저자는 도움이 대화를 교수 토마스 라이너, Jacob 박사 호튼 박사 서지 Lyaschenko 감사합니다.

설명 생체 내 동물 실험의 모든 승인 된 프로토콜과 기념 슬로안 케터링 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 윤리적 지침에 따라 따라 수행 하였다. J591에 DFO-NCS 1. 활용 <ol><li> 1.7 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에서, 1X 인산 완충 생리 식염수 (PH 7.4), 0.5 M HEPES 완충액 (pH 7.4) 중 어느 하나를 1ml의 J591 2-5 ㎎ / ㎖의 용액을 제조 하였다. </li><li> 5 내지 10㎜ (3.8-7.6 ㎎ / ㎖)의 농도로 DMSO에 건조 DFO-NCS 녹인다. 초음파 처리 또는 소용돌이 완전히 용해를 용이하게하기 위해 충분히 용액. </li><li> 작은 분량 씩 0.1 M 나 2의 (&lt;10 μL) CO 3를 추가하여 8.8-9.0로 J591 용액의 pH를 조정합니다. </li><li> 항체 용액은 pH에서 올바른되면 관능 킬레이트 3-4 배 몰 과량 대응 DFO-NCS 용액의 볼륨. <ol><li> 시험을위한PLE, 2 ㎎ / ㎖ J591 항체 액 1 ㎖ (13.3 nmol의 J591)에 10 mM의 (7.6 ㎎ / ㎖) DFO-NCS 용액 (40.4 nmol의 DFO-NCS)의 4 ~ 5 μl를 추가합니다. 최종 수성 반응 혼합물에서 DMSO의 양은 2 % V / V를 초과하지 않아야한다. </li></ol></li><li> 350 rpm에서 교반 가열 블록에 37 ° C에서 30 분 동안 반응물을 인큐베이션. </li><li> 37 ° C에서 1 시간 후, 용리액으로서 0.5 M HEPES 완충액 (pH 7.4)을 사용하여 50,000 분자량 컷 - 오프로 미리 충전 일회용 탈염 크기 배제 컬럼을 사용하여 생성 된 면역 접합체를 정제. 이 단계는 완료 J591-DFO 구조의 2 ml의 솔루션을 얻을 것입니다. </li><li> 비스 - UV 분광 광도계에 구축 J591-DFO의 농도를 측정한다. </li><li> 구조물의 높은 농도가 요구되는 경우, 50,000 분자량 컷 - 오프로 원심 필터 유닛을 이용 J591-DFO 용액을 농축시킨다. </li><li> 어둠 속에서 -20 ° C에서 완성 된 J591-DFO의 면역 접합체의 솔루션을 저장합니다. </ol> 89 ZR 2. 방사성 표지 J591-DFO 주의 : 프로토콜의이 단계는 취급 및 방사능의 조작을 포함한다. 다음 단계를 수행하거나 자신의 집 기관의 방사선 안전 부서와상의해야합니다 방사능 연구자와 다른 작업을 수행하기 전에. 가능한 모든 단계는 이온화 방사선에 대한 노출을 최소화하기 위해주의해야한다. 참고 : 적절한 방사 화학 노트 유지의 관심에서, 샘플에서 방사능의 양을 투여 교정기를 사용하여 측정하고 이전에 기록되어야한다 아래의 프로토콜의 단계 2.2-2.13 후. 이 방사 화학적 수율 및 특정 활동의 정확한 결정에 도움이 될 것입니다. <ol><li> 0.5 M HEPES 버퍼, 산도 7.5의 200 μL에 J591-DFO의 0.5 ~ 2.0 mg의 용액을 준비합니다. </li><li> 의 볼륨을 피펫 &lt;2 ml의 플라스틱 스크류 캡 microcentrifuge 관에 1.0-6.0 mCi의 (37-222 MBq의)에 해당하는 (일반적으로 1.0 M 옥살산 공급) SUP&gt; 89 ZR 4+ 원액. 1.0 M 옥살산을 사용하여 총 300 μL이 용액의 양을 조정한다. </li><li> 1.0 M 나 2 CO 3를 사용하여 6.8-7.5로 89 ZR 4+ 용액의 pH를 조정합니다. 원하는 산도를 달성하기 위해베이스의 분량을 작은 (&lt;10 μL)를 추가 이후 89 ZR 4+ 솔루션 CO 3 1.0 M 나 2의 250 μl를 추가하여 시작합니다. </li><li> 2.1 단계에서 제조 된 J591-DFO 용액의 pH 조정 89 ZR 4+ 솔루션의 원하는 금액을 추가합니다. </li><li> 이 6.8-7.5의 목적하는 범위 내에 있도록 방사성 표지 된 반응 혼합물의 pH를 확인한다. </li><li> 350 rpm에서 교반 가열 블록에 실온에서 60 분 동안의 방사선 반응을 품어. </li><li> 인큐베이션 60 분 후, 측정 RAD무선-TLC를 이용하여 반응 수율을 iolabeling. <ol><li> 이를 위해, 실리카를 함침 TLC 스트립 방사성 표지 반응 혼합물을 1 μCi를 스팟. 50 mM의 DTPA (PH 5.5)의 전개 용매를 사용하여 TLC를 실행, 나누어지는 건조 할 수 있도록 허용하고, 무선 TLC 스캐너를 사용하여 TLC 스트립을 분석 할 수 있습니다. 89 ZR을 4+ 원점에 나타납니다 J591-DFO 구조에 결합 (R &lt;ZR 89 무료 4+ 양이온 DTPA에 의해 킬레이트 화되고 용매 앞 (R F를 용출 반면 0.1),&gt; 0.9) F. </li><li> , radiochromatogram 통합 곡선 아래의 총 면적으로 0.0-0.1 f를 R에서 곡선 아래의 영역을 분할하고, 100을 곱해서 반응하여 표지 수율을 계산한다. </li></ol></li><li> 방사성 표지 수율이 충분 (전형적으로&gt; mCi의 2 / MG의 이론적 비활성) 인 경우의 50 mM DTPA, pH가 5.5의 5 μL 반응물을 켄칭. </li><li> 그 결과 면역 접합체의 USI를 정화NG 5 ㎎ / ㎖ 겐티 론산 5 ㎎ / ㎖ 겐티 산 또는 0.25 M 아세트산 나트륨 (PH 5.5)을 0.9 % 멸균 식염수 중의 용리액을 사용하여 50,000 분자량 컷 - 오프와 함께 미리 포장 된 일회용 크기 배제 탈염 칼럼 . 이 단계는 완료 89 ZR-DFO-J591의 radioimmunoconjugate의 2 ml의 솔루션을 얻을 것입니다. </li><li> 단계 2.7에 기재된 바와 같이 정제 한 후, 무선 - TLC를 이용하여 89-DFO ZR-J591의 방사 화학적 순도를 확인한다. </li><li> 처음에 정제 (89) ZR-DFO-J591 radioimmunoconjugate 절연 된 방사능의 양에 의해 항체 용액에 첨가 활동량을 나누어 전체적인 반응하여 표지 수율을 계산한다. </li><li> 방사성 표지 반응에서 DFO-J591의 초기 질량 (89)에 의해 정제 ZR-DFO-J591의 radioimmunoconjugate 절연 활동량 나누어 최종 특이 적 활성을 계산한다. </li><li> 높은 농도의 원하는 경우, 번째 주력전자 89 50,000 분자량 컷 - 오프와 원심 필터 유닛을 사용하여 ZR-DFO-J591 솔루션입니다. 주 : 최종 정제 공정에서 사용 겐티 산 인해 방사선 분해에 항체의 열화를 최소화하기 위해 사용되는 무선 - 보호제 46 동안 4 ℃에서 최대 48 시간 동안 89 ZR-DFO-J591의 radioimmunoconjugate의 저장. 가능하며, 사용하지 않는 것이 좋습니다. radioimmunoconjugate이 저장 될 것이라면, 하이포 클로 라이트 - 매개 방사선 분해의 위험을 최소화하기 위해 저장 버퍼로서 5 ㎎ / ㎖ 겐티 산 0.25 M 아세트산 나트륨 (PH 5.5)를 사용한다. (47) </li></ol> 89 ZR-DFO-J591과 생체 PET 영상 3. 주의 : 프로토콜 섹션 2에서와 같이, 프로토콜의이 단계는 취급 및 방사능의 조작을 포함한다. 다음 단계를 수행하기 전에 연구자들은 자신의 집 기관의 방사선 안전 부서와상의해야합니다. 모든 possib제작 단계는 이온화 방사선에 대한 노출을 최소화하기 위해주의해야한다. <ol><li> 수컷 무 흉선 누드 마우스 피하 5 × 106 된 LNCaP 전립선 암세포 이식 및 이들 (3~4주 접종 후) 3 이종 100-150mm로 증가 할 수있다. 44 </li><li> 0.9 % 멸균 식염수, 1.0 mCi의 / ml의 농도로 89 ZR-DFO-J591 radioimmunoconjugate의 희석. </li><li> 89 ZR-DFO-J591 용액 (200 μCi를 7.4 MBq의) 200 ㎕를 주입한다. 이종 이식 베어링 마우스의 측면 꼬리 정맥에 48 </li><li> 촬상 원하는 시점에서 (예를 들어, 12, 24, 48, 72, 96, 또는 120 열연 후 분사), 2 % 이소 플루 란 마취 마우스 : 산소 가스 혼합물. </li><li> 작은 동물 PET 스캐너의 침대에 마우스를 놓고 1 % isoflurane을 사용하여 스캔하는 동안 마취를 유지 : 산소 가스 혼합물을. 스캐너 침대에 동물을 배치하기 전에, 토​​우 - 핀치 방법 및 출원을 이용하여 마취를 검증마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈 Y 안연고. 49 </li><li> 350-700 keV의 에너지의 창 6 나노초의 일치 타이밍 윈도우를 사용하여 4000 만 일치 이벤트 최소 정적 스캔을 통해 마우스 PET 데이터를 획득. 50 </li><li> 이미지의 인수를 완료 한 후, 무인 마우스를 벗어나지 않아이 의식을 회복 할 때까지 다른 마우스와 케이지로 변경하지 마십시오. </li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

건설, 방사성 표지, 및 이미징의 ZR-89-DFO labled radioimmunoconjugates이 다소 간단한 절차가 일반적이지만,이 프로세스의 각 단계에서 마음에 몇 가지 주요 고려 사항을 유지하는 것이 중요하다. 예를 들어, 아마도 절차 공액 단계 동안 우려 원인은 공액 반응 동안 항체의 집합이다. 이 문제는 대개 DFO-NCS 스톡 용액의 첨가 후 접합 반응의 불량한 혼합하는 제품이다.이 경우, DFO-NCS의 비균질 분포가...

인해 현저한 감도, 친화력 및 선택성으로, 항체는 긴 암 세포에 방사선 동위 원소의 전달을 위해 유망 벡터를 고려되었다. 그러나, 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상에의 응용들은 표지 용 적당한 양전자 방출 동위 원소의 부족에 의해 방해되어왔다. radioimmunoconjugates의 설계에서 가장 중요한 고려 사항 중 1-3 하나의 물리적 붕괴 매칭되는 하프 항체의 생체 내 약물 동태에 방사성 동위 원소의 생활. 보다 구체적으로, 항체는 종종 비교적 긴 멀티 일 생물학적 반감기를 가지므로 비교 물리적 반감기의 방사성 동위 원소로 표지되어야한다. PET 영상 응용 프로그램의 경우, 항체는 전통적으로 (64) 구리 (t 1/2 = 12.7 시간), (86) Y (t 1/2 = 14.7 시간), 또는 (124) I (t 1/2 = 4.18 D). (4) 방사성 동위 원소 표지왔다, 5 단, 각이러한 방사성 동위 원소 임상 영상에 대한 적합성을 방해 상당한 한계를 가지고있다. 86 Y 64 구리로 표지 radioimmunoconjugates 전임상 연구에서 유망한 입증하는 동안, 동위 원소는 인간의 이미지에 대한 효과가 너무 짧은 물리적 반감기를 가지고있다. (124) 나는 반면에,에 대한 거의 이상적인 물리적 반감기 항체 촬상 있지만 고가이고 상대적으로 낮은 해상도 이미지를 임상 적으로 이어질 차선 감쇠 특성을 갖는다. 또한, I-124 표지 radioimmunoconjugates는 생체 내 종양 대 배경 활성 비율을 낮출 수를 탈 할로겐 처리의 대상이 될 수있다. -6,7- 이 드라이브는 64 잘라 내기, (86) Y를 대체 할 수있는 양전자 방출 방사성 동위 원소를 발견하고, radioimmunoconjugates 124 전 89 ZR 표지 항체에 대한 연구의 급등을 자극했다. 8-12에게 T를89 ZR의 출현에 대한 그 이유는 간단하다 : 방사성 진단 PET의 radioimmunoconjugates에 사용하기 위해 가까운 이상적인 화학적 및 물리적 특성을 가지고 13 89 ZR은 89 Y (P, N)을 사용하여 사이클로트론에 89 ZR의 반응을 통해 생성된다. 시판되는 100 % 천연 풍부한 89 Y 타겟. 14,15 방사성은, 23 %의 양전자 수율을 갖는다 78.4 시간의 반감기로 붕괴 및 395.5 keV의 (도 1)의 비교적 낮은 에너지로 양전자를 방출한다. 그것은 89 13,16,17 ZR 또한 높은 에너지를 방출하는 것이 중요하고, 909 keV의 γ 선 99 % 효율. 방출이 방출 광자 511 keV의 에너지 적으로 방해하지 않는 반면, 전송, 처리, 선량에 대해서 고려를 필요 여분 않는다. 이 경고에도 불구하고, 이러한 부패의 특성은 궁극적으로 89 ZR이 더 유리한 시간을 가지고뿐만 아니라 의미구리 86 Y 64 이상 항체 이미징을위한 ALF 생활뿐만 아니라 더 높은 687, 975 케빈의 에너지뿐만 아니라의 100 ~ 150 keV의 내부 에너지와 광자의 번호와 양전자를 방출하는 124 I보다 높은 해상도의 이미지를 생성 할 수 있습니다 511 keV의 양전자 생성 된 광자. (13) 또한, 89 ZR은 방사성 옥소 대응보다 더 효과적으로 또한 종양, 처리 할 안전 생산 저렴하고 residualizes이다. 89의 Zr (18, 19) 하나의 잠재적 인 제한이없는 것입니다 isotopologue 치료, 예를 들면, Y (86) (PET) 90 대 Y (치료). 이것은 그들의 대응 치료 용 선량 정찰병으로 사용할 수있는 화학적으로 동일 대리 조영제의 구성을 배제한다. 그것은 말했다 조사는 89 ZR 표지 항체는 90 Y- 177 루 표지 면역 접합체에 대한 이미징 대리로 잠재력을 가지고 수행하는 것이 좋습니다.(20, 21) 화학적 인 관점에서, 그룹 IV 금속으로서, 89 ZR은 수용액 중의 양이온 +4로서 존재한다. ZR 4+ 이온은 높은, 비교적 큰 (유효 이온 반경 = 0.84 Å) 충전되고, &quot;하드&quot;양이온로 분류 될 수있다. 이와 같이, 여덟 하드 음이온 산소 도너 리간드 담까지 선호를 나타낸다. 쉽게 ZR-89 radioimmunoconjugates 표지에 사용되는 가장 일반적인 킬레이트가 desferrioxamine이다 (DFO), 세 그룹 히드 담지 시데로 포어 유래 비 환식 킬레이트. 리간드 안정적 생물학적 관련성의 pH 레벨에서 RT로 신속하고 깨끗하게 ZR 4+ 양이온을 조정하고, 생성 ZR-DFO 착체는 식염수, 혈청에서 여러 날에 걸쳐 안정적으로 유지하고, 전혈. 22 전산 연구가 강하게 시사 DFO는 금속 중심에 배위 세 neut되는 ZR 4+ hexacoordinate 복합체를 형성하도록RAL과 리간드의 세 음이온 산소 기증자뿐만 아니라 두 개의 외생 물 리간드 (그림 2). (23, 24) 89 ZR-DFO의 접합 발판을 사용 radioimmunoconjugates의 생체 내 행동은 일반적으로 우수한있다. 그러나 어떤 경우에는, 이미징 및 급성 생체 분포 연구는 89 ZR - 표지 된 항체를 주입 한 쥐의 뼈 높은 활동 수준, ZR 4+ 양이온은이어서 생체 내에서 킬레이트로부터 방출되고, 89 osteophilic가 mineralizes 제안 데이터를 밝혀냈다 뼈. 여덟 산소 도너가 문헌에 나타난 25 최근, 신규 ZR 89 4+ 킬레이트 제의 개발에 대한 조사의 수는 특히, 현재, 그럼에도 24,26,27. DFO 리간드는 가장 널리 사용되는 킬 레이터 89 넓은 여백에 의해 radioimmunoconjugates을 ZR은 표지. 다른 다양한바이오 콘쥬 게이션 전략 bioorthogonal 클릭 화학, 항체의 시스테인 구축 티올 반응 DFO의 반응, 에스테르 베어링 DFO는 항체에 라이신 구축 활성화의 반응을 포함하여, 항체 DFO를 연결하는 데 사용되어왔다. 4,28- 30 쉽게 가장 일반적인 방법은, 그러나, 22 견고이 시판 관능 킬레이트. DFO, DFO-NCS의 이소 티오 시아 네이트 - 함유 유도체의 사용을 (도 2)이었다 안정적의 리신으로 안정한 공유 결합 티오 우레아 결합을 형성했다 항체 (그림 3). 지난 몇 년 동안, 89 ZR-DFO - 표지 radioimmunoconjugates 다양한는 문헌에보고되어있다. 전임상 연구는 CD105-대상으로 T로 세툭시 맙, 베바 시주 맙과 트라 스투 주맙 난해한 항체로 더 잘 알려진 이르기까지 항체를 특징으로, 특히 풍부한되었습니다RC105 및 5A10을 FPSA를가 타겟팅. 30-36 최근 89 ZR-DFO 표지 된 항체를 사용하여 초기 단계의 임상 시험 소수 문헌에 등장했다. 89 ZR-DFO-cmAb의 U36, 89 ZR-DFO-ibritumomab의 tiuxetan, 89 ZR-DFO - 트라 스투 주맙. 21,32,37 또한, 89와 다른 임상 시험의 범위를 사용 특히, 네덜란드 그룹이 발행 한 시험 ZR 표지 radioimmunoconjugates 전립선 암 이미징 PSMA 타겟팅 89 ZR-DFO-J591과 유방암 이미징 HER2-대상으로 89 ZR-DFO - 트라 스투 주맙을 사용하여 기념 슬로안 케터링 암 센터에서 여기에 조사를 포함하여, 현재 진행되고있다. 23, 방사성 표지 된 항체는 가장 일반적인 ZR (89) 표지 된 방사성 의약품을 유지하면서 또 30, 방사성도 점점 펩티드, 단백질, 및 나노 물질을 포함하는 다른 벡터들과 함께 사용되어왔다. 38-43 </sup&gt; 이 89 ZR-DFO 라벨링 방법의 모듈화는 엄청난 자산입니다. 바이오 마커 타겟팅 항체의 레퍼토리는 끊임없이 확장하고, 이러한 구조를 사용하여 생체 PET 영상에서 공연에 대한 관심은 빨리 성장하고있다. 결과적으로, 우리는 더 표준화 된 방법 및 프로토콜이 개발 분야 이익을 얻을 수 있다고 믿고있다. DFO-NCS의 활용 89 지르코늄의 방사선 물질에 대한 우수한 기록 실험 프로토콜이 이미 Vosjan에 의해 출판 된, 등. (22) 우리는이 작품에서 제공하는 시각적 데모 더 이러한 기술에 새로운 연구자에게 도움이 될 수 있다고 생각합니다. 손 프로토콜, 전립선 특이 막 항원 표적 항체 J591은 예시 모델 시스템으로 사용한다 (1) 항체에 DFO - 이소 티오 시아 네이트 관능 킬레이트 바이오 콘쥬 게이션, 89 (2) radiosynthesis 정제 ZR-DFO-단클론 항체 radioimmunoconjugate,및 (3)에서 암의 뮤린 모델에서 ZR-89-DFO 단클론 radioimmunoconjugate 생체 내 PET 영상화. 23,44,45

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-SCN-Bn-DFO</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-705</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">[89Zr]Zr-oxalate</td>
			<td>Various, including Perkin-Elmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Caution: Radioactive material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01&#160;</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC805024</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SGI0001</td>
			<td>Cut into strips 0.5 cm wide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

항체의 탁월한 친화력, 특이도, 선택은 그들에게 종양을 대상으로 PET 방사성 의약품에 대한 매우 매력적인 벡터를 확인합니다. 으로 인해 여러 날 생물학적 반감기, 항체는 비교적 긴 물리적 붕괴 반감기 양전자 방출 방사성 핵종으로 표시해야합니다. 전통적으로, 양전자 방출 동위 원소 (124)는 I (t 1/2 = 4.18 D), (86) Y (t 1/2 = 14.7 시간), 64 구리 (t 1/2 = 12.7 시간)은 대한 항체를 라벨 사용되어왔다 PET 영상. 그러나 최근 필드는 항체 기반 PET 이미징 에이전트에 양전자 방출 방사성 89 ZR의 사용이 크게 증가를 목격 하였다. 그것이 물리적 반을 가지고 89 ZR은 면역 접합체와 PET 이미징에 대한 거의 이상적인 방사성 동위 원소 인 항체의 생체 내 약물 동태와 호환되며 상대적으로 낮은 에너지를 방출 - 생활 (t 1/2 = 78.4 시간)고해상도 이미지를 생성 RGY의 양전자. 또한, 항체는 노골적 시데로 포어 파생 킬레이트 desferrioxamine (DFO)를 사용하여 89 ZR으로 표시 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 전립선 특이 막 항원 표적 항체 J591은 예시 모델 시스템으로 사용한다 (1) 항체, (2) radiosynthesis 및 89 Zr-의 정제 - 이소 티오 시아 네이트 DFO 관능 킬레이트 바이오 콘쥬 게이션 암의 뮤린 모델 ZR-89-DFO 단클론 radioimmunoconjugate와-DFO 단클론 radioimmunoconjugate, 및 (3) 생체 내 PET 영상화.

이 프로토콜 항체 DFO-NCS의 공액의 첫 번째 단계는 일반적으로 매우 견고하고 신뢰할 수있다. 일반적으로, 정제, 킬레이트 변성 면역 접합체는&gt; 90 %의 수율로 얻을 수 있고, 초기의 접합 반응에서 DFO-NCS의 3 몰 당량을 사용하여 차수의 표지 약 1.0-1.5의 킬레이트 DFO의 수율 것이다 / 단클론 항체. 프로 시저의 89 ZR의 방사선 및 정제 단계는 마찬가지로 간단합니다. 위의 프로토콜에 설명 된 ?...

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

바이오 콘쥬 게이션과의 Radiosynthesis<sup&gt; 89</sup&gt; ZR-DFO 표지 항체

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

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16.9K 조회수.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

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Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

종이 접기 고취 패턴 및 재구성 입자의 자기 조립

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

연구

화학

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and cleaves intracellular proteins that are essential for neurotransmitter release. BoNT is comprised of a heavy chain (HC), which mediates host cell binding and internalization, and a light chain (LC), which cleaves intracellular host proteins essential for acetylcholine release. While therapies that inhibit toxin binding/internalization have a small time window of administration, compounds that target intracellular LC activity have a much larger time window of administrations, particularly relevant given the extremely long half-life of the toxin. In recent years, small molecules have been heavily analyzed as potential LC inhibitors based on their increased cellular permeability relative to larger therapeutics (peptides, aptamers, etc.). Lead identification often involves high-throughput screening (HTS), where large libraries of small molecules are screened based on their ability to modulate therapeutic target function. Here we describe a FRET-based assay with a commercial BoNT/A LC substrate and recombinant LC that can be automated for HTS of potential BoNT inhibitors. Moreover, we describe a manual technique that can be used for follow-up secondary screening, or for comparing the potency of several candidate compounds.

The botulinum neurotoxin type A light chain (BoNT/A LC) is a metalloprotease that enters motor neurons, cleaves its substrate SNAP-25, and disrupts neurotransmission, thereby resulting in flaccid paralysis. Utilizing a high-throughput-compatible FRET-based assay, large libraries of small molecules can be screened for their impact on BoNT/A LC enzymatic activity.

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

짧은 펩타이드의 자기 조립에 의해 주문 생체 고분자 구조의 형성

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

분할 및 풀 합성 펩타이드 급 아미드 도서관의 특성

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

단일 분자 힘 분광학을 사용하여 무기 재료와 아미노산 및 펩타이드의 상호 작용에 대한 통찰력

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential nutrients. The objective of this work is to demonstrate the qualitative and quantitative analysis of encapsulated fish oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR spectroscopy utilizing two different NMR instruments; a 500 MHz and an 850 MHz instrument. Both proton (1H) and carbon (13C) NMR spectra can be used for the quantitative determination of the major constituents of fish oil supplements. Quantification of the lipids in fish oil supplements is achieved through integration of the appropriate NMR signals in the relevant 1D spectra. Results obtained by 1H and 13C NMR are in good agreement with each other, despite the difference in resolution and sensitivity between the two nuclei and the two instruments. 1H NMR offers a more rapid analysis compared to 13C NMR, as the spectrum can be recorded in less than 1 min, in contrast to 13C NMR analysis, which lasts from 10 min to one hour. The 13C NMR spectrum, however, is much more informative. It can provide quantitative data for a greater number of individual fatty acids and can be used for determining the positional distribution of fatty acids on the glycerol backbone. Both nuclei can provide quantitative information in just one experiment without the need of purification or separation steps. The strength of the magnetic field mostly affects the 1H NMR spectra due to its lower resolution with respect to 13C NMR, however, even lower cost NMR instruments can be efficiently applied as a standard method by the food industry and quality control laboratories.

Here, high-resolution 1H and 13C Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy was used as a rapid and reliable tool for quantitative and qualitative analysis of encapsulated fish oil supplements.

생선 기름 보충제의 지질 프로필의 신속한 평가를위한 강력한 도구로 NMR 분광학

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

합성 및 올리고 peptoids의 질량 분석 분석

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...