관찰 할 수 있습니다. 이 키네신은 뉴클레오티드 결합 부위 (단계 2.1)를 통해 EDTA의 적어도 50 배 과량 인큐베이션 달성했다. EDTA는 마그네슘 2 + 이온은 염기 (11)의 방출을 초래 염기 결합 주머니에서 해리의 Mg 2 +를 일으키는 원인이 담즙산. 수행은 2.1 단계 때 따라서, - 2.3, 그것은 2 +의 Mg 무료 버퍼를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 염기가없는 키네신 단백질은 버퍼가 무료 염기로부터 EDTA에서 모두를 분리하는 교환이다. 이 분리, 일회용 중력 흐름 GE를 달성하기리터의 여과 열은 충분하며, 간단하고 (물질의 목록 참조)를 사용하는 것이 빠르다. 자유 염기와 mantATP 키네신의 상호 작용과 연관 해리 속도 상수 (단계 2.8)의 컨벌루션 있도록 mantATP 농도 (단계 2.4)의 범위에서 수행된다. 이러한 유형의 실험 뒤에 이론은 잘 하나 mantATP의 낮은 농도로 시작이 실험을 수행하는 참고 문헌 18에 기재되어있다. 이것은 다른 농도 사이의 세척 단계의 필요성을 제거합니다. 그것은 가능성 mantATP 농도가 증가함에 따라 중지 흐름 fluorimeter의 감도를 조정하는 것이 필요하다. mantATP 농도는 항상 의사 일차 조건을 유지하기 키네신 뉴클레오티드 결합 부위의 농도에서 최소한 5 배를 초과해야한다. mantATP의 농도가 증가함에 그러나, 신호 변화가 감소 키네신에 결합 뉴클레오티드의 분수로 일손이 될 수있다. Therefo, 키네신의 농도는 각각의 새로운 mantATP 농도 증가 mantATP 재 등의 농도는 뉴클레오티드 결합 부위 (단계 2.6) 이상으로 10 배 몰 과량보다 결코 크다고. mantADP 해리 mantADP 협회 및 해리 속도 상수는 mantATP (섹션 2)에서 기술 한 바와 동일한 방법에 의해 측정 될 수 있지만. 키네신로부터 ADP의 해리 직접 mantADP.kinesin 착체이어서 비 표지 ATP (단계 3.5)의 과량 혼합 mantADP (단계 3.1-3.3)와 뉴클레오티드 결합 부위를 미리로드에 의해 관찰 될 수있다. 초과 레이블이없는 ATP는 키네신에 mantADP의 리 바인딩을 방지함으로써 mantADP 협회에서 분리에서 관찰 할 수있는 해리 반응 (그림 1, K 사)를 할 수 있습니다. 이 분석에서, 비 표지 ATP의 농도는 NUC의 적어도 50 배 몰 과량이어야결합 부위를 leotide. 이 분석 배후 이론은 잘 이러한 직접적인 방법은 단계 2.8에서 설명 된 Y-축에 외삽 상수보다 해리 속도에 대한 정확한 값을 제공 레퍼런스 18에서 설명된다. 미세 소관의 포함 설명 된 방법은 또한 미세 소관의 존재하에 염기의 결합 및 해리 동력학을 결정하는데 사용될 수있다. 미세 소관 전에 중지 흐름에 혼합에 염기가 포함 주사기 소개 : 그림 (b)와 (b)에서 낮은 주사기 (인 세트). 이 미세 소관을 만족시키는이 구성에서, 키네신은 동시에 뉴클레오티드를 만날 것이다. 안정화 된 미세 소관은 튜 불린 중합체의 수명은 안정화 화학, 하나의 사용에 의해 확장되는 경우, 사용되는 예컨대 &#39;구아노 신-5와 같은 탁솔 또는 nonhydrolysable GTP 유사체뿐만 - [(α, β) -methyleno] 삼인산 (GMPCPP는 물질의 목록 참조). 이는 액체 질소 9,19에서 수개월 동안 저장 될 수 있도록 미세 소관 GMPCPP와 튜 불린 중합의 2 사이클을 사용하는 것이 가능하다. 미리 제조 된 미세 소관의 사용은 상당히 이러한 분석을 수행하기에 실용적 어려움을 감소시킨다. 분석에서 미세 소관을 포함하기 위해, 미세 소관 안정에 적합한 반응 완충액을 사용하는 것이 중요하다. 선택의 버퍼 (BRB80라고도 함) 80 mM의 PIPES의 pH를 6.9, 1 mM의 MgCl2를 1 mM의 EGTA (20, 21)을 포함하는 가장 일반적으로 사용되는 버퍼 기반 PIPES이다. 설명 된 방법은 키네신과 사용이 제한되지 않지만, 구성된 모든 뉴클레오티드 결합 단백질에 적용될 수있다. 예를 들어, 유사한 방법 분자 모터 (12,22)의 미오신 가족 mant 구아노 신 표지 된 뉴클레오티드의 사용의 상기 연장 부재의 ATP 회전율 사이클에 적용된이 유형의 방법은 단백질 23,24 GTP 가수 분해한다.

키네신은 고도로 보존 된 모터 도메인 한 것을 특징으로하는 단백질의 슈퍼 패밀리이다. 키네신 모터 도메인은 뉴클레오티드 의존적으로 미세 소관과 상호 작용한다. 키네신 가족의 구성원은 미세 소관 역학 2,3를 조절 비 전좌 미세 소관 최종 바인딩 키네신에 미세 소관을 따라 감독 방식으로화물을 운반 전좌 키네신,,,에서 기능의 범위를 표시합니다. 키네신은 4-6 세포 골격 미세 소관 (microtubule)과의 상호 작용을 조절하는 adensosine-5&#39;-삼인산 (ATP)의 매출을 사용합니다. ATP, ADP, ADP.Pi 또는 전혀 염기가 결합 될 수있다 (그림 1) : 미세 소관의 키네신 모터 도메인 때문에 친화력의 형태는 염기 상태에 따라 다릅니다. 키네신의 분자 적 메커니즘을 이해하기 위해, ATP 회전율 미세 소관과 상호 관계의 이해가 필요하다.refore은 키네신 필드의 주요 목적은 상이한 뉴클레오티드 상태의 기능적 특성 및 미세 소관의 존재 및 부재하에 둘 사이에 전환 동력학을 특성화하는 것이다. <img alt="그림 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" /> 키네신에 대한 간단한 ATP 턴 오버주기 그림 1은 네 가지 상태로 구성됩니다. 염기가없는 (Φ) 사 전환의 각각은 순방향 및 특징, ADP.P 내가 -bound, ATP가 바인딩과 ADP가 결합 된 역방향 속도 상수 (K x 및 각각 -x K). ATP 회전율의 화학 사이클 미세 소관의 기계적 상호 작용 사이클에 결합되는 방법을 이해하기 위해서는, 하나의 레이트 microtub 부재 제한 ATP 회전율주기의 어느 단계를 결정해야한다개 모듈은 다음 사이클이 미세 소관의 존재에 의해 변경되는 방식을 결정합니다. 가장 간단한 ATP 턴 오버주기는 네 개별 화학 물질 단계로 구성 : (1) ATP가 빈 사이트에 바인딩 (Φ가 빈 사이트, 즉 염기없는 키네신을 의미한다); (2) ATP 분열; (3) 인산의 해리 및 (4) ADP 해리 (도 1). 속도 제한 단계는 완전한 사이클 ATP 턴 오버에 대한 속도 상수를 설정한다. 따라서, 각각의 천이 각각 측정하고 완전한 사이클에 대한 속도 상수에 비교해야 속도 제한이있는 단계를 결정한다. 방법은 여기서 설명되지 않은 전반적 ATP 회전율 사이클 속도 상수를 측정 할 수 있지만 여기에 참고 7에서 발견 될 수 있고, 우리는 각각의 단계에 대한 화학적 반응 속도 상수를 판별 할 수있는 방법을 설명한다. 염기 가수 분해 단백질의 정점에서 개개의 전환주기를 연구하는 데 사용할 다수의 방법이있다. 여기에 제시된 방법은 advantag을형광 물질로 표지 된 methylanthraniloyl 뉴클레오티드의 특성 예는, 일반적으로 단백질 (8)에 결합시 형광 강도의 변화를 표시 mant, 라. 그것의 작은 크기는 리보오스 (도 2A)에 결합 될 때, 그것은 일반적으로 뉴클레오티드 결합 또는 9-12의 가수 분해 반응 속도에 거의 또는 전혀 효과를 가지고 있음을 의미하기 때문 mant 그룹이 사용된다. 여기서는 키네신의 ATP 턴 오버주기 뉴클레오티드 결합 및 분리의 관찰을 할 수 있도록 정지 흐름과 결합해서 형광 mant-표지 된 뉴클레오티드의 사용을 기술하는 프로토콜을 제시한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="781">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:279px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;triphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-202</td>
			<td style="width:279px;">mantATP</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;-diphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-201</td>
			<td style="width:279px;">mantADP</td>
		</tr>
		<tr height="134">
			<td height="134" style="height:134px;width:220px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:147px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;"># 10519979001</td>
			<td style="width:279px;">The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100&#160;mM in 100&#160;mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260&#160;nm (e = 15400&#160;M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20&#160;oC.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP120-500</td>
			<td style="width:279px;">0.5&#160;M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:220px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:147px;">Melford</td>
			<td style="width:136px;">MB1015</td>
			<td style="width:279px;">1&#160;M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">NAP-5 column</td>
			<td style="width:147px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;"># 17-0853</td>
			<td style="width:279px;">G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:220px;">GMPCPP</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-405</td>
			<td style="width:279px;">nonhydrolysable analogue of GTP</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:220px;">Stopped-flow fluorimeter&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Applied Photophysics</td>
			<td style="width:136px;">SX20</td>
			<td style="width:279px;">A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1&#160;-&#160;100&#160;s to be monitored.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins

미세 소관 관련 모터 단백질의 키네신 상과는 모두 ATP를 가수 분해하고 미세 소관을 결합하는 특성 모터 도메인을 공유 할 수 있습니다. 키네신은 ATP 매출 및 미세 소관의 상호 작용의 두 거대 집단에서 차이를 표시합니다. 이러한 차이는화물 운송, 미세 소관 슬라이딩, 미세 소관 해중합 및 미세 소관 안정화 등 다양한 기능을 특정 키네신을 조정. 키네신의 작용 기전을 이해하기 위하여는 ATP 회전율의 화학 사이클은 미세 소관의 기계적 상호 작용 사이클에 연결되는 방법을 이해하는 것이 중요하다. ATP 턴 오버주기를 해부, 하나의 접근 방식은주기의 각 단계를 시각화하는 형광 표지 뉴클레오티드를 이용하는 것이다. ATP 회전율주기의 각 염기 전환의 반응 속도를 결정하는 것은 완전한 사이클을 식별 할 수에 대한 속도 제한 단계 또는 단계를 할 수 있습니다. 키네신, 그것은에서 속도 - 제한 단계를 아는 것이 중요키네신은 미세 소관과 함께 상호 작용할 때 미세 소관의 부재는,이 단계는 일반적으로 수천 배로 촉진되어있다. 미세 소관의 부재주기를 완전히 키네신의 ATP 회전율 사이클을 이해하는 미세 소관의 존재 하에서 그와 비교된다. 개별 뉴클레오티드 천이 속도론은 일반적으로 수동 특히 미세 소관의 존재 하에서 반응물을 혼합하여 관찰 너무 빠르다. 급속한 혼합 장치는, 예컨대 동역학은 수 밀리 초만큼 약간의 시간 척도에서 관찰 될 수 있도록 정지 흐름 fluorimeter으로, 그러한 천이를 감시하는데 사용될 수있다. 여기서는 정지 흐름에 의한 시약의 급속 혼합은 키네신의 ATP 턴 오버주기를 해부 형광 표지 뉴클레오티드와 함께 사용되는 프로토콜을 기술한다.

mant 군의 형광 강도의 증가는 통상적으로 키네신 mant 표지 된 뉴클레오티드의 결합시에 관찰된다. 그러나, 이러한 신호 변화의 크기가 문제가되는 특정 키네신에 의존한다. 따라서, 운동 분석을 진행하기 전에 형광 강도의 변화의 유무와 크기를 모두 확인 평형 측정을 수행하는 것이 유용하다. mantATP 및 mantADP 대표적인 형광 스펙트럼, 솔루션 및 키네신-13, MCAK 복잡한 모두, 그림 (b)에 표시됩니다. 이러한 데이터는 MCAK 바인딩시 mantATP과 mantADP 모두 표시 형광 강도 증가를 강조. 키네신에 mant 염기의 결합에 따라 형광 강도의 변화는 협회와 ATP와 ADP 모두의 해리에보고하는 데 사용됩니다 (제 2 조 및 제 3). MCAK의 경우에는 형광 강도의 차이는 mantATP.kinesin 및 mantADP.kinesin 사이 관찰 <sup&gt; 9. 도 3a는 뉴클레오티드 프리 mantATP 키네신과 혼합시에 발생하는 반응을 나타낸다. 키네신 mantATP-13의 결합시 발생하는 형광 강도의 증가를 나타내는 데이터는 주제, MCAK는도 3b에 도시된다. 도 3b에 도시 된 형태의 데이터 mantATP 농도의 범위에서 수집된다. mantATP 농도 대 결정된 속도 상수 (k 개의 OBS)의 플롯은 그림 3C에 표시됩니다. 선형 함수에 이러한 데이터를 피팅 (즉, 케이 OBS = K 1 [mantATP] + K -1) OBS를 (2.8 단계) K에 기여 속도 상수의 디컨 볼 루션을 할 수 있습니다. 따라서, 연관 및 mantATP 대한 해리 속도 상수 모두의 결정을 가능하게 (도 1, K 1 및 K <em&gt; -1 각각). 도 4a는 비 표지 ATP의 과량 mantADP.kinesin 혼합시에 발생하는 반응을 나타낸다. 도 4b의 데이터는 키네신-13, MCAK로부터 해리시 mantADP 관찰 형광 강도의 감소를 나타낸다. mantADP의 해리에 대해 (단계 3.6)의 지수 함수에 속도 상수를이 데이터를 피팅하여 결정된다. <img alt="그림이" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" /> 형광 물질의 methylanthraniloyl (mant)로 표지 그림 2 뉴클레오티드는 ATP 턴 오버주기의 각 단계를 분리하는 데 사용됩니다. 리보오스에 위치 2 &#39;또는 3&#39;중 하나에 접합 mant의 형광 물질의 위치를 보여주는 mantATP의 (A)의 구조. (B) 용액 (있는 no)에 대한 mantATP 및 mantADP 노멀라이징 형광 스펙트럼과 mantATP키네신 MCAK (mATP + MCAK 및 mADP + MCAK) 복잡한에서 D mantADP. mantATP 스펙트럼은 용액에 mantADP에 최대에 형광성 표준화 된 솔루션 mantATP에 대한 최대의 형광 mantADP 스펙트럼 정규화되어 있습니다. MCAK와 혼합 mant 뉴클레오티드의 스펙트럼은 1 분 후 혼합시 징수됩니다. 같은 프로토콜에 설명되어 시약 및 fluorimeter 설정의 농도는 1.1 및 1.2 단계를 반복합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" /> mantATP의 연결 속도 상수의 그림 3 측정. (A) 중단 흐름에 의해 장소 후 혼합한다 반응 묘사 설계도 : mantATP (mATP하는) 뉴클레오티드 무료로 키네신 결합. 단백질에 결합시 mant 그룹 증가 형광 강도. (B) 형광 신호 변화 (검정)과 mantATP MCAK (25 M) (5 M의 뉴 혼합시 관찰cleotide 무). 이 데이터는 (토론 참조) mant의 형광의 photobleaching에 대한 계정을 하나의 지수 함수 플러스 일정한 음의 기울기의 라인에 적합 (빨간색 점선)는 삽입 된 :. 전에 중지 흐름 fluorimeter에 혼합에 주사기의 내용. 염기가없는 MCAK와 mantATP의 반응에 대해 결정 (C) 속도 상수 (k 개의 OBS)는 mantATP의 농도 역모를 꾸몄다. 이 그래프는 M -1 (S)의 단위와 연관 속도 상수 (도 1, K, 1) 인 구배 -1 y 절편은 해리 속도 상수 인 (도 1, K-1)와 함께 선형 영역을 갖 의 단위 -1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> . mantADP 미리로드 키네신은 레이블이없는 ATP의 과잉으로 희석 : mantADP의 해리 속도 상수의 그림 4 측정 (A) 도식이 중지 흐름으로 자리 포스트 혼합 걸리는 반응을 묘사. 해리 mantADP함으로써 mantADP 협회 (논의를 참조)의 위로 반응을 예방, 비 표지 ATP에 의해 대체된다. mant 군의 형광 강도는 단백질로부터 해리 따라 감소한다. 키네신 MCAK mantADP로부터의 분리시에 관찰 (B) 형광 감소. 형광 신호 (블랙) (설명을 참조) mant기로 photobleaching에 대해 고려하여 단일의 지수 플러스 일정한 음의 기울기의 선에 맞는 (점선 적색)이다. 결정 속도 상수 mantADP (그림 1, K의 해리에 대한 속도 상수4) 삽입 된 :.. 중지 흐름 fluorimeter에 혼합하기 전에 주사기의 내용 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

키네신은 미세 소관과 염기에 의존하는 상호 작용에 의해 특징 : 미세 소관의 상호 작용의주기에 결합 ATP 매출의주기를. 여기서는 형광 표지 뉴클레오티드 및 정지 흐름 형광을 사용 키네신의 ATP 턴 오버주기 개별 뉴클레오티드 천이 동력학을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

형광 흐름 중지 및 레이블 뉴클레오티드의 사용은 키네신의 ATP 턴 오버주기를 분석하는

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

15.4K 조회수.  University of Nottingham.  키네신은 미세 소관과 염기에 의존하는 상호 작용에 의해 특징 : 미세 소관의 상호 작용의주기에 결합 ATP 매출의주기를. 여기서는 형광 표지 뉴클레오티드 및 정지 흐름 형광을 사용 키네신의 ATP 턴 오버주기 개별 뉴클레오티드 천이 동력학을 분석하는 프로토콜을 기술한다. 

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Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of molecular iodine to samarium metal in THF.1,2-3 It is a mild and selective single electron reductant and its versatility is a result of its ability to initiate a wide range of reductions including C-C bond-forming and cascade or sequential reactions. SmI2 can reduce a variety of functional groups including sulfoxides and sulfones, phosphine oxides, epoxides, alkyl and aryl halides, carbonyls, and conjugated double bonds.2-12 One of the fascinating features of SmI-2-mediated reactions is the ability to manipulate the outcome of reactions through the selective use of cosolvents or additives. In most instances, additives are essential in controlling the rate of reduction and the chemo- or stereoselectivity of reactions.13-14 Additives commonly utilized to fine tune the reactivity of SmI2 can be classified into three major groups: (1) Lewis bases (HMPA, other electron-donor ligands, chelating ethers, etc.), (2) proton sources (alcohols, water etc.), and (3) inorganic additives (Ni(acac)2, FeCl3, etc).3
Understanding the mechanism of SmI2 reactions and the role of the additives enables utilization of the full potential of the reagent in organic synthesis. The Sm-Barbier reaction is chosen to illustrate the synthetic importance and mechanistic role of two common additives: HMPA and Ni(II) in this reaction. The Sm-Barbier reaction is similar to the traditional Grignard reaction with the only difference being that the alkyl halide, carbonyl, and Sm reductant are mixed simultaneously in one pot.1,15 Examples of Sm-mediated Barbier reactions with a range of coupling partners have been reported,1,3,7,10,12 and have been utilized in key steps of the synthesis of large natural products.16,17 Previous studies on the effect of additives on SmI2 reactions have shown that HMPA enhances the reduction potential of SmI2 by coordinating to the samarium metal center, producing a more powerful,13-14,18 sterically encumbered reductant19-21 and in some cases playing an integral role in post electron-transfer steps facilitating subsequent bond-forming events.22 In the Sm-Barbier reaction, HMPA has been shown to additionally activate the alkyl halide by forming a complex in a pre-equilibrium step.23
Ni(II) salts are a catalytic additive used frequently in Sm-mediated transformations.24-27 Though critical for success, the mechanistic role of Ni(II) was not known in these reactions. Recently it has been shown that SmI2 reduces Ni(II) to Ni(0), and the reaction is then carried out through organometallic Ni(0) chemistry.28
These mechanistic studies highlight that although the same Barbier product is obtained, the use of different additives in the SmI2 reaction drastically alters the mechanistic pathway of the reaction. The protocol for running these SmI2-initiated reactions is described.

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

A straightforward procedure for the preparation of samarium diiodide (SmI2) in THF is described. The role of two main additives namely hexamethylphosphoramide (HMPA) and Ni(acac)2 in Sm mediated reactions is demonstrated in the Sm-Barbier reaction.

준비와 사마륨 Diiodide 이용 (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) 유기 합성의 : 사마륨 Barbier 반응에 HMPA과 니켈 (II) 소금의 기계론의 역할

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

연구

화학

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

DNA의 Glycosylase 활동에 대한 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 운동 측정

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

형광 기반 얼음 비행기 선호도에 의해 부동액 단백질의 얼음 결합 평면 결정

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

임신 중 쥐의 간 조직에서 지방산의 작곡 변화를 분석하는 가스 크로마토 그래피의 사용

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

프로 형광 기판 아날로그를 통해 PAD4 활동의 형광 기반의 모니터링

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Preparation and Use of Carbonyl-decorated Carbenes in the Activation of White Phosphorus

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures in multi-gram scale quantities. The goal of this manuscript is to clearly detail how to handle and prepare these unique carbenes such that a synthetic chemist of any skill level can work with them. The two carbenes described are a diamidocarbene (DAC, carbene 1) and a monoamidoaminocarbene (MAAC 2). These carbenes are highly electron-deficient and as such display reactivity profiles that are atypical of more traditional N-heterocyclic carbenes. Additionally, these two carbenes only differ in their electrophilic character and not their steric parameters, making them ideal for studying how carbene electronics influence reactivity. To demonstrate this phenomenon, we are also describing the activation of white phosphorus (P4) using these carbenes. Depending on the carbene used, two very different phosphorus-containing compounds can be isolated. When the DAC 1 is used, a tris(phosphaalkenyl)phosphane can be isolated as the exclusive product. Remarkably however, when MAAC 2 is added to P4 under identical reaction conditions, an unexpected carbene-supported P8&#160;allotrope of phosphorus is isolated exclusively. Mechanistic studies demonstrate that this carbene-supported P8allotrope forms via a [2+2] cycloaddition dimerization of a transient diphosphene which has been trapped by treatment with 2,3-dimethyl-1,3-butadiene.

Here, we present a protocol for the synthesis of two carbonyl-decorated carbenes. The protocol makes these interesting compounds readily available to chemists of all skill levels. In addition to the synthesis of these two carbenes, their use in the activation of white phosphorus is also described.

화이트 인의 활성화에 카르 보닐 장식 카르 벤의 제조 및 사용

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET radiopharmaceuticals. Due to their multi-day biological half-life, antibodies must be labeled with positron-emitting radionuclides with relatively long physical decay half-lives. Traditionally, the positron-emitting isotopes 124I (t1/2 = 4.18 d), 86Y (t1/2 = 14.7 hr), and 64Cu (t1/2 = 12.7 hr) have been used to label antibodies for PET imaging. More recently, however, the field has witnessed a dramatic increase in the use of the positron-emitting radiometal 89Zr in antibody-based PET imaging agents. 89Zr is a nearly ideal radioisotope for PET imaging with immunoconjugates, as it possesses a physical half-life (t1/2 = 78.4 hr) that is compatible with the in vivo pharmacokinetics of antibodies and emits a relatively low energy positron that produces high resolution images. Furthermore, antibodies can be straightforwardly labeled with 89Zr using the siderophore-derived chelator desferrioxamine (DFO). In this protocol, the prostate-specific membrane antigen targeting antibody J591 will be used as a model system to illustrate (1) the bioconjugation of the bifunctional chelator DFO-isothiocyanate to an antibody, (2) the radiosynthesis and purification of a 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate, and (3) in vivo PET imaging with an 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in a murine model of cancer.

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

바이오 콘쥬 게이션과의 Radiosynthesis<sup&gt; 89</sup&gt; ZR-DFO 표지 항체

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass spectrometer, it is necessary to characterize and understand the physical principles of the source. Most commercial ambient ionization sources utilize jets of nitrogen, helium, or atmospheric air to facilitate the ionization of the analyte. As a consequence, schlieren photography can be used to visualize the gas streams by exploiting the differences in refractive index between the streams and ambient air for visualization in real time. The basic setup requires a camera, mirror, flashlight, and razor blade. When properly configured, a real time image of the source is observed by watching its reflection. This allows for insight into the mechanism of action in the source, and pathways to its optimization can be elucidated. Light is shed on an otherwise invisible situation.

This paper presents a protocol for the visualization of gaseous streams of an ambient ionization source using schlieren photography and mass spectrometry.

슐 리렌 사진의 사용과 주변 질량 분석의 시각화

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

를 사용하여 금 나노 입자의 효율적인 방사성 표지를위한 최적화 된 프로토콜<sup&gt; (125)</sup&gt; I-표시 아 지드 보철 그룹

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

준비 및 평가<sup&gt; 99m</sup&gt; Bioorthogonal 화학을 사용하여 사전이 타겟팅에 대한 세자리 킬레이트를 Tc를 표지

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...